本發(fā)明提供了一種利用復(fù)合蛋白酶制備的抗氧化多肽，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

氧化是一個自由基介導(dǎo)的過程，它會對食品和生物系統(tǒng)造成許多不利的影響。在好氧器官內(nèi)，與動脈硬化、癌癥等多中疾病相關(guān)的游離自由基會不可避免地隨著氧代謝的過程而產(chǎn)生。在食品中，食品營養(yǎng)成分的氧化會產(chǎn)生過氧化物，其不僅會影響食品的營養(yǎng)價(jià)值，引起食品品質(zhì)下降，嚴(yán)重的甚至還會導(dǎo)致攝入者的身體發(fā)生疾病。因此，尋找安全的抗氧化劑以抑制過氧化物產(chǎn)生一直是生化營養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)。由于BHT、TBHQ等化學(xué)合成抗氧化劑比天然抗氧化劑具有更好的效果和更便宜的價(jià)格，因此其已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中。但是，目前有研究發(fā)現(xiàn)合成抗氧化劑對人體肝、脾、肺等器官具有蓄積性致癌作用，從而引起了人們對其安全性的擔(dān)憂，并且開始逐漸限制其在食品中的使用。于是人們把目光轉(zhuǎn)向天然抗氧化劑。α-生育酚是一種被最普遍使用的天然抗氧化劑，它能有效保持食品中油脂的穩(wěn)定性，但是卻不利于食品保存。因此，我們有必要尋找一種其它來源的安全的天然抗氧化劑。

多肽是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，使蛋白質(zhì)具有一定的生理功能。在人類的生命活動中，肽在體內(nèi)的消化吸收優(yōu)于游離的氨基酸，且有著區(qū)別于氨基酸的體內(nèi)輸送體系。某些短肽在提供人體生長、發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，還能夠防病治病，調(diào)節(jié)人體機(jī)能，這些具有生物活性的多肽被稱為生物活性肽。魚肉加工過程產(chǎn)生的下腳料浪費(fèi)等原因造成資源浪費(fèi)，甚至是環(huán)境污染。魚皮魚鱗中含有大量蛋白質(zhì)，且其組成均衡，利用現(xiàn)代生物技術(shù)對蛋白質(zhì)資源進(jìn)行深加工，合理的選用酶類等，通過工藝優(yōu)化將使得抗氧化活性肽的研究具有更廣闊的前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種利用復(fù)合蛋白酶制備的抗氧化多肽，使抗氧化活性得以高效實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種抗氧化多肽，所述抗氧化多肽的氨基酸序列為：FEVGPVCFL。

一種抗氧化多肽的制備方法，以魚皮魚鱗為原料提取蛋白，然后采用復(fù)合蛋白酶對其進(jìn)行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗氧化多肽。

所述酶解條件為：pH為8.0、溫度50℃、酶解時(shí)間為10 h、酶-底物配比為2800U/g；所述酶為復(fù)合蛋白酶。

所述分離純化的手段包括超濾、CM Sepharose C25離子交換色譜、Sephadex G-50分子篩和RP-HPLC反相高效液相色譜。

所述分離純化的具體步驟為：

（1）酶解產(chǎn)物首先利用膜過濾系統(tǒng)對魚皮魚鱗多肽溶液進(jìn)行超濾分離，利用分子量截留范圍不同的超濾膜對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到不同分子量的多肽，包括≥3000 Da、1500-3000 Da、≤1500 Da等組分；

（2）收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用CM Sepharose C25離子交換色譜進(jìn)行分離，上樣后洗去未吸附組分，再以含0～0.50mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0磷酸緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0.5ml/min，在215nm下進(jìn)行測量，測定各吸收峰對應(yīng)的洗脫組分的抗氧化活性；

（3）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50凝膠色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.5ml/min，在215nm下進(jìn)行測量，測定各吸收峰對應(yīng)的洗脫組分的抗氧化活性；

（4）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步的分離，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100μL，流速為1ml/min，檢測波長為215nm；洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至體積比為90%乙腈和10%水的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集體積比為44 %乙腈和56%水處的洗脫峰，得到本發(fā)明的高純度的抗氧化多肽；利用蛋白質(zhì)固相序列分析儀鑒定多肽的氨基酸序列。

本發(fā)明立足于尋找一種天然高效的抗氧化劑，以魚皮魚鱗蛋白為出發(fā)點(diǎn)，通過復(fù)合蛋白酶的切割條件控制，切割為具有特定的肽鏈長度和結(jié)構(gòu)域組成的活性多肽，而使抗氧化活性得以高效實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明改變了現(xiàn)有抗氧化劑的提取與運(yùn)用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化劑所可能引起的副作用，是一種天然抗氧化劑，可以取代傳統(tǒng)的合成抗氧化劑。并且本發(fā)明既可解決大量魚皮魚鱗資源的高效利用問題，又能解除消費(fèi)者對抗氧化劑在食品安全方面的顧慮，對科技、經(jīng)濟(jì)和食品工業(yè)的發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。

附圖說明

圖1為抗氧化多肽的RP-HPLC圖譜。

圖2為純化的抗氧化多肽清除DPPH自由基的“量-效”關(guān)系曲線。

圖3為純化的抗氧化多肽清除ABTS自由基的“量-效”關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

制備方法如下：

(1)魚皮魚鱗蛋白的提取

提取工藝條件為：

將魚皮魚鱗清洗3-5次，浸提pH為 7.0，提取溫度為40-80 ℃，料液比為1:4-1:8 （重量比），提取時(shí)間為3-6 h，離心10000g 20分鐘，收集上清液，經(jīng)過濾、濃縮和冷凍干燥后得到魚皮魚鱗蛋白。

(2)蛋白的酶解

酶購自上海生物試劑公司（中國·上海）。

采用復(fù)合蛋白酶酶解魚皮魚鱗蛋白，蛋白濃度為30mg/ml，酶解條件pH為8.0、溫度50℃、酶解時(shí)間為10 h、酶-底物配比為2800U/g；用2M NaOH調(diào)節(jié)pH穩(wěn)定，水解10h后，沸水浴中滅酶15min，然后迅速冷卻至室溫，置于離心機(jī)中，以8000r/min離心15min，取上清液備用。

（3）酶解產(chǎn)物的濃縮、除雜

利用納濾系統(tǒng)對蛋白酶解液進(jìn)行濃縮后，加入4倍體積乙醇沉降大分子蛋白質(zhì)，12000r/min離心20min得上清液即為魚皮魚鱗多肽溶液。

（4）酶解產(chǎn)物的分離

利用膜過濾系統(tǒng)對魚皮魚鱗多肽溶液進(jìn)行超濾分離，利用分子量截留范圍不同的超濾膜對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到不同分子量的多肽，包括≥3000 Da、1500-3000 Da、≤1500 Da等組分。

（5）酶解產(chǎn)物的純化

將得到的酶解產(chǎn)物分為3個分子量范圍不同的組分，分別為分子量大于3000Da的組分、分子量介于1500Da和3000Da的組分、分子量小于1500Da的組分；收集具有最佳抗氧化活性的組分，再經(jīng)過CM Sepharose C25離子交換色譜（長20cm，直徑1.6cm）進(jìn)行分離，以含0～0.50mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0磷酸緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0.5ml/min；收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50（長100cm，直徑2.6cm）凝膠色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.5ml/min，洗脫峰在215nm下進(jìn)行測量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行再進(jìn)一步的分離，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100μL，流速為1ml/min，檢測波長為215nm。洗脫液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液開始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集44 %乙腈和56 %水（v/v）處的洗脫峰，得到本發(fā)明的高純度的抗氧化多肽。

（6）抗氧化多肽的氨基酸序列測定

利用蛋白質(zhì)固相序列分析儀(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 測定本發(fā)明的抗氧化多肽的氨基酸全序列為FEVGPVCFL。

（7）抗氧化活性的測試

i.DPPH自由基清除能力的測定

利用DPPH（1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl）自由基清除率測定法研究抗氧化多肽。配制濃度為1×10^-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。將2mL、 0.1mM 的DPPH無水乙醇溶液加入到含有2mL不同酶解樣品的潔凈試管中，混勻。室溫下放置30min后，于517 nm處測定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越強(qiáng)。

清除率(%)=〔1- (A_i- A_j)/A₀〕×100%

式中，A₀為2 mL，0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2mL的樣品溶劑，空白對照；A_i為2mL，0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2mL的樣品；A_j為2mL的無水乙醇+2 mL的樣品。

2） ABTS自由基清除活性的測定

以去離子水將ABTS溶解，使ABTS濃度達(dá)到7mmol/L，加入過硫酸鉀，使過硫酸鉀的濃度為2.45 mmol/L。之后將該溶液在室溫下置于暗處過夜12～16h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液（PBS，0.2 mol/L，pH 7.4）稀釋，使其在734nm下的吸光值為0.70。取0.1ml酶解液與2.9ml ABTS自由基液混合，搖勻30s，暗處反應(yīng)10 min，然后在734nm下測定反應(yīng)液的吸光值。以蒸餾水代替水解液作空白。

清除率(%)= (A₀- A_j)/A₀×100%

式中，A₀為2.9 mL ABTS試劑與0.1 mL蒸餾水混合液的吸光值；A_j為2.9 mL ABTS試劑與0.1 mL酶解液混合液的吸光值。

為了進(jìn)一步了解本發(fā)明內(nèi)容、特點(diǎn)及功效，茲例舉以下實(shí)施例：

實(shí)施例1

稱取5.0克魚皮魚鱗蛋白用去離子水溶解并定容至250ml，然后用2mol/L NaOH將其pH調(diào)節(jié)至8.0。先將該溶液水浴加熱到50℃，接著再按照酶-底物配比為2800U/g的比例加入相應(yīng)量的酶，酶解時(shí)間為10 h。接著在沸水浴中滅酶15分鐘，冷卻后再8000rpm離心15分鐘。收集上清液備用。

將上清液利用膜過濾系統(tǒng)對魚皮魚鱗多肽溶液進(jìn)行超濾分離，利用分子量截留范圍不同的超濾膜對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到不同分子量的多肽，≥3000 Da、1500-3000 Da、≤1500 Da的組分，并測定其抗氧化活性。分子量小于1500Da的組分具有最好的抗氧化活性。

收集分子量小于1500Da的組分，用CM Sepharose C25離子交換色譜（長20cm，直徑1.6cm）進(jìn)行再進(jìn)一步的分離，以含0～0.50mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0磷酸緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0.5ml/min，洗脫峰在225nm下進(jìn)行測量，收集各峰并測定抗氧化活性。

將分離出來的抗氧化活性最明顯的組分峰用Sepadex G-50凝膠過濾色譜（長20cm，直徑1.6cm）再進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.5ml/min，洗脫峰在215nm下進(jìn)行測量。收集各峰并測定抗氧化活性。

將分離出來的最好的抗氧化活性組分利用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行再進(jìn)一步的分離，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100μL，流速為1ml/min，檢測波長為215nm。洗脫液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液開始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集44 %乙腈和56%水（v/v）處的洗脫峰，得到本發(fā)明的高純度的特異性抗氧化多肽，如圖1所示，S峰為該抗氧化多肽的色譜峰。得到高純度的抗氧化肽。

純化后的抗氧化多肽具有很強(qiáng)的抗氧化能力，由圖2、圖3可以看出，它具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力。

利用蛋白質(zhì)固相測序儀(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 測定純化后的抗氧化多肽的氨基酸序列。得到其氨基酸全序列為：FEVGPVCFL。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大學(xué)

<120> 一種利用復(fù)合蛋白酶制備的抗氧化多肽

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Phe Glu Val Gly Pro Val Cys Phe Leu

1 5