本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，涉及1株具有低產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)紅曲黃色素的基因重組紫色紅曲霉m-piy菌株及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：紅曲霉是我國重要的食用和藥用微生物，其發(fā)酵產(chǎn)生的主要次級代謝產(chǎn)物紅曲色素是一種重要的天然色素。紅曲色素安全性高、熱穩(wěn)定性強，對蛋白的著色性好不褪色，廣泛的應(yīng)用于食品加工、化妝品、保健品等行業(yè)。公認(rèn)的紅曲色素有6種，分為三種色調(diào)即橙色調(diào)、黃色調(diào)和紅色調(diào)。紅曲黃色素也是重要的食用色素，約占市場需求量的60％，市售食用黃色素產(chǎn)品以植物提取為主，相比之下，采用微生物發(fā)酵法進行天然食用黃色素的生產(chǎn)，不受季節(jié)限制、原料轉(zhuǎn)化率高、成本低，是目前世界食用色素添加劑的發(fā)展趨勢。目前工業(yè)上主要利用紅曲紅色素作為著色劑；而紅曲黃色素仍然處于研究階段，開發(fā)利用少、發(fā)酵產(chǎn)量低、發(fā)酵工藝復(fù)雜。因此，開發(fā)低產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)紅曲黃色素的基因重組菌株具有廣闊的應(yīng)用前景，可產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟效益。自blanc等(1995)研究發(fā)現(xiàn)某些紅曲霉菌株能產(chǎn)生對人體有害的真菌毒素—桔霉素(citrinin)以來，紅曲霉相關(guān)制品的安全性一直存在著爭議，從而影響到我國紅曲產(chǎn)品的出口。hajjaj等研究結(jié)果表明，桔霉素與紅曲色素同屬于聚酮類化合物，桔霉素與紅曲色素的合成開始于同一個途徑和共同的合成前體，紅曲霉色素相關(guān)基因的研究與基因工程菌株的開發(fā)有利于揭示桔霉素代謝途徑，從根本上降低桔霉素含量。王碩等(申請?zhí)枺?01510589619.5)利用基因工程手段將潮霉素抗性基因替代了桔霉素合成基因簇中加氧酶基因的開放閱讀框，獲得低產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)色素的紅曲霉基因工程菌株，該基因改造菌株與原始的野生株相比，桔霉素產(chǎn)量降低了96.48％，黃色素產(chǎn)量提高了89.9％(約6500u/g，吸收峰為410nm)，橙色素提高172.1％，紅色素提高140.6％。常見的紅曲霉菌株發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素基本上是紅曲紅色素、橙色素和黃色素的混合物，高效生產(chǎn)單一的紅曲黃色素的菌株鮮見報道。目前常見的提高紅曲黃色素產(chǎn)量的方法主要包括傳統(tǒng)的菌種選育、優(yōu)化發(fā)酵條件和改良提取工藝等。傳統(tǒng)的育種方法主要是通過物理方法(紫外照射)和化學(xué)方法(化學(xué)誘變劑如：硫酸二乙酯、氯化鋰、亞硝基胍)誘變提高黃色素產(chǎn)量，這種方法存在回復(fù)突變可能性，菌株易變異易退化，工業(yè)實際應(yīng)用中面臨很多挑戰(zhàn)。另外，僅僅依靠優(yōu)化發(fā)酵條件、改良提取工藝提高紅曲黃色素產(chǎn)量能力有限，因此急需在了解代謝途徑和關(guān)鍵編碼基因的基礎(chǔ)上，借助于基因工程技術(shù)對菌種進行定向改造。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供1種低產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)紅曲黃色素的基因重組紫色紅曲霉m-piy菌株、用途及其發(fā)酵生產(chǎn)方法。本發(fā)明所述的1種低產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)紅曲黃色素的基因重組紫色紅曲霉菌株命名為紫色紅曲霉m-piy，即monascuspurpureusm-piy，保藏于武漢大學(xué)菌種保藏中心，保藏地址為：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號：cctccno：m2016627，保藏日期：2016年11月9日。其基因組上存在的色素合成相關(guān)基因pige被敲除，由潮霉素基因hph基因序列所替代，因此該菌株含有外源潮霉素抗性。本發(fā)明所涉及的紫色紅曲霉m-piy菌株在yes液體培養(yǎng)基中發(fā)酵19d只產(chǎn)生紅曲黃色素，紅曲黃色素產(chǎn)量較野生型菌株提高了9.6倍，達到了9232.86u/g。另外，本發(fā)明提供的基因工程m-piy菌株較野生型菌株產(chǎn)桔霉素的發(fā)酵時間延遲，桔霉素含量顯著降低，發(fā)酵第7d才開始產(chǎn)生桔霉素，發(fā)酵第15d后桔霉素含量僅為0.31mg/l，是野生型菌株的0.22倍。本發(fā)明可為工業(yè)上紅曲霉菌種改良提供了新策略。本發(fā)明還提供了一種具有低產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)紅曲黃色素的基因重組紫色紅曲霉的制備方法。本發(fā)明所述的基因重組紫色紅曲霉的制備方法包括以下步驟：(1)從野生型菌株基因組dna中擴增目的基因pige上游臂和下游臂基因序列，從質(zhì)粒pkd1中擴增潮霉素抗性基因hph序列。(2)利用雙接頭(double-joint)pcr方法將pige上下游臂基因和hph基因三個基因片段連接，構(gòu)建敲除盒。(3)構(gòu)建基因敲除載體：kpnⅰ、xbaⅰ兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切敲除盒和質(zhì)粒pko1b，再用t4dna連接酶(ligase)連接。(4)將敲除載體轉(zhuǎn)入空載的根癌農(nóng)桿菌agl-1菌株，后利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化紅曲霉。(5)潮霉素抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子pcr驗證。附圖說明圖1基于同源重組的pige基因敲除原理圖。圖2敲除盒構(gòu)建相關(guān)pcr產(chǎn)物電泳圖譜；其中：m,dl5000；1,入突變菌株；pige基因上游同源臂；2,pige基因下游同源臂；3,潮霉素抗性基因；4,敲除盒基因片段。圖3pige基因敲除成功的缺失突變株pcr驗證電泳圖；其中：m,dl5000；1,野生型菌株；2,pige基因缺失突變株；3,t-dna插入突變菌株。圖4野生型菌株與m-piy菌株的菌落及顯微結(jié)構(gòu)特征圖。圖5野生型菌株與m-piy菌株的菌絲色素提取液全波長掃描圖譜。圖6野生型菌株與m-piy菌株菌絲黃色素色價圖。圖7野生型菌株與m-piy菌株發(fā)酵液桔霉素含量圖。保藏聲明紫色紅曲霉(monascuspurpureus)m-piy菌株，該保藏于武漢大學(xué)菌種保藏中心，保藏地址為：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號：cctccno：m2016627，保藏日期：2016年11月9日；其基因組上存在的色素合成相關(guān)基因pige被敲除，由潮霉素基因hph基因序列所替代。具體實施方式下面對本發(fā)明具體實施方式做一個詳細(xì)說明。實施例1：pige基因敲除載體的構(gòu)建：基于同源重組的pige基因敲除原理如圖1所示。(1)pige基因上下游臂和hph基因的擴增：利用genebank中公布的紅色紅曲霉(monascusruber)中pige基因序列(登錄號：kf285431.1)，設(shè)計兩對引物p1、p2和p3、p4分別擴增靶基因pige基因的翻譯起始區(qū)和終止密碼子區(qū)側(cè)翼序列，引物序列如表1所示，實驗結(jié)果如圖2所示。pige基因5’側(cè)翼序列和3’側(cè)翼序列pcr擴增體系如表2所示。pige基因5’側(cè)翼序列pcr反應(yīng)條件如下：98℃預(yù)變性4min，98℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)數(shù)為30個，72℃終延伸10min，12℃保存。pige基因3’側(cè)翼序列pcr反應(yīng)條件如下：98℃預(yù)變性4min，98℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)數(shù)為30個，72℃終延伸10min，12℃保存。表1敲除載體構(gòu)建中設(shè)計的引物注:p1和p2用于擴增pige基因上游臂，p3和p4用于擴增pige基因下游臂，加下劃線部分序列為hph基因部分序列。hph-f和hph-r用于從pcb1003載體中擴增hph基因。p1和p4用于進行三段連接反應(yīng)，雙下劃線部分分別為kpnⅰ和xbaⅰ酶切位點。表2pige基因5’側(cè)翼序列和3’側(cè)翼序列pcr擴增體系(2)double-jointpcr法連接pige基因上下游臂、hph基因：pige基因的5’側(cè)翼序列、3’側(cè)翼序列、hph基因序列加入pcr管中，進行兩輪pcr反應(yīng)。兩輪pcr反應(yīng)體系分別如表3、表4所示。第一輪pcr反應(yīng)條件如下：98℃預(yù)變性4min，98℃變性30s，55℃退火10min，72℃延伸4min，循環(huán)數(shù)為15個，72℃終延伸10min，12℃保存。第二輪pcr反應(yīng)條件如下:98℃預(yù)變性3min，98℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸3min，循環(huán)數(shù)為30個，72℃終延伸10min，12℃保存。表3第一輪pcr反應(yīng)體系反應(yīng)成分體積(μl)dntp2purifiedpige5,-flankingamplicon1purifiedpige3,-flankingamplicon1purifiedhphamplicon35×primestarbuffer5primestarhsdnapolymersae0.25ddh2oupto25表4第二輪pcr反應(yīng)體系反應(yīng)成分體積(μl)dntp4lapcrbuffer2lf1lr1template0.5lataqdnapolymersae0.2ddh2oupto25pige基因敲除盒和pko1b質(zhì)粒用xbaⅰ和kpnⅰ雙酶切，酶切后敲除盒用dna清潔試劑盒純化，pko1b質(zhì)粒酶切后跑電泳割膠回收，后用t4dnaligase連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌agl-1菌株，菌液pcr驗證，驗證敲除載體。實施例2：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化及敲除子的篩選1培養(yǎng)基pda培養(yǎng)基：馬鈴薯20％、葡萄糖2％、瓊脂粉2.0％、ph5.0～5.5。lb液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、nacl1％、ph7.0。im液體培養(yǎng)基：ph4.9，0.01mol/l的磷酸氫鉀緩沖液0.8ml，硫酸鎂-氯化鈉溶液20ml，1％cacl2·h2o溶液1ml，50％甘油溶液10ml，20％nh4no3溶液2.5ml，20％葡萄糖溶液10ml，補充蒸餾水至1000ml。使用時，每1ml培養(yǎng)基中加入0.01％feso410μl，100g/l2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)10μl和0.1mol/l乙酰丁香酮(as)4μl，混勻后馬上使用，用于農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)。co-im培養(yǎng)基：同im，但是20％葡萄糖溶液只加5ml。使用時，先將培養(yǎng)基熔化，待溫度稍降低后，每1ml培養(yǎng)基中加入0.01％feso410μl，100g/lmes10μl和0.1mol/las8μl，混勻后馬上使用，用于培養(yǎng)紅曲霉孢子和農(nóng)桿菌。2實驗方法2.1紅曲霉分生孢子懸浮液的制備將野生型紅曲霉菌株接種于pda培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)21d，后用5ml無菌水清洗培養(yǎng)平板，洗脫液經(jīng)4層擦鏡紙過濾，濾液即為紅曲霉孢子懸浮液。將紅曲霉孢子懸浮液離心后用無菌水重懸，血球計數(shù)板計數(shù)，配成濃度為105孢子/ml的紅曲霉分生孢子懸浮液。2.2根癌農(nóng)桿菌的活化與誘導(dǎo)培養(yǎng)將含有敲除載體的農(nóng)桿菌agl-1菌株在含有50μg/ml卡那霉素(kan)、50μg/ml利福平(rif)抗性的lb培養(yǎng)平板上劃線培養(yǎng)2d。后挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于2ml含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min搖床培養(yǎng)12-16h。培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌菌液離心棄上清，菌體沉淀用誘導(dǎo)培養(yǎng)基im(加入1ml100mg/lmes，1ml0.01％feso4，400μl0.1mol/las)稀釋，后28℃180r/min培養(yǎng)5-6h，至農(nóng)桿菌菌液od600＝0.5。2.3農(nóng)桿菌與紅曲霉孢子洗脫液共培養(yǎng)將制備的紅曲霉孢子懸浮液5000r/min離心10min，紅曲霉孢子用經(jīng)誘導(dǎo)活化培養(yǎng)獲得的農(nóng)桿菌菌液稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)稀釋至紅曲霉孢子懸浮液濃度為1×105個/ml。取上述紅曲霉孢子與農(nóng)桿菌混合液200μl涂布于硝酸纖維素膜上，后將硝酸纖維素膜貼于co-im培養(yǎng)基(加入1ml100mg/lmes，1ml0.01％feso4，800μl0.1mol/las)表面，28℃培養(yǎng)3d。2.4hph抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到pda選擇培養(yǎng)基上(50μg/ml潮霉素、500μg/ml頭孢霉素)，30℃培養(yǎng)7d，將長出來的單菌落轉(zhuǎn)接至含有50μg/ml潮霉素抗性的pda平板上培養(yǎng)，抗性平板上再次長出的轉(zhuǎn)化子接種于無抗的pda平板上30℃培養(yǎng)7d，保藏于25％的甘油中儲存于-80℃冰箱備用。2.5pcr驗證基因重組pige缺失突變株提取步驟2.4中保藏的紅曲霉轉(zhuǎn)化子菌株基因組dna，分別用引物hph-f/hph-r、pige-f/pig-r、p1/p4進行擴增，驗證基因重組pige缺失突變株，實驗結(jié)果如圖3所示。2.6基因重組pige缺失突變株菌落及顯微結(jié)構(gòu)特征經(jīng)篩選獲得了1株菌落色澤發(fā)生顯著變化的基因工程m-piy菌株。野生型菌株與m-piy菌株的菌落及顯微結(jié)構(gòu)特征如圖4所示。m-piy菌株除紅曲色素種類和產(chǎn)量發(fā)生變化外，m-piy菌株的生長速度、菌落、菌絲、分生孢子和閉囊殼等與野生型菌株沒有明顯差異。實施例3：pige基因缺失m-piy菌株黃色素色價及桔霉素含量的檢測1培養(yǎng)基pda培養(yǎng)基：馬鈴薯20％、葡萄糖2％、瓊脂粉2.0％、ph5.0～5.5。用于菌株活化培養(yǎng)。pd液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20％、葡萄糖2％、ph5.0～5.5。用于菌株種子培養(yǎng)。yes液體培養(yǎng)基：酵母提取物4％、蔗糖16％、ph5.5～6.0。用于菌株發(fā)酵培養(yǎng)。2實驗方法2.1m-piy菌株菌絲黃色素色價的檢測將保藏的紅曲霉野生型菌株和pige基因缺失m-piy菌株分別接種到pda培養(yǎng)基上，28℃活化培養(yǎng)7d。用打孔器取3個邊緣菌餅(直徑8mm)轉(zhuǎn)接到裝有100mlpd培養(yǎng)液的250ml三角瓶中，28℃、180r/min搖床上培養(yǎng)3d用作種子液。再將種子液按10％轉(zhuǎn)接到y(tǒng)es液體培養(yǎng)基中(250ml三角瓶裝100ml)、28℃、180r/min搖床上分別培養(yǎng)5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d、19d，取樣檢測不同培養(yǎng)天數(shù)下紅曲霉野生型菌株與m-piy菌株菌絲黃色素的色價。稱取0.05g紅曲霉干菌絲，加入4ml70％乙醇，漩渦震蕩，60℃溫育1h，12000rpm離心10min，取上清液測其在300nm-600nm處全波長掃描圖譜，用分光光度計檢測od值(410nm、370nm)并計算黃色素色價。黃色素色價計算公式：黃色素色價＝吸收峰處od值×稀釋倍數(shù)×20u/g2.2紅曲霉發(fā)酵液桔霉素含量的檢測培養(yǎng)方法同2.1。分別取不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液(包括菌絲)1ml放入5ml的離心管中，加入等體積的甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7:3:1)，劇烈震蕩混勻，12000r/min離心10min，取上清液。采用高效液相色譜(hplc)法檢測桔霉素含量，色譜條件是：agilentc18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相是乙腈(a):酸水(b，磷酸調(diào)節(jié)ph2.5)＝75:25；λ＝331nm、流速1ml/min、柱溫30℃、進樣體積20μl。3實驗結(jié)果3.1m-piy菌株色素提取液掃描圖譜野生型菌株和m-piy菌株菌絲色素提取液300nm-600nm波長掃描圖譜見圖5，m-piy菌株菌絲色素提取液只有一個吸收峰，吸收峰為370nm左右；而野生型菌株菌絲色素提取液有2個吸收峰，吸收峰分別為410nm和520nm左右。3.2m-piy菌株菌絲紅曲黃色素的色價野生型菌株和m-piy菌株菌絲色素提取液黃色素色價見圖6。m-piy菌株只產(chǎn)生紅曲黃色素，紅曲黃色素產(chǎn)量較野生型菌株提高了約9.6倍，達到了9232.86u/g，而野生型菌株紅曲黃色素產(chǎn)量僅為958.23u/g。3.3m-piy菌株發(fā)酵液桔霉素的含量野生型菌株和m-piy菌株發(fā)酵液桔霉素含量檢測結(jié)果見圖7。m-piy菌株產(chǎn)桔霉素的發(fā)酵時間較原始野生型菌株延長，桔霉素含量顯著降低，發(fā)酵7d后才開始產(chǎn)生桔霉素，發(fā)酵15d后桔霉素含量僅為0.31mg/l，是野生型菌株的0.22倍。<110>浙江師范大學(xué)<120>低產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)紅曲黃色素的基因重組紫色紅曲霉m-piy菌株及其制備方法和用途<160>8<210>1<211>34<212>dna<213>人工序列<400>1ggggtacccccgacagcatctcccgtgttgaagt34<210>2<211>46<212>dna<213>人工序列<400>2gctccttcaatatcatcttctctcgctttctttggtcggagttatc46<210>3<211>45<212>dna<213>人工序列<400>3tagagtagatgccgaccgaacaagaggaatccagtttcattagag45<210>4<211>35<212>dna<213>人工序列<400>4gctctagagctctggcagtattttcgcttttccgc35<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列<400>5cgagagaagatgatattgaaggagc25<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列<400>6tcttgttcggtcggcatctactcta25<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7aaagcacatctaggatttatag22<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8attaatcttctggtcaatgcgaat23當(dāng)前第1頁12