本發(fā)明屬于抗除草劑蛋白質(zhì)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗除草劑活性的油菜蛋白質(zhì)、其編碼基因及其應用。

背景技術(shù)：

油菜是我國四大主要油料作物之一(其他為大豆、花生、向日葵)，是我國播種面積最大，分布最廣的油料作物。

由于機械化直播油菜的推廣，雜草對油菜產(chǎn)量的影響越來越大。雜草的發(fā)生對油菜產(chǎn)量一般減產(chǎn)20％～30％，嚴重時達50％以上，最嚴重的田塊顆粒無收。油菜田中雜草種類復雜，一類是看麥娘、棒頭草等禾本科雜草，另一類是繁縷、豬殃殃等闊葉雜草。同時防除這兩類雜草涉及到除草劑混用問題。但是，混用除草劑需要的技術(shù)性非常強，由于除草劑具有高度選擇性和強烈殺傷力，稍有不慎容易造成藥害甚至毀壞作物。而種植抗除草劑油菜則可以避免這個問題。

油菜內(nèi)源的抗除草劑乙酰羥基酸合成酶(acetohydroxy acid synthase，簡稱AHAS)蛋白質(zhì)由ahas基因突變產(chǎn)生，表達抗除草劑AHAS蛋白質(zhì)可以使植物獲得抗除草劑特性，解決田塊中的雜草問題。AHAS蛋白質(zhì)主要分布在微生物和植物中，在動物中幾乎不存在，AHAS抑制除草劑對人畜無害。因此，發(fā)掘和研究具有抗除草劑活性的油菜AHAS蛋白質(zhì)具有良好的創(chuàng)新性和經(jīng)濟價值。

目前，培育抗AHAS抑制除草劑油菜的方法為以油菜種子或者植株為材料進行化學或者物理誘變，進行植物體內(nèi)基因組突變。這種方法獲得抗除草劑油菜的試驗時間長(大于3年)，獲得新突變體難(突變結(jié)果為核苷酸單個堿基變化引起單個氨基酸的替換，容易與已經(jīng)存在的突變重復)，而且成功幾率小(通常突變成功率小于百萬分之一)，很多實驗室進行超過5年的研發(fā)無法獲得新的突變體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗除草劑活性的油菜蛋白質(zhì)、其編碼基因及應用，其為抗多類型除草劑活性的油菜乙酰羥基酸合成酶(即AHAS)突變體蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶類等多類型除草劑的活性，其編碼基因轉(zhuǎn)化的植物具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶類等多類型除草劑的特性。

與目前通過體內(nèi)突變獲得的氨基酸替換突變體不同，本發(fā)明采用氨基酸刪除策略，通過基因體外突變，改造油菜AHAS蛋白質(zhì)，獲得油菜AHAS突變體蛋白質(zhì)，使其具有抗除草劑特性。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

具有抗除草劑活性的油菜蛋白質(zhì)，其為油菜AHAS突變體蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示。

本發(fā)明其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的抗除草劑活性的蛋白質(zhì)為前體全長蛋白質(zhì),該前體全長蛋白質(zhì)刪除信號肽后成為成熟蛋白質(zhì)，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

具有抗除草劑活性的基因，其為編碼所述具有抗除草劑活性的油菜蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

進一步，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示。

本發(fā)明所述具有抗除草劑活性的油菜蛋白質(zhì)用于培育抗咪唑啉酮類、磺酰脲類和嘧啶類除草劑植物。

一種獲得抗咪唑啉酮類、磺酰脲類和嘧啶類等多類型除草劑植物的方法，包括，將所述油菜AHAS突變體蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)化到植物中,使植物產(chǎn)生具有抗除草劑活性的油菜AHAS突變體蛋白質(zhì)。

進一步，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示。

進一步，所述咪唑啉酮類除草劑為咪唑乙煙酸、甲氧咪草煙或者甲基咪草煙，但不限于這幾種咪唑啉酮類除草劑。

又，所述磺酰脲類除草劑為氯磺隆、吡嘧磺隆、氯嘧磺隆、甲嘧磺隆，但不限于這幾種磺酰脲類除草劑。

優(yōu)選地，所述嘧啶類除草劑為雙草醚，但不限于這種嘧啶類除草劑。

進一步，所述植物為油菜、玉米或棉花，但不限于這幾種植物。

本發(fā)明抗除草劑活性的油菜蛋白質(zhì)，其為油菜中經(jīng)過人工改造的AHAS突變體蛋白質(zhì)，源于油菜中ahas1基因的表達，將油菜ahas1基因通過體外突變，獲得AHAS突變體蛋白質(zhì)，其氨基酸序列的特點為：與野生型油菜AHAS蛋白質(zhì)相比，缺失Trp559位點氨基酸，該突變體蛋白質(zhì)對咪唑啉酮類、磺酰脲類和嘧啶類等多類型除草劑具有抗性。

將本發(fā)明獲得的AHAS突變體蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)化到植物中，在植物中進行表達，使植物中含有油菜AHAS突變體蛋白質(zhì)，可使植物具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類和嘧啶羧酸類等多類型除草劑的特性。

本發(fā)明的油菜AHAS突變體蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列不限于油菜內(nèi)源序列，可以是表達所述蛋白質(zhì)的人工合成核苷酸序列。

在油菜、玉米或者棉花中表達油菜AHAS突變體，得到轉(zhuǎn)基因油菜R-RA1M5、轉(zhuǎn)基因玉米M-RA1M5、轉(zhuǎn)基因棉花C-RA1M5，在轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物苗期噴灑抗咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶羧酸類等多類型除草劑，野生型植物植株全部死亡，轉(zhuǎn)基因植物全部存活。說明表達本發(fā)明AHAS突變體蛋白質(zhì)的植物具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶羧酸類等多類型除草劑的特性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1)本發(fā)明采用氨基酸刪除策略，對氨基酸進行定點突變，可對刪除氨基酸后的突變體蛋白質(zhì)進行體外抗除草劑活性測定，為開發(fā)更多新型抗除草劑AHAS突變體蛋白質(zhì)提供基礎(chǔ)，具有操作簡單，篩選過程簡單、創(chuàng)新性強等優(yōu)點。

2)本發(fā)明的AHAS突變體蛋白質(zhì)是通過體外突變獲得的，體外突變具有可設計性強、試驗時間短、創(chuàng)新性強等體內(nèi)突變無法比擬的優(yōu)點，獲得突變體時間小于2個月，同時，通過特定的突變設計，避免與已報道AHAS突變體蛋白質(zhì)重復。

3)將本發(fā)明AHSA突變體蛋白質(zhì)的編碼基因表達后，獲得的AHAS全長突變體蛋白質(zhì)和AHAS無信號肽成熟突變體蛋白質(zhì)均具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類和嘧啶羧酸類等多類型除草劑的特性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中純化后的AHAS蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖；

其中，泳道1：純化后的RA1WS蛋白質(zhì)；泳道2：純化后的RA1M5S蛋白質(zhì)；Mk：蛋白質(zhì)Marker，分子量已在圖上標出。

圖2-圖3為本發(fā)明實施例2中RA1M5S及其對照RA1WS對咪唑啉酮類除草劑咪唑(乙煙酸和甲氧咪草煙)的抗性曲線圖。

圖4為本發(fā)明實施例2中RA1M5S及其對照RA1WS對嘧啶羧酸類除草劑(雙草醚)的抗性曲線圖。

圖5-圖8為本發(fā)明實施例2中RA1M5S及其對照RA1WS對磺酰脲類除草劑(氯磺隆、吡嘧磺隆、氯嘧磺隆、甲嘧磺隆)的抗性曲線圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

以下實施例中，如無特殊說明為《分子克隆實驗指南》(科學出版社，2002年)所記載方法。

引物合成和測序委托生工上海生物工程股份有限公司進行，試劑、菌株、載體等實驗用品從杭州西格瑪生物技術(shù)公司購買。

咪唑煙乙酸除草劑為山東先達公司的“豆說好”，稀釋濃度為稀釋200倍。甲基咪草煙除草劑為德國巴斯夫公司的“百壟通”，稀釋濃度為稀釋1000倍。甲氧咪草煙除草劑為美國氰胺公司的“金豆”，稀釋濃度為稀釋100倍。氯磺隆除草劑為江蘇省激素研究所股份有限公司的“氯磺隆”，稀釋濃度為稀釋20000倍。吡嘧磺隆除草劑為江蘇省激素研究所股份有限公司的原藥，稀釋濃度為稀釋2000倍。氯嘧磺隆除草劑為江蘇省激素研究所股份有限公司的原藥，稀釋濃度為稀釋5000倍。甲嘧磺隆除草劑為江蘇瑞邦農(nóng)藥廠的“森草凈”，稀釋濃度為稀釋5000倍。雙草醚除草劑為江蘇省激素研究所股份有限公司的“雙草醚”，稀釋濃度為稀釋1000倍。

實施例1獲得油菜AHAS突變體蛋白質(zhì)，包括以下步驟：

1.構(gòu)建刪除Trp559氨基酸的ahas1基因

(1)通過多聚合鏈式反應(PCR)的方法，從油菜因組中擴增出ahas1基因(NCBI序列號：Z11524)。

其中，進行PCR反應使用的引物為：

BN A1F：5’ctaaccatggcggcggcaacatcgtc；

BN A1EcoR：5’gaattctcagtacttagtgcgaccatcccctt。

PCR反應體系為：2×高保真聚合酶預混液50μl、引物BN A1F(10μM)4μl、引物BN A1EcoR(10μM)4μl、野生型油菜基因組DNA 1μl和去離子水41μl，總體積為100μl。

PCR程序：a)95℃，10分鐘；b)95℃，40秒；c)52℃，40秒；d)68℃，2分鐘；e)循環(huán)步驟2-4，25次；f)68℃，10分鐘；g)16℃，保存。

(2)通過瓊脂糖電泳分離、純化出步驟1)的PCR產(chǎn)物，即ahas1基因，將PCR產(chǎn)物進行T克隆(pGEMT，美國Promega公司)，獲得克隆T-RA1W。

(3)以T-RA1W為模板，使用引物BN A1559WF和BN A1559WR進行PCR反應，將PCR產(chǎn)物進行T克隆，獲得刪除Trp559氨基酸的突變體克隆T-RA1M5。

其中，PCR反應體系和程序中，除模板和引物外其它條件與步驟1)相同。

引物的具體序列為：

BN A1559WF：5’catcttgggatggtcatgcaagaagatcggttctacaaagct；

BN A1559WR：5’agctttgtagaaccgatcttcttgcatgaccatcccaagatg。

其中，RA1M5的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.表達、純化刪除信號肽的AHAS成熟蛋白質(zhì)

(1)以T-RA1W為模板，使用引物BN A1BamF和BN A1EcoR進行PCR反應，將PCR產(chǎn)物進行T克隆，獲得刪除信號肽的野生型T-RA1WS。

其中，PCR反應體系和程序中，除模板和引物外其它條件與上述步驟1(1)相同，引物的具體序列為：

BN A1BamF：5’ggatccacaatgactttcgtctcccgctacgctc；

BN A1EcoR：5’gaattctcagtacttagtgcgaccatcccctt。

(2)構(gòu)建蛋白質(zhì)表達載體，將RA1WS克隆入pGEX4T2(美國GE生命科學公司)，獲得表達無信號肽的AHAS野生型蛋白質(zhì)的載體4T2-RA1WS。

(3)將表達無信號肽的AHAS野生型蛋白質(zhì)的載體轉(zhuǎn)入表達菌株Rosetta中，培養(yǎng)、收獲細胞，超聲波破碎細胞，將離心獲得上清液通過GST柱，清洗GST柱，最終洗脫獲得成熟的野生型蛋白質(zhì)RA1WS。

同理，采用與上述步驟2(1)-2(3)同樣的方法，以刪除Trp559氨基酸的T-RA1M5基因為模板，以引物BN A1Bam和BN A1EcoR為引物，進行PCR反應、T克隆、構(gòu)建表達載體4T2-RA1M5S，將表達載體4T2-RA1M5S轉(zhuǎn)入表達菌株Rosetta中進行表達，獲得無信號肽而且刪除Trp559氨基酸的成熟AHAS突變體蛋白質(zhì)RA1M5S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

將獲得的野生型蛋白質(zhì)RA1WS和成熟的AHAS突變體蛋白質(zhì)RA1M5S進行SDS-PAGE電泳檢測，蛋白質(zhì)膠參見圖1。

由圖1可見，泳道1中的RA1WS和泳道2中的RA1M5S蛋白質(zhì)在90kDa位置具有明顯條帶，此位置與蛋白質(zhì)的理論大小相符。此外，該蛋白質(zhì)條帶在整個泳道的蛋白質(zhì)條帶中占主要比例，說明獲得了高純度的成熟油菜AHAS野生型蛋白質(zhì)和成熟的油菜AHAS突變體蛋白質(zhì)。

實施例2檢測AHAS突變體蛋白質(zhì)對除草劑的抗性

分別以實施例1獲得的野生型蛋白質(zhì)RA1WS和突變體蛋白質(zhì)RA1M5S為檢測主體，水為空白對照處理，以濃度在0-100μM的不同品種除草劑(咪唑煙乙酸、甲氧咪草煙、雙草醚、氯嘧磺隆、吡嘧磺隆、甲嘧磺隆)為影響因素，進行抗除草劑生物測定。

在2mL的離心管中配置溶液反應體系：450μl AHAS活性測定緩沖液，10μlAHAS蛋白質(zhì)(RA1WS或RA1M5S，0.5μg/μl)，40μl影響因素溶液(以水為空白對照處理)，總體積500μl。

AHAS活性測定緩沖液：100mM丙酮酸鈉，10mM氯化鎂，1mM TPP，50μM FAD，50mM磷酸鹽，pH7.4。

反應程序：將含有不同影響因素反應體系的離心管置于37℃反應1小時；20μl 30％硫酸終止反應。60℃反應0.5小時；加入250μl 1.7％α-萘酚，0.17％肌酸，60℃顯色0.5小時。從離心管中取出200μl，檢測含有不同影響因素的溶液在525nm吸光度值。

檢測結(jié)果：以除草劑濃度為0(影響因素溶液為水對照)的野生型蛋白質(zhì)RA1WS處理的525nm吸光度值為100％活性，計算野生型和突變體蛋白質(zhì)在不同影響因素條件下的活性比例，繪制曲線圖，結(jié)果參見圖2-圖8。

由圖2-圖8可見，隨著咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶羧酸類等多類型除草劑的增加，RA1WS活性降低至0；而RA1M5S活性在高濃度除草劑(氯磺隆和吡嘧磺隆除外)中依然保持接近100％活性，在高濃度氯磺隆中保持70％活性，在高濃度吡嘧磺隆中保持50％活性。因此，RA1M5S對咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶羧酸類等多類型除草劑具有抗性。

因此，本發(fā)明獲得的RA1M5S對咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶羧酸類等多類型除草劑具有抗性。

實施例3油菜ahas1突變體基因在植物中的轉(zhuǎn)化及表達

1.構(gòu)建AHAS突變體蛋白質(zhì)的表達元件

為了在單子葉和雙子葉植物中表達AHAS突變體蛋白質(zhì)，以pCambia1300載體(簡稱1300)為載體，用辣椒斑駁病毒35S(簡稱35S)啟動子和終止子構(gòu)建AHAS表達元件，其中，35S啟動子和終止子DNA序列見http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pCAMBIA1300/，具體步驟如下：

(1)以實施例1獲得的T-RA1M5為模板，使用引物BN A1BamF和BN A1SacR，通過PCR和BamH1/Sac1雙酶切，獲得ahas突變體片段RA1M5T；

其中，引物序列為：

BN A1BamF：5’ggatccacaatgactttcgtctcccgctacgctc；

BN A1SacR：5’gagctctcagtacttagtgcgaccatcccctt。

(2)以1300載體為模板，使用引物35S-Hind和35S-Bam，通過PCR和BamH1/Hind3雙酶切，獲得啟動子片段35S；

其中，引物序列為：

35S-Hind：5’gcgaagcttcatggagtcaaagattcaaa；

35S-Bam：5’gtgggatccagtcccccgtgttctctccaaatgaa。

(3)以1300載體為模板，使用引物ter-Sac和ter-Kpn，通過PCR和BamH1/Hind3雙酶切，獲得終止子片段ter；

其中，引物序列為：

ter-Sac：5’gtggagctcagtagatgccgaccg gatctgt；

ter-Kpn：5’cagggtacccgccgaattaattcggggga。

(4)將1300進行HindIII/SacI雙酶切，獲得片段1300HS，與35S和RA1M5T進行連接、克隆，獲得1300-35S-RA1M5。

(5)將1300-35S-RA1M5進行SacI/KpnI雙酶切，與ter連接、克隆，獲得表達油菜AHAS突變體的載體1300-RA1M5。

(6)將載體1300-RA1M5轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4044中，獲得表達AHAS突變體蛋白質(zhì)的植物轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。

2.獲得表達AHAS突變體蛋白質(zhì)的植物

轉(zhuǎn)基因植物的獲得方法為現(xiàn)有成熟技術(shù)，轉(zhuǎn)基因植物制備委托上海博祈生物科技有限公司進行。

使用農(nóng)桿菌介導法將載體1300-RA1M5分別轉(zhuǎn)入油菜、玉米和棉花中，獲得轉(zhuǎn)基因油菜R-RA1M5，轉(zhuǎn)基因玉米M-RA1M5、轉(zhuǎn)基因棉花C-RA1M5。

在獲得的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因油菜R-RA1M5、轉(zhuǎn)基因玉米M-RA1M5、轉(zhuǎn)基因棉花C-RA1M5和對應野生型植物的苗期噴除草劑，十天后，統(tǒng)計死亡率，結(jié)果參見表1。

表1

由表1可知，野生型植物植株全部死亡，而轉(zhuǎn)基因植物全部存活，說明表達本發(fā)明的油菜AHAS突變體蛋白質(zhì)的植物具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶羧酸類等多類型除草劑活性。

<110> 上海市農(nóng)業(yè)科學院

<120> 具有抗除草劑活性的油菜蛋白質(zhì)、其編碼基因及其應用

<130> 1711032

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> SEQ ID NO.1

<211> 654

<212> PRT

<213> 油菜（Brassica napus）

<400> 1

Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ile Ser Leu Thr Ala Lys Pro

1 5 10 15

Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser

20 25 30

Leu Thr Pro Gln Lys Asp Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile

35 40 45

Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Pro Ser Pro Glu

50 55 60

Lys Thr Asp Lys Asn Lys Thr Phe Val Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu

65 70 75 80

Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly

85 90 95

Val Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His

100 105 110

Gln Ala Leu Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His

115 120 125

Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly

130 135 140

Lys Pro Gly Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu

145 150 155 160

Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala

165 170 175

Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln

180 185 190

Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr

195 200 205

Leu Val Met Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe

210 215 220

Phe Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro

225 230 235 240

Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met

245 250 255

Arg Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser

260 265 270

Gln Leu Gly Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val

275 280 285

Leu Tyr Val Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg

290 295 300

Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu

305 310 315 320

Gly Ser Tyr Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met

325 330 335

His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu

340 345 350

Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu

355 360 365

Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala

370 375 380

Glu Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val

385 390 395 400

Lys Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu

405 410 415

Glu Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln

420 425 430

Lys Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro

435 440 445

Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala

450 455 460

Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe

465 470 475 480

Tyr Lys Tyr Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly

485 490 495

Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn

500 505 510

Pro Asp Ala Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met

515 520 525

Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys

530 535 540

Ile Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Glu Asp

545 550 555 560

Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala

565 570 575

Arg Glu Asn Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala Cys

580 585 590

Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala

595 600 605

Ile Gln Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile

610 615 620

Cys Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr

625 630 635 640

Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr

645 650 654

<210> SEQ ID NO.2

<211> 1965

<212> DNA

<213> 油菜（Brassica napus）

<400> 2

atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60

cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa agactcctcc 120

cgtctccacc gtcctctcgc catctccgcc gttctcaact cacccgtcaa tgtcgcacct 180

ccttcccctg aaaaaaccga caagaacaag actttcgtct cccgctacgc tcccgacgag 240

ccccgcaagg gtgctgatat cctcgtcgaa gccctcgagc gtcaaggcgt cgaaaccgtc 300

tttgcttatc ccggaggtgc ttccatggag atccaccaag ccttgactcg ctcctccacc 360

atccgtaacg tccttccccg tcacgaacaa ggaggagtct tcgccgccga gggttacgct 420

cgttcctccg gcaaaccggg aatctgcata gccacttcgg gtcccggagc taccaacctc 480

gtcagcgggt tagcagacgc gatgcttgac agtgttcctc ttgtcgccat tacaggacag 540

gtccctcgcc ggatgatcgg tactgacgcc ttccaagaga caccaatcgt tgaggtaacg 600

aggtctatta cgaaacataa ctatttggtg atggatgttg atgacatacc taggatcgtt 660

caagaagctt tctttctagc tacttccggt agacccggac cggttttggt tgatgttcct 720

aaggatattc agcagcagct tgcgattcct aactgggatc aacctatgcg cttacctggc 780

tacatgtcta ggttgcctca gcctccggaa gtttctcagt taggtcagat cgttaggttg 840

atctcggagt ctaagaggcc tgttttgtac gttggtggtg gaagcttgaa ctcgagtgaa 900

gaactgggga gatttgtcga gcttactggg atccccgttg cgagtacttt gatggggctt 960

ggctcttatc cttgtaacga tgagttgtcc ctgcagatgc ttggcatgca cgggactgtg 1020

tatgctaact acgctgtgga gcatagtgat ttgttgctgg cgtttggtgt taggtttgat 1080

gaccgtgtca cgggaaagct cgaggctttc gctagcaggg ctaaaattgt gcacatagac 1140

attgattctg ctgagattgg gaagaataag acacctcacg tgtctgtgtg tggtgatgta 1200

aagctggctt tgcaagggat gaacaaggtt cttgagaacc gggcggagga gctcaagctt 1260

gatttcggtg tttggaggag tgagttgagc gagcagaaac agaagttccc tttgagcttc 1320

aaaacgtttg gagaagccat tcctccgcag tacgcgattc agatcctcga cgagctaacc 1380

gaagggaagg caattatcag tactggtgtt ggacagcatc agatgtgggc ggcgcagttt 1440

tacaagtaca ggaagccgag acagtggctg tcgtcatcag gcctcggagc tatgggtttt 1500

ggacttcctg ctgcgattgg agcgtctgtg gcgaaccctg atgcgattgt tgtggatatt 1560

gacggtgatg gaagcttcat aatgaacgtt caagagctgg ccacaatccg tgtagagaat 1620

cttcctgtga agatactctt gttaaacaac cagcatcttg ggatggtcat gcaagaagat 1680

cggttctaca aagctaacag agctcacact tatctcgggg acccggcaag ggagaacgag 1740

atcttcccta acatgctgca gtttgcagga gcttgcggga ttccagctgc gagagtgacg 1800

aagaaagaag aactccgaga agctattcag acaatgctgg atacaccagg accatacctg 1860

ttggatgtga tatgtccgca ccaagaacat gtgttaccga tgatcccaag tggtggcact 1920

ttcaaagatg taataacaga aggggatggt cgcactaagt actga 1965

<210> SEQ ID NO.3

<211> 584

<212> PRT

<213> 油菜（Brassica napus）

<400> 3

Thr Phe Val Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp

1 5 10 15

Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val Glu Thr Val Phe Ala

20 25 30

Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser

35 40 45

Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe

50 55 60

Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly Ile Cys Ile

65 70 75 80

Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp

85 90 95

Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro

100 105 110

Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu

115 120 125

Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met Asp Val Asp

130 135 140

Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Thr Ser Gly

145 150 155 160

Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln

165 170 175

Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro Gly Tyr Met

180 185 190

Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser Gln Leu Gly Gln Ile Val

195 200 205

Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly

225 230 235 240

Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Cys Asn

245 250 255

Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg

275 280 285

Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala

290 295 300

Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys

305 310 315 320

Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly

325 330 335

Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys Leu Asp Phe

340 345 350

Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln Lys Gln Lys Phe Pro Leu

355 360 365

Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln

370 375 380

Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val

385 390 395 400

Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr Arg Lys Pro

405 410 415

Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu

420 425 430

Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala Ile Val Val

435 440 445

Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu Leu Ala

450 455 460

Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu Leu Asn Asn

465 470 475 480

Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn

485 490 495

Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu Asn Glu Ile Phe

500 505 510

Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala Cys Gly Ile Pro Ala Ala Arg

515 520 525

Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Gln Thr Met Leu Asp

530 535 540

Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Cys Pro His Gln Glu His

545 550 555 560

Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr Phe Lys Asp Val Ile Thr

565 570 575

Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr

580 584

<210> SEQ ID NO.4

<211> 1755

<212> DNA

<213> 油菜（Brassica napus）

<400> 4

actttcgtct cccgctacgc tcccgacgag ccccgcaagg gtgctgatat cctcgtcgaa 60

gccctcgagc gtcaaggcgt cgaaaccgtc tttgcttatc ccggaggtgc ttccatggag 120

atccaccaag ccttgactcg ctcctccacc atccgtaacg tccttccccg tcacgaacaa 180

ggaggagtct tcgccgccga gggttacgct cgttcctccg gcaaaccggg aatctgcata 240

gccacttcgg gtcccggagc taccaacctc gtcagcgggt tagcagacgc gatgcttgac 300

agtgttcctc ttgtcgccat tacaggacag gtccctcgcc ggatgatcgg tactgacgcc 360

ttccaagaga caccaatcgt tgaggtaacg aggtctatta cgaaacataa ctatttggtg 420

atggatgttg atgacatacc taggatcgtt caagaagctt tctttctagc tacttccggt 480

agacccggac cggttttggt tgatgttcct aaggatattc agcagcagct tgcgattcct 540

aactgggatc aacctatgcg cttacctggc tacatgtcta ggttgcctca gcctccggaa 600

gtttctcagt taggtcagat cgttaggttg atctcggagt ctaagaggcc tgttttgtac 660

gttggtggtg gaagcttgaa ctcgagtgaa gaactgggga gatttgtcga gcttactggg 720

atccccgttg cgagtacttt gatggggctt ggctcttatc cttgtaacga tgagttgtcc 780

ctgcagatgc ttggcatgca cgggactgtg tatgctaact acgctgtgga gcatagtgat 840

ttgttgctgg cgtttggtgt taggtttgat gaccgtgtca cgggaaagct cgaggctttc 900

gctagcaggg ctaaaattgt gcacatagac attgattctg ctgagattgg gaagaataag 960

acacctcacg tgtctgtgtg tggtgatgta aagctggctt tgcaagggat gaacaaggtt 1020

cttgagaacc gggcggagga gctcaagctt gatttcggtg tttggaggag tgagttgagc 1080

gagcagaaac agaagttccc tttgagcttc aaaacgtttg gagaagccat tcctccgcag 1140

tacgcgattc agatcctcga cgagctaacc gaagggaagg caattatcag tactggtgtt 1200

ggacagcatc agatgtgggc ggcgcagttt tacaagtaca ggaagccgag acagtggctg 1260

tcgtcatcag gcctcggagc tatgggtttt ggacttcctg ctgcgattgg agcgtctgtg 1320

gcgaaccctg atgcgattgt tgtggatatt gacggtgatg gaagcttcat aatgaacgtt 1380

caagagctgg ccacaatccg tgtagagaat cttcctgtga agatactctt gttaaacaac 1440

cagcatcttg ggatggtcat gcaagaagat cggttctaca aagctaacag agctcacact 1500

tatctcgggg acccggcaag ggagaacgag atcttcccta acatgctgca gtttgcagga 1560

gcttgcggga ttccagctgc gagagtgacg aagaaagaag aactccgaga agctattcag 1620

acaatgctgg atacaccagg accatacctg ttggatgtga tatgtccgca ccaagaacat 1680

gtgttaccga tgatcccaag tggtggcact ttcaaagatg taataacaga aggggatggt 1740

cgcactaagt actga 1755