本發(fā)明屬于中藥提取領(lǐng)域，尤其涉及一種從甘草廢渣中快速提取甘草素的方法。

背景技術(shù)：

甘草為豆科甘草屬植物，其根莖是常用的中草藥和經(jīng)濟(jì)植物。甘草中含有大量活性成分，具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗?jié)?、抗hiv病毒、抗sars病毒、抗氧化和抗癌等藥理活性；從甘草中提取活性成分甘草酸等萜類產(chǎn)品后，剩余物中主要含有黃酮類化合物，早期作為廢渣丟棄。近年來，隨著對(duì)中藥的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)黃酮類成分也具有重要的藥理作用，而甘草黃酮類化合物中主要的活性成分有甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素等。

甘草素是甘草苷的苷元，為白色針狀晶體，分子式為c15h12o4，分子量256.25。據(jù)研究報(bào)道，甘草中甘草苷含量約為3.6%，而甘草素的含量僅為0.1%左右，有些甘草甚至檢測不出該成分，從甘草中直接分離提取高純度的甘草素十分困難，并且現(xiàn)有技術(shù)中公開的提取方法，均存在提取率較低的問題。例如，中國專利cn102112142a，用于提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法，是先用水或有機(jī)溶劑提取，配合酸水解提高甘草素含量，不僅提取效率低，而且產(chǎn)物中甘草素的含量較低；中國專利cn102391232b，從甘草中提取甘草素，使用聚酰胺和大孔樹脂的混合柱，在一定程度上提高了甘草素的純度，但純化后需經(jīng)兩次8小時(shí)的析晶過程，才能得到甘草素產(chǎn)品，該操作過程比較繁瑣，對(duì)工藝參數(shù)要求比較嚴(yán)格，不易控制。

綜上所述，研究一種可以高效率提取甘草素的提取方法，對(duì)于其藥物應(yīng)用十分有必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供從甘草廢渣中快速提取甘草素的方法，該方法操作簡單、環(huán)保無污染、得到的產(chǎn)品純度高。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的從甘草廢渣中快速提取甘草素的方法，包括以下步驟。

步驟1、以堿提酸沉法提取甘草酸后的剩余廢渣為原料，加入5-10倍體積的蒸餾水，混合均勻后，90℃條件下超聲提取2小時(shí)；降溫至50-60℃后加入原料重量的2-5%的纖維素酶酶解。

步驟2、將酶解液真空抽濾，取濾渣重復(fù)步驟1操作兩次，將酶解液真空抽濾；合并三次抽濾得到的濾液，濃縮至干后，用1-2倍體積的95%乙醇溶解兩次，得到濃縮液。

步驟3、將濃縮液注射于cheetah中高壓快速制備液相色譜柱，該制備液相色譜配有二元溶劑混合系統(tǒng)、監(jiān)測系統(tǒng)和餾分自動(dòng)收集系統(tǒng)，可在不超過10mpa壓力下操作，洗脫流速設(shè)定范圍為0-100ml/min；本發(fā)明所用色譜柱內(nèi)填充ywgc18和mci混合固定相，進(jìn)樣體積為3.5-7ml，設(shè)定制備色譜儀的檢測波長為276nm，洗脫流速5ml/min，洗脫流動(dòng)相為30%-70%乙醇溶劑，每20分鐘自動(dòng)收集一個(gè)餾分，將通過分析色譜檢測含甘草素濃度最大的餾分及前、后兩側(cè)共三個(gè)餾分合并，減壓濃縮在60℃下干燥30min-1h后，得到高純度甘草素產(chǎn)品。

所述步驟1中酶解得溫度為50-60℃，酶解時(shí)間為4小時(shí)。

所述步驟2中濃縮為真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮溫度為60℃。

所述步驟3中色譜柱的規(guī)格為40g，結(jié)構(gòu)為上粗下細(xì)臺(tái)柱型結(jié)構(gòu)；所述的ywgc18和mci混合固定相為兩種填料順序填充至色譜柱，體積比為1:2-4，其中ywgc18填料的顆粒粒徑為15μm，mci顆粒粒徑為10μm。

所述的順序填充是指先填充ywgc18固定相，再填充mci固定相，且兩種固定相的體積比為1:2或1:3或1:4。

本發(fā)明的有益效果。

本發(fā)明從提取甘草酸剩余廢渣中提取甘草素，不僅避免了原料資源的浪費(fèi)，而且甘草總黃酮得到了富集，更有利于利用酶解和色譜分離方法，得到更多具有更高純度的甘草素產(chǎn)品；本發(fā)明使用堿提酸沉法提取甘草酸后的剩余廢渣為原料，提高了甘草資源的利用率，堿提酸沉法提取甘草酸及萜類等比較徹底，得到的總黃酮含量更高，也更利于制備甘草素，并且如前所述從甘草中直接分離提取高純度的甘草素十分困難，如果直接以甘草為原料進(jìn)行提取，雜質(zhì)含量過高，色譜分離中容易產(chǎn)生過載效應(yīng)和譜峰重疊現(xiàn)象，很難得到具有一定質(zhì)量和較高純度的甘草素產(chǎn)品；提取和制備過程中使用水-乙醇為溶劑，并且嚴(yán)格控制乙醇的用量，避免了諸如甲醇、三氯甲烷等毒性有機(jī)試劑的應(yīng)用，工藝綠色，無有機(jī)溶劑殘留，屬于環(huán)保型提取方法；本發(fā)明采用纖維素酶對(duì)原料進(jìn)行酶解，使得甘草總黃酮中的苷類水解生成苷元甘草素，因而甘草素含量大大提高，從原料含量的3%提高到30%，降低了甘草素分離純化的難度。

本發(fā)明在提取過程中在cheetah中高壓快速純化制備色譜儀器，采用成熟的工業(yè)部件，全自動(dòng)的軟件控制，操作人員只需要輸入建立的方法，系統(tǒng)自動(dòng)實(shí)現(xiàn)從溶劑注入到餾分收集，制備過程自動(dòng)化程度高，直接提高了提取效率。

本發(fā)明經(jīng)快速制備得到的甘草素產(chǎn)品純度高（90%-100%），最高可制得甘草素純品。色譜柱采用順序混合制備填料，相比完全采用c18固定相，生產(chǎn)成本降低了1/3，甘草素的純度提高了近1.2倍；而相比兩種填料完全混合后填充色譜柱再進(jìn)行分離純化，甘草素的純度提高超過1.5倍，同時(shí)該工藝簡單，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1。

取100g提取甘草酸后的剩余廢渣原料，加入5倍量蒸餾水，混勻，90℃超聲提取2小時(shí)，降溫至50℃，加入5%重量的纖維素酶酶解，酶解4小時(shí)。將酶解液真空抽濾，濾渣重復(fù)上述操作兩次，合并濾液，在60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液4ml注射入cheetah制備色譜儀的色譜柱端口，色譜柱內(nèi)固定相是順序填充的體積比為1:4的ywgc18和mci混合填料。設(shè)定制備檢測波長為276nm，流動(dòng)相流速5ml/min，用30%乙醇水流動(dòng)相洗脫，收集目標(biāo)餾分，在60℃下減壓濃縮得純化后甘草素產(chǎn)品。甘草素純度為95.4%。

實(shí)施例2。

取100g提取甘草酸后的剩余廢渣原料，加入6倍量蒸餾水，混勻，90℃超聲提取2小時(shí)，降溫至50℃，加入5%重量的纖維素酶酶解，酶解4小時(shí)。將酶解液真空抽濾，濾渣重復(fù)上述操作兩次，合并濾液，在60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液4ml注射入cheetah制備色譜儀的色譜柱端口，色譜柱內(nèi)固定相是順序填充的體積比為1:4的ywgc18和mci混合填料。設(shè)定制備檢測波長為276nm，流動(dòng)相流速5ml/min，用45%乙醇水流動(dòng)相洗脫，收集目標(biāo)餾分，在60℃下減壓濃縮得純化后甘草素產(chǎn)品。甘草素純度為92.1%。

實(shí)施例3。

取100g提取甘草酸后的剩余廢渣原料，加入5倍量蒸餾水，混勻，90℃超聲提取2小時(shí)，降溫至50℃，加入5%重量的纖維素酶酶解，酶解4小時(shí)。將酶解液真空抽濾，濾渣重復(fù)上述操作兩次，合并濾液，在60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液3.5ml注射入cheetah制備色譜儀的色譜柱端口，色譜柱內(nèi)固定相是順序填充的體積比為1:2的ywgc18和mci混合填料。設(shè)定制備檢測波長為276nm，流動(dòng)相流速5ml/min，用30%乙醇水流動(dòng)相洗脫，收集目標(biāo)餾分，在60℃下減壓濃縮得純化后甘草素產(chǎn)品。甘草素純度為89.4%。

實(shí)施例4。

取100g提取甘草酸后的剩余廢渣原料，加入5倍量蒸餾水，混勻，90℃超聲提取2小時(shí)，降溫至50℃，加入5%重量的纖維素酶酶解，酶解4小時(shí)。將酶解液真空抽濾，濾渣重復(fù)上述操作兩次，合并濾液，在60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液7ml注射入cheetah制備色譜儀的色譜柱端口，色譜柱內(nèi)固定相是順序填充的體積比為1:2的ywgc18和mci混合填料。設(shè)定制備檢測波長為276nm，流動(dòng)相流速5ml/min，用45%乙醇水流動(dòng)相洗脫30min后換70%乙醇水流動(dòng)相繼續(xù)洗脫，收集目標(biāo)餾分，在60℃下減壓濃縮得純化后甘草素產(chǎn)品。甘草素純度為100%。

對(duì)比例。

實(shí)施例5。

取100g提取甘草酸后的剩余廢渣原料，加入5倍量蒸餾水，混勻，90℃超聲提取2小時(shí)，降溫至50℃，加入5%重量的纖維素酶酶解，酶解4小時(shí)。將酶解液真空抽濾，濾渣重復(fù)上述操作兩次，合并濾液，在60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液4ml注射入cheetah制備色譜儀的色譜柱端口，色譜柱內(nèi)固定相是ywgc18填料。設(shè)定制備檢測波長為276nm，流動(dòng)相流速5ml/min，用40%乙醇水流動(dòng)相洗脫，收集目標(biāo)餾分，在60℃下減壓濃縮得純化后甘草素產(chǎn)品。甘草素純度為77%。

實(shí)施例6。

取100g提取甘草酸后的剩余廢渣原料，加入5倍量蒸餾水，混勻，90℃超聲提取2小時(shí)，降溫至50℃，加入5%重量的纖維素酶酶解，酶解4小時(shí)。將酶解液真空抽濾，濾渣重復(fù)上述操作兩次，合并濾液，在60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液3ml注射入cheetah制備色譜儀的色譜柱端口，色譜柱內(nèi)固定相是正相硅膠填料（40μm）。設(shè)定制備檢測波長為276nm，流動(dòng)相流速3ml/min，用體積比為1:1的正己烷-乙醇流動(dòng)相洗脫，收集目標(biāo)餾分，在60℃下減壓濃縮得純化后甘草素產(chǎn)品。甘草素純度為39%。

實(shí)施例7。

取100g提取甘草酸后的剩余廢渣原料，加入5倍量蒸餾水，混勻，90℃超聲提取2小時(shí)，降溫至50℃，加入5%重量的纖維素酶酶解，酶解4小時(shí)。將酶解液真空抽濾，濾渣重復(fù)上述操作兩次，合并濾液，在60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液3.5ml注射入cheetah制備色譜儀的色譜柱端口，色譜柱內(nèi)固定相是體積比1:2的ywgc18和mci完全混合后填充而成。設(shè)定制備檢測波長為276nm，流動(dòng)相流速5ml/min，用45%乙醇作為流動(dòng)相洗脫，收集目標(biāo)餾分，在60℃下減壓濃縮得純化后甘草素產(chǎn)品。甘草素純度為59%。

由上述7個(gè)實(shí)施例可以看出：采用正相硅膠填料分離純化甘草素，效果較差；完全采用ywgc18固定相分離純化甘草素不僅成本高，且分離純化效果一般；將ywgc18和mci兩種填料完全混合后用其分離甘草素，效果也較差；而將ywgc18和mci兩種填料按一定次序和比例進(jìn)行混合，填充于色譜柱中，再進(jìn)行甘草素的分離純化則可獲得較佳的分離效果，甚至得到100%純度的甘草素產(chǎn)品。

上述實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定，凡在本發(fā)明的范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。