本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種低污染的他克莫司粗品的制備方法。

背景技術(shù)：

他克莫司(fk506)是一種由鏈霉菌產(chǎn)生的新型23元大環(huán)內(nèi)酯聚酮類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的免疫抑制作用，其效力比應(yīng)用較廣的環(huán)孢霉素a(cyclosporina，csa)高近100倍，而毒副作用比環(huán)孢素更少，還具有低死亡率高移植存活率、移植成功率高、依賴性小等優(yōu)點。

他克莫司廣泛應(yīng)用于特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、銀屑病、紅斑狼瘡、扁平苔癬、白癜風(fēng)、nethenton綜合癥和抑制宿主病等自身免疫疾病的治療，目前臨床應(yīng)用于預(yù)防肝臟或腎臟移植術(shù)后的移植物排斥反應(yīng)，治療肝臟、胰腺、腎臟、心臟、肺等實體器官移植術(shù)后應(yīng)用其他免疫抑制藥物無法控制的移植物排斥反應(yīng)。

他克莫司來源于發(fā)酵產(chǎn)品，發(fā)酵過程同時也產(chǎn)生了多個他克莫司類似物，包括二氫他克莫司和子囊霉素等雜質(zhì)，為有效的分離提純他克莫司，國內(nèi)外已經(jīng)有學(xué)者進(jìn)行了一些列的研究：楊文革等介紹了一種他克莫司的純化工藝，采用菌絲體抽提、發(fā)酵液萃取、大孔樹脂層析、減壓蒸餾、硅膠柱層析及冷卻結(jié)晶技術(shù)得到他克莫司純品；溫耀明等人將他克莫司粗品使用有機(jī)溶劑溶解，通過制備型高速逆流色譜儀進(jìn)行連續(xù)純化并收集含他克莫司的主峰，然后將收集液接著依次進(jìn)行減壓濃縮、有機(jī)溶劑萃取、濃縮萃取液并重結(jié)晶以獲得產(chǎn)品。

可見受制于他克莫司發(fā)酵產(chǎn)物中成分復(fù)雜，雜質(zhì)較多等不利因素影響，目前的純化工藝基本都是發(fā)酵液經(jīng)過萃取、多次層析、蒸餾、結(jié)晶等，制備得到他克莫司成品。整個制備流程使用了大量的有機(jī)溶劑且工藝復(fù)雜、大多經(jīng)歷了萃取、濃縮等工序，能耗很高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種低污染的他克莫司粗品的制備方法，本發(fā)明具有處理量大、能耗低、有機(jī)溶劑用量少、適宜于連續(xù)生產(chǎn)的優(yōu)點。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

一種低污染的他克莫司粗品的制備方法，包括如下步驟：

(1)將他克莫司粗品溶液進(jìn)行一級超濾，所述一級超濾的截留分子量為10000da～60000da；

(2)經(jīng)步驟(1)處理后的溶液進(jìn)行二級超濾，所述二級超濾的截留分子量為3000da～10000da；

(3)經(jīng)步驟(1)處理后的溶液進(jìn)行納濾得濃縮液，納濾的截留分子量為100da～1000da，使用30%～40%的有機(jī)溶劑水溶液多次沖洗濃縮液，大批量制備得到他克莫司粗品；其中，30%～40%的有機(jī)溶劑水溶液總使用量為濃縮液的0.2～0.5倍體積。

步驟(1)所述的他克莫司粗品溶液可以是他克莫司發(fā)酵液經(jīng)初步離心后的上清液，也可以是他克莫司發(fā)酵液經(jīng)初步離心后，再經(jīng)過柱層析后的收集液粗品。

優(yōu)選地，所述一級超濾和二級超濾所使用的超濾膜材質(zhì)為陶瓷材質(zhì)、聚砜材質(zhì)或者聚醚砜材質(zhì)。

優(yōu)選地，所述一級超濾的截留分子量為10000da～20000da。

優(yōu)選地，所述二級超濾的截留分子量為3000da～5000da。

可以使用下列超濾膜中的任意一種：密理博公司（milliporeco.）的pelliconmodulebiomax、ultracel超濾膜、prostakmodule的pt、pl超濾膜、spiralwoundultrafiltrationmodule的pt、pl、helicon超濾膜、德國賽多利斯公司（sartoriusag）的satroconultrasart超濾膜、玻爾公司（pallco.）的omegatm、alphatm、regentm、suportm超濾膜、陶氏化學(xué)（dowchemicalco.）的filmtectm超濾膜、法瑪西亞公司（amershampharmacia）的kvicktm超濾膜。

優(yōu)選地，所述一級超濾和二級超濾是在壓力為0.01mpa～0.2mpa，溫度為0～60℃的條件下進(jìn)行。

更優(yōu)選地，所述一級超濾和二級超濾是在壓力為0.04mpa～0.08mpa，溫度為0～30℃的條件下進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述納濾膜的截留分子量為200da～500da。

優(yōu)選地，所述納濾采用的膜材質(zhì)為聚砜或者聚醚砜。可以使用ge的osmonics納濾膜、科氏（koch）公司的納濾膜、陶氏化學(xué)（dowchemicalco.）的納濾膜等。

優(yōu)選地，所述納濾是在操作溫度0～30℃，0～2.0mpa的進(jìn)口壓，0～1.8mpa的回流壓力下進(jìn)行。

優(yōu)選地，步驟(3)中所述有機(jī)溶劑的水溶液中的有機(jī)溶劑為丙酮、乙酸乙酯或甲醇；更優(yōu)選為丙酮。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明采用現(xiàn)代生化分離技術(shù)，提供一種低污染的他克莫司粗品的制備方法，替代現(xiàn)有工藝中的萃取、蒸餾等落后技術(shù)，具有方法工藝簡單、質(zhì)量可靠，收率高，能夠大量的制備他克莫司粗品等優(yōu)點，適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)藥用級他克莫司原料。

傳統(tǒng)的結(jié)晶法制備他克莫司粗品的過程中，一般需要加入占濃縮液2～8倍的有機(jī)溶劑進(jìn)行結(jié)晶；本發(fā)明中納濾過程中所用的有機(jī)溶劑的水溶液濃占濃縮液體積的0.2～0.5倍，因此，與結(jié)晶法相比，能夠極大的減少過程中有機(jī)溶劑的用量。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實施例1

取他克莫司的柱層析收集液10l，經(jīng)過60000da的一級超濾膜去除大分子雜質(zhì)，收集濾過液，經(jīng)過3000da的二級超濾膜再次去除雜質(zhì)，一級和二級超濾時控制操作溫度30℃，操作壓力0.04mpa，得到30l濾清液1。使用截留分子量為500da的納濾膜將上述濾清液1濃縮至2l，得到濃縮液1，使用30%的丙酮水溶液多次沖洗濃縮液1，多次沖洗時使用的30%的丙酮水溶液總體積為1l；納濾的操作溫度控制在30℃、操作壓力控制在1.5mpa的進(jìn)口壓及1.2mpa的回流壓力下進(jìn)行。經(jīng)過hplc檢測，濃縮液1純度95.3%，回收率為93.2%。

實施例2

取他克莫司的柱層析收集液10l，經(jīng)過20000da的一級超濾膜去除大分子雜質(zhì)，收集濾過液；經(jīng)過6000da的二級超濾膜再次去除雜質(zhì)，一級和二級超濾時控制操作溫度30℃，操作壓力0.04mpa，得到30l濾清液2。使用截留分子量為500da的納濾膜將上述濾清液2濃縮至2l，得到濃縮液2，使用30%的丙酮水溶液多次沖洗濃縮液2，多次沖洗時使用的30%的丙酮水溶液總體積為1l；納濾的操作溫度控制在30℃、操作壓力控制在1.5mpa的進(jìn)口壓及1.2mpa的回流壓力下進(jìn)行。經(jīng)過hplc檢測，濃縮液2純度為92.3%，回收率為92.6%。

實施例3

取他克莫司的柱層析收集液10l，經(jīng)過60000da的一級超濾膜去除大分子雜質(zhì)，收集濾過液，經(jīng)過3000da的二級超濾膜再次去除雜質(zhì)，一級和二級超濾時控制操作溫度50℃，操作壓力0.1mpa，得到30l濾清液3。使用截留分子量為500da的納濾膜將上述濾清液3濃縮至2l，得到濃縮液3，使用30%的丙酮水溶液多次沖洗濃縮液3，多次沖洗時使用的30%的丙酮水溶液總體積為1l。納濾的操作溫度控制在30℃、操作壓力控制在1.5mpa的進(jìn)口壓及1.2mpa的回流壓力下進(jìn)行。經(jīng)過hplc檢測，濃縮液3純度94.7%，回收率為91.2%。

實施例4

使用截留分子量為1000da的納濾膜將實施例1的濾清液1，實施例2的濾清液2，實施例3的濾清液3分別濃縮至2l，得到濃縮液4、5、6，使用30%的丙酮水溶液多次沖洗濃縮液4、5、6。納濾的操作溫度控制在30℃、操作壓力控制在1.5mpa的進(jìn)口壓及1.2mpa的回流壓力下進(jìn)行。經(jīng)過hplc檢測，濃縮液4純度95.7%，回收率為81.2%；濃縮液5純度為93.1%，回收率為82.2%；濃縮液6純度95.0%，回收率為73.2%。

實施例5

使用截留分子量為200da的納濾膜將實施例1的濾清液1，實施例2的濾清液2，實施例3的濾清液3分別濃縮至2l，得到濃縮液7、8、9，使用30%的丙酮水溶液多次沖洗濃縮液7、8、9。納濾的操作溫度控制在30℃、操作壓力控制在1.5mpa的進(jìn)口壓及1.2mpa的回流壓力下進(jìn)行。經(jīng)過hplc檢測，濃縮液7純度93.5%，回收率為95.1%；濃縮液8純度為92.8%，回收率為95.1%；濃縮液9純度93.1%，回收率為94.2%。

實施例6

他克莫司的發(fā)酵液經(jīng)初步離心后，收集上清液，取他克莫司的上清液10l，經(jīng)過40000da的一級超濾膜去除大分子雜質(zhì)，收集濾過液；經(jīng)過9000da的二級超濾膜再次去除雜質(zhì)，一級和二級超濾時控制操作溫度25℃，操作壓力0.08mpa，得到30l濾清液。使用截留分子量為300da的納濾膜將上述濾清液濃縮至2l，得到濃縮液，使用40%的甲醇水溶液多次沖洗濃縮液，多次沖洗時使用的40%的甲醇水溶液總體積為800ml；納濾的操作溫度控制在30℃、操作壓力控制在1.0mpa的進(jìn)口壓及0.8mpa的回流壓力下進(jìn)行。經(jīng)過hplc檢測，濃縮液純度為85.4%，回收率為72.1%。

實施例7

他克莫司的發(fā)酵液經(jīng)初步離心后，收集上清液，取他克莫司的上清液10l，經(jīng)過30000da的一級超濾膜去除大分子雜質(zhì)，收集濾過液；經(jīng)過5000da的二級超濾膜再次去除雜質(zhì)，一級和二級超濾時控制操作溫度35℃，操作壓力0.15mpa，得到30l濾清液。使用截留分子量為700da的納濾膜將上述濾清液濃縮至2l，得到濃縮液，使用40%的乙酸乙酯水溶液多次沖洗濃縮液，多次沖洗時使用的40%的乙酸乙酯水溶液總體積為600ml；納濾的操作溫度控制在30℃、操作壓力控制在1.5mpa的進(jìn)口壓及1.5mpa的回流壓力下進(jìn)行。經(jīng)過hplc檢測，濃縮液純度為88.7%，回收率為69.8%。

實施例8

他克莫司的發(fā)酵液經(jīng)初步離心后，收集上清液，取他克莫司的上清液10l，經(jīng)過20000da的一級超濾膜去除大分子雜質(zhì)，收集濾過液；經(jīng)過4000da的二級超濾膜再次去除雜質(zhì)，一級和二級超濾時控制操作溫度30℃，操作壓力0.05mpa，得到30l濾清液。使用截留分子量為200da的納濾膜將上述濾清液濃縮至2l，得到濃縮液，使用30%的甲醇水溶液多次沖洗濃縮液，多次沖洗時使用的30%的甲醇水溶液總體積為1l；納濾的操作溫度控制在30℃、操作壓力控制在2.0mpa的進(jìn)口壓及1.5mpa的回流壓力下進(jìn)行。經(jīng)過hplc檢測，濃縮液純度為90.1%，回收率為65.3%。