本發(fā)明屬于土壤治理技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

治理土壤重金屬污染一直是國(guó)內(nèi)外面臨的巨大挑戰(zhàn)。植物修復(fù)因其低成本、無污染、不對(duì)土壤造成二次影響、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)在眾多的土壤重金屬修復(fù)技術(shù)中脫穎而出。然而用于植物修復(fù)的大部分超富集植物存在生物量小、生長(zhǎng)緩慢、對(duì)重金屬具有選擇性等缺點(diǎn)限制了植物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。

近年來，植物根際促生菌的深入研究為解決這一難題提供了新的思路。植物根際促生菌(PGPR)指生存于植物根際且有利于植物生長(zhǎng)的微生物的總稱。其中有一類能夠產(chǎn)鐵載體(Siderophore)的根際細(xì)菌，產(chǎn)生的鐵載體既能給植物提供鐵營(yíng)養(yǎng)，又能與其他重金屬結(jié)合，形成利于植物吸收的重金屬-鐵載體螯合物，增加植物對(duì)重金屬的富集和吸收，提高植物修復(fù)效率。產(chǎn)鐵載體細(xì)菌在植物修復(fù)中的作用主要體現(xiàn)為以下幾個(gè)方面：(1)為植物提供足量的鐵營(yíng)養(yǎng)，緩解植物因缺鐵引起的各種癥狀；(2)影響土壤中重金屬生物有效性，分泌一些有機(jī)酸和鐵載體直接或間接地活化土壤中的重金屬，提高其生物可利用性；(3)產(chǎn)生植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，如3-吲哚乙酸(IAA)、細(xì)胞分裂素和赤霉素等[6]，這些物質(zhì)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的同時(shí)也間接提高了其對(duì)重金屬的吸收；(4)協(xié)助植物獲得足量的營(yíng)養(yǎng)元素，如氮、磷、鉀等，以保證植物在逆境條件下的最佳生長(zhǎng)條件；(5)生防機(jī)制，通過搶占植物根系表面的有利生態(tài)位點(diǎn)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)(如鐵元素)；某些細(xì)菌還能通過產(chǎn)生抗生素的方式來抑制各種病原微生物的侵染。

中國(guó)專利文獻(xiàn)公開了一株新的巨大芽孢桿菌及其應(yīng)用[申請(qǐng)?zhí)枺?01610081336.4]，保藏號(hào)：CCTCC NO：M2016033的巨大芽孢桿菌JD4(Bacillus megaterium JD4)，菌體生長(zhǎng)快、酶系豐富，具有良好的產(chǎn)蛋白酶活力，其蛋白酶水解能力(Up)為83.60±4.84，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已報(bào)道的同種菌株，能夠高效降解有機(jī)物，在生物有機(jī)肥、飼料添加劑、水質(zhì)改良劑領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

目前，已有相當(dāng)一部分具有促生效果的細(xì)菌從土壤中分離得到，并應(yīng)用于重金屬污染土壤的微生物-植物聯(lián)合修復(fù)中。然而，在此過程中仍存在著兩個(gè)問題，一是大部分促生細(xì)菌并非從修復(fù)植物本身獲得，這可能造成菌株難以在植物體內(nèi)定殖，也有可能因引進(jìn)外來微生物資源對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境造成影響。二是多數(shù)研究只是尋求功能單一的促生細(xì)菌，而對(duì)于促生功能全面、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的土著促生細(xì)菌的報(bào)道相對(duì)較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問題，提供一種耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離方法及應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：一種耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離方法，其特征在于，取黑麥草植株，抖落黑麥草根系周圍的土壤后，剩下緊密附著在根系上的根際土壤，將根際土壤取下，加無菌水，震蕩后靜置，吸取上層土壤懸液，涂布于LB+2mg/L Cd²⁺的固體培養(yǎng)基平板上，恒溫倒置培養(yǎng)2-5d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落劃線純化，得到耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株。

在上述的耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離方法中，所述的根基土壤與無菌水的重量比為1:10，根基土壤加無菌水后，在150r/min振蕩30min后靜置10min，吸取上層土壤懸液，涂布于LB+2mg/L Cd2+的固體培養(yǎng)基平板上，25-30℃倒置培養(yǎng)3-4d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落劃線純化，得到耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株，-80℃及以下溫度保存。

在上述的耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離方法中，所述的根基土壤與無菌水的重量比為1:10，根基土壤加無菌水后，在150r/min振蕩30min后靜置10min，吸取上層土壤懸液1mL，10倍系列稀釋，依次制備若干不同稀釋度的懸液，各取100μL涂布于LB+2mg/L Cd2+的固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)3d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落劃線純化，得到耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株，-80℃及以下溫度保存。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株對(duì)提高鎘脅迫下黑麥草種子發(fā)芽率的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株對(duì)土壤溶磷的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株在土壤中產(chǎn)鐵載體的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株對(duì)植物促生的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株在鎘污染土壤的修復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株對(duì)土壤中鎘的活化的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株對(duì)土壤中銅的活化的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明直接從修復(fù)植物黑麥草根際土壤中篩選功能較為全面的細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定與生物學(xué)特性研究，可為植物修復(fù)技術(shù)的開發(fā)提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

2、多年生黑麥草(Lolium perenne L.)是禾本科中產(chǎn)量較高的一種牧草，被廣泛引種栽培，其具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、能耐受多種重金屬的毒害、生長(zhǎng)速度快、分蘗力強(qiáng)、生物量大等優(yōu)點(diǎn)，因此黑麥草十分適合用作重金屬污染植物修復(fù)材料。

3、本發(fā)明從黑麥草根際土壤中分離到鎘具有較強(qiáng)耐性的產(chǎn)鐵載體菌株，根據(jù)生理生化及分子鑒定實(shí)驗(yàn)將其鑒定為巨大芽孢桿菌(B.megaterum.)。該菌株屬于高產(chǎn)鐵載體細(xì)菌，同時(shí)具備多種植物促生特性，能夠分泌IAA，在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h后分泌IAA量達(dá)到26.5mg/L；在NBRIP培養(yǎng)液中，菌株對(duì)磷酸三鈣的轉(zhuǎn)化量達(dá)到96.3mg/L。在土壤中加入菌株的上清液能夠顯著提高其中鎘的生物有效性，且種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)表明，接種菌株能使在Cd²⁺脅迫下的黑麥草種子的發(fā)芽率明顯提高。綜合各項(xiàng)促生能力以及菌株表現(xiàn)出的良好環(huán)境耐受性和適應(yīng)性，可以發(fā)現(xiàn)菌株十分全面，在眾多的促生細(xì)菌里具備相當(dāng)?shù)母?jìng)爭(zhēng)力。

綜上，表明本發(fā)明分離得到的菌株具有良好的植物促生潛力及應(yīng)用于微生物-植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤的價(jià)值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的菌株LY02掃描電鏡細(xì)胞形態(tài)(11000×)。

圖2為本發(fā)明提供的菌株LY02基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖3為本發(fā)明提供的LY02菌懸液對(duì)不同濃度鎘脅迫黑麥草種子發(fā)芽率的影響。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所用的試劑，如無特殊說明，可以從常規(guī)生化試劑商店購買得到。以下實(shí)施例中的定量數(shù)據(jù)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

試驗(yàn)所需的試劑的制備方法如下：

(1)LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.0，121℃、20min高壓蒸汽滅菌；

(2)SMA培養(yǎng)基：蔗糖20.0g，L-天冬氨酸2.0g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，8-羥基喹啉，蒸餾水1000mL，pH 7.0，121℃、15min高壓蒸汽滅菌；

(3)無機(jī)磷培養(yǎng)基(NBRIP):葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，Ca₃(PO₄)₂ 5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0-7.5，121℃、15min高壓蒸汽滅菌；

(4)Salkowski’S顯色劑：150mL濃硫酸溶于250mL去離子水中，加入7.5mL 0.5mol L^-1的FeCl₃·6H₂O溶液；

(5)CAS檢測(cè)液：將0.079g CAS溶于50mL去離子水中，再加入10mL 1mmol L^-1FeCl₃溶液(用鹽酸配制)，得溶液A。將0.069g十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)溶于40mL的去離子水中，得溶液B。將A溶液沿?zé)诰従徏尤隑溶液中，攪拌混勻即得100mL CAS藍(lán)色檢測(cè)液；

(6)0.1mol L^-1磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)：Na₂HPO₄·12H₂O 2.427g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.5905g，KH₂PO₄ 0.075g，NH₄Cl 0.250g，NaCl 0.125g，去離子水100mL，使用時(shí)稀釋10倍。

實(shí)施例1

取選取長(zhǎng)勢(shì)較好的黑麥草植株，抖落黑麥草根系周圍的土壤后，剩下緊密附著在根系上的根際土壤，將根際土壤取下，裝于滅菌袋中備用，取適量根基土壤，加無菌水，震蕩后靜置，吸取上層土壤懸液，涂布于LB+2mg/L Cd²⁺的固體培養(yǎng)基平板上，恒溫倒置培養(yǎng)2-5d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落劃線純化，得到耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株。

優(yōu)選方案，根基土壤與無菌水的重量比為1:10，根基土壤加無菌水后，在150r/min振蕩30min后靜置10min，吸取上層土壤懸液，涂布于LB+2mg/L Cd2+的固體培養(yǎng)基平板上，25-30℃倒置培養(yǎng)3-4d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落劃線純化，得到耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株，-80℃及以下溫度保存。

實(shí)施例2

取選取長(zhǎng)勢(shì)較好的黑麥草植株，抖落黑麥草根系周圍的土壤后，剩下緊密附著在根系上的根際土壤，將根際土壤取下，裝于滅菌袋中備用，稱取根際土壤10g，裝入三角瓶中并加入100mL無菌蒸餾水，在150r/min振蕩30min后靜置10min，吸取上層土壤懸液1mL，該土壤懸液的稀釋度為10^-1，再用無菌蒸餾水10倍系列稀釋，依次制備10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀釋度的懸液，各取100μL涂布于LB+2mg/L Cd2+的固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)3d，其中土壤懸液的稀釋度為10^-1、10^-2和10^-6的單菌落生長(zhǎng)良好，分別挑取土壤懸液的稀釋度為10^-1、10^-2和10^-6生長(zhǎng)良好的單菌落劃線純化，得到三株耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株，分別命名為L(zhǎng)Y01、LY02和LY06，-80℃及以下溫度的冰箱保存。

對(duì)LY02進(jìn)行形態(tài)特征觀察、生理生化及分子鑒定。

形態(tài)特征觀察：利用掃描電鏡(飛納臺(tái)式掃描電鏡Pro)觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

生理生化測(cè)定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。

16S rDNA序列測(cè)定與同源性分析：將待測(cè)菌劃線至平板上，培養(yǎng)生成單菌落，用10uL槍頭挑起單菌落轉(zhuǎn)移至含有20μL ddH2O中，制備成菌懸液，用于提取菌株基因組總DNA。PCR引物為：正向引物8F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)，反向引物1513R(5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’)。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延長(zhǎng)90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)得的16S rDNA序列提交GenBank，與數(shù)據(jù)庫中的基因進(jìn)行比對(duì)，并用Mega5(采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)為1000)。

LY02菌株在LB平板上的菌落為乳白色，近圓形，邊緣規(guī)則，表面光滑，濕潤(rùn)，不透明。在11000倍掃描電鏡下觀察到的菌株形態(tài)為桿狀，產(chǎn)近球形芽孢(見圖1)

經(jīng)測(cè)定，LY02菌株的生理生化特性見表1。

表1菌株LY02的生理生化特性

注：+為陽性，－為陰性

利用PCR方法對(duì)LY02的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條約為1500bp的條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，將所獲得序列提交至Genbank數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示該菌株與B.megaterium的序列相似性最高，進(jìn)一步將該細(xì)菌的16S rDNA序列與其他相似性較高的菌株的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，結(jié)合生理生化試驗(yàn)，可推斷LY02為巨大芽孢桿菌(B.megaterium)。

應(yīng)用例1

本應(yīng)用例提供了一種以實(shí)施例1-2得到的耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株對(duì)提高鎘脅迫下黑麥草種子發(fā)芽率的應(yīng)用。

菌懸液的制備：將供試菌株活化，取50μL菌液接種于100mL的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、150r/min培養(yǎng)48h，6000r/min離心10min，棄上清液，再用無菌水沖洗菌體5遍，添加適量無菌水調(diào)整菌體濃度為10⁸cfu/mL，所得即為L(zhǎng)Y02菌懸液。在菌懸液中加入相應(yīng)的鎘溶液，使菌懸液中鎘質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10、15mg/L。

黑麥草種子用75％的酒精消毒3min，用無菌去離子水沖洗5遍。選取飽滿、均一的種子放置于墊了兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50顆，加入上述菌懸液5mL，在溫度為25℃，濕度為60％的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)萌發(fā)。發(fā)芽期間每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)(以長(zhǎng)出1cm的苗長(zhǎng)作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))，培養(yǎng)7d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。以加入等量的無菌水作為對(duì)照。重復(fù)三次。

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)的起點(diǎn)和關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)種子對(duì)外界環(huán)境的感知十分敏感。有研究表明，重金屬環(huán)境會(huì)使植物的很多萌發(fā)指標(biāo)如發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、胚芽、胚根等發(fā)生改變。其中發(fā)芽率可以非常直觀的體現(xiàn)出苗的好壞，農(nóng)業(yè)上通常根據(jù)發(fā)芽率來計(jì)算需要的種子量。黑麥草種子在添加了LY02菌懸液的不同濃度鎘脅迫環(huán)境中的發(fā)芽率如圖3所示。從圖3中可以看出，在Cd²⁺濃度為1mg/L條件下，黑麥草種子發(fā)芽率與對(duì)照相比，差異不顯著。隨著Cd²⁺濃度的增大，無論是否添加菌懸液，黑麥草發(fā)芽率均不斷降低，但添加菌懸液(實(shí)驗(yàn)組)的黑麥草發(fā)芽率降低緩慢，不添加菌懸液(對(duì)照組)的黑麥草發(fā)芽率降低迅速，對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組發(fā)芽率差異均為極顯著?？梢姡邼舛鹊腃d²⁺能夠抑制黑麥草種子的發(fā)芽率，但是經(jīng)LY02菌懸液處理后可以極顯著消除Cd²⁺對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用。

應(yīng)用例2

本應(yīng)用例提供了一種以實(shí)施例1-2得到的耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株對(duì)對(duì)植物促生的應(yīng)用。

鐵元素與磷元素皆為植物生長(zhǎng)的必需元素，然而土壤中的鐵與磷大部分都以難溶態(tài)的形式存在，植物很難直接利用。產(chǎn)鐵載體細(xì)菌能在缺鐵環(huán)境中合成對(duì)鐵離子具有極高親和力的鐵載體以螯合鐵離子形成螯合物，某些微生物能通過產(chǎn)酶或產(chǎn)酸等形式來溶解各種難溶性磷，顯著改善植物的磷素營(yíng)養(yǎng)；既滿足微生物自身對(duì)鐵營(yíng)養(yǎng)的需要，也能促進(jìn)植物對(duì)鐵離子的吸收利用，達(dá)到改善植物的鐵營(yíng)養(yǎng)的效果。IAA是植物生長(zhǎng)過程中十分重要的一種生長(zhǎng)激素，它能調(diào)控植物根、莖、葉的生長(zhǎng)，各組織的形成發(fā)育等。由微生物產(chǎn)生的IAA也能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，并調(diào)控植物體其他的生命活動(dòng)。

產(chǎn)IAA檢測(cè)：取含有L-色氨酸(100mg/L)的LB培養(yǎng)液50mL分裝于250mL的三角瓶中，將供試菌株接種于上述培養(yǎng)液中，搖床振蕩培養(yǎng)2d。取5mL菌液于離心管中，6000r/min離心10min后，取1mL上清液，加2mL Salkowski’S顯色劑，充分混合，黑暗條件下顯色30min，測(cè)定530nm波長(zhǎng)下吸光值，以未接種菌株的培養(yǎng)液為對(duì)照調(diào)零，每組三個(gè)重復(fù)。同法以濃度為5、10、15、20、30、40、50mg/L的IAA標(biāo)準(zhǔn)液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算培養(yǎng)液中IAA的濃度。

溶磷能力檢測(cè)：將供試菌株接種于NBRIP培養(yǎng)液中，28℃、150r/min培養(yǎng)7d，6000r/min離心10min后取上清液1mL，采用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中磷含量。以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照，重復(fù)三次。

產(chǎn)鐵載體能力檢測(cè)：

定性檢測(cè)：采用改進(jìn)的CAS平板覆蓋法檢測(cè)細(xì)菌產(chǎn)生鐵載體的能力。取50μL菌液點(diǎn)接于限鐵MSA培養(yǎng)基平板，置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。當(dāng)滅菌后的CAS檢測(cè)液冷卻至60℃左右時(shí)，將其緩緩倒入MSA限鐵培養(yǎng)基平板，放置1h觀察每個(gè)平板中菌落周圍顏色變化，每株菌三次重復(fù)。

定量檢測(cè)：吸取50μL菌液接入到MSA液體培養(yǎng)基，28℃、150r/min培養(yǎng)48h，10000r/min離心10min，取上清液3mL與等量CAS檢測(cè)液充分混勻，靜置1h，在630nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值(As)，并取雙蒸水作為對(duì)照調(diào)零，用相同方法測(cè)定未接菌株的各培養(yǎng)液的吸光值作為參比值(Ar)，重復(fù)三次，根據(jù)公式SU＝[(Ar-As)/Ar]×100％，計(jì)算鐵載體活性單位SU，SU的值越大，表明菌株產(chǎn)鐵載體能力越強(qiáng)。

本應(yīng)用例對(duì)以上LY01、LY02和LY06三株鎘耐性菌株的促生潛力進(jìn)行了應(yīng)用試驗(yàn)(參見表2)。發(fā)現(xiàn)三株菌都能合成鐵載體，其中LY02的鐵載體活性單位達(dá)到86.1％，屬于高產(chǎn)鐵載體細(xì)菌，三株細(xì)菌均可以產(chǎn)生IAA，LY02的IAA產(chǎn)量為26.5mg/L，顯著高于LY03的15.4mg/L。三株菌都具備一定的溶解無機(jī)磷能力，以LY02的溶磷性最強(qiáng)，達(dá)到了96.3mg/L，其次為L(zhǎng)Y03。從三株菌的促生特性可以發(fā)現(xiàn)LY02的促生潛力優(yōu)于另外兩株菌。

表2 LY01、LY02和LY06三個(gè)菌株的促生特性

鐵元素與磷元素皆為植物生長(zhǎng)的必需元素，然而土壤中的鐵與磷大部分都以難溶態(tài)的形式存在，植物很難直接利用。產(chǎn)鐵載體細(xì)菌能在缺鐵環(huán)境中合成對(duì)鐵離子具有極高親和力的鐵載體以螯合鐵離子形成螯合物，某些微生物能通過產(chǎn)酶或產(chǎn)酸等形式來溶解各種難溶性磷，顯著改善植物的磷素營(yíng)養(yǎng)；既滿足微生物自身對(duì)鐵營(yíng)養(yǎng)的需要，也能促進(jìn)植物對(duì)鐵離子的吸收利用，達(dá)到改善植物的鐵營(yíng)養(yǎng)的效果。IAA是植物生長(zhǎng)過程中十分重要的一種生長(zhǎng)激素，它能調(diào)控植物根、莖、葉的生長(zhǎng)，各組織的形成發(fā)育等。由微生物產(chǎn)生的IAA也能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，并調(diào)控植物體其他的生命活動(dòng)。

應(yīng)用例3

本應(yīng)用例提供了是實(shí)施例1-2得到的菌株對(duì)土壤中鎘的活化的應(yīng)用。

將待測(cè)菌株活化，取50μL菌液接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃，150r/min培養(yǎng)24h，6000r/min離心10min，取10mL上清液添加到5g受重金屬鎘污染的土樣中，充分混勻，重復(fù)3次，置于28℃下保濕培養(yǎng)7d后，將該土壤溶液6000r/min離心10min，用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES,PerkinElmer7000DV)檢測(cè)上清液中Cd的含量^[16]。以未接種的LB培養(yǎng)液為對(duì)照。重復(fù)三次。

許多微生物可通過自身的生命活動(dòng)或產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物影響重金屬形態(tài)，提高其生物可利用態(tài)。經(jīng)測(cè)定，產(chǎn)鐵載體菌株LY02的代謝產(chǎn)物對(duì)鎘、銅均具備一定的活化效果。在重金屬污染土壤中添加LY02的上清液后，土壤中的可溶性鎘含量達(dá)到6.5mg/kg，對(duì)照組的土壤中有效態(tài)Cd的含量則為4.2mg/kg，活化效果明顯。由于菌株LY02具備很強(qiáng)的產(chǎn)鐵載體能力，同時(shí)鐵載體又能吸附和轉(zhuǎn)化某些重金屬，使重金屬的生物有效性增加，因此推測(cè)菌株對(duì)鎘的活化效果很可能與其高產(chǎn)鐵載體的能力有關(guān)。土壤中重金屬的低生物有效性是限制植物修復(fù)技術(shù)發(fā)展的原因之一，而鐵載體能夠與多種重金屬螯合，實(shí)現(xiàn)不同重金屬形態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，提高其生物可利用性。

應(yīng)用例4

本應(yīng)用例提供了是實(shí)施例1-2得到的菌株在鎘污染土壤的修復(fù)中的應(yīng)用。

根據(jù)實(shí)施例2的方法，從黑麥草根際土壤中分離到1株對(duì)鎘具有較強(qiáng)耐性的產(chǎn)鐵載體細(xì)菌LY02，根據(jù)生理生化及分子鑒定實(shí)驗(yàn)將其鑒定為巨大芽孢桿菌(B.megaterum.)。LY02屬于高產(chǎn)鐵載體細(xì)菌，同時(shí)具備多種植物促生特性，能夠分泌IAA，在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h后分泌IAA量達(dá)到26.5_mg/L；在NBRIP培養(yǎng)液中，菌株對(duì)磷酸三鈣的轉(zhuǎn)化量達(dá)到96.3_mg/L。在土壤中加入LY02的上清液能夠顯著提高其中鎘的生物有效性，且種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)表明，接種LY02能使在Cd²⁺脅迫下的黑麥草種子的發(fā)芽率明顯提高。可以發(fā)現(xiàn)菌株LY02十分全面，在眾多的促生細(xì)菌里具備相當(dāng)?shù)母?jìng)爭(zhēng)力。綜上，表明菌株LY02具有良好的植物促生潛力及應(yīng)用于微生物-植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤的價(jià)值。

本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。