本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種壁蛻膜組織凍存、復(fù)蘇及分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的方法。
背景技術(shù)：
隨著再生醫(yī)學(xué)的興起，細胞療法正得到不斷發(fā)展，間充質(zhì)干細胞因為來源廣泛，分離培養(yǎng)容易，增殖和多向分化能力強，已成為細胞治療領(lǐng)域的研究熱點。
間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，mscs)起源于中胚層，是成體干細胞的一種。因具有來源廣泛、獲取容易、擴增能力強、免疫原性低、非致瘤、能歸巢、無醫(yī)學(xué)倫理學(xué)爭議等優(yōu)點而成為再生醫(yī)學(xué)、細胞療法中的主要選擇細胞。已發(fā)現(xiàn)這種細胞能分化為中胚層的多種成熟組織細胞，如骨、脂肪、肌肉、軟骨和血管內(nèi)皮等，近年來發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細胞的可塑性，即能跨胚層分化
神經(jīng)細胞、肝細胞、腎小管上皮細胞、肺細胞、胰島β細胞等非中胚層細胞。間充質(zhì)干細胞因具有多向分化和自身更新、低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)抑制作用，在組織工程、器官移植及治療免疫介導(dǎo)疾病的領(lǐng)域中具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
間充質(zhì)干細胞的來源有很多，包括胎盤、臍帶、臍帶血、骨髓、脂肪、牙髓、皮膚等。胎盤來源間充質(zhì)干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞相比，具有來源充足、免疫原性低、病毒污染率較低，且無社會倫理爭議等方面的優(yōu)點，使其具有更好的臨床應(yīng)用前景。從胎盤中的多種組織均可提取到間充質(zhì)干細胞，如羊膜、絨毛膜、蛻膜、胎盤小葉和胎盤等。
壁蛻膜作為母體組成部分之一，從中分離得到的蛻膜間充質(zhì)干細胞(decidua-derivedmesenchymalstemcells，dmscs)可以用于母親自身細胞的移植或凍存，具有針對性。蛻膜間充質(zhì)干細胞在表型、增殖及細胞因子表達等方面與其他來源的間充質(zhì)干細胞存在差別，具有獨特的性質(zhì)，如低免疫原性等，近年來已經(jīng)引起眾多科學(xué)家關(guān)注，蛻膜間充質(zhì)干細胞子宮內(nèi)膜重建、盆腔臟器脫垂、膀胱組織修復(fù)等組織修復(fù)具有廣闊的應(yīng)用前景。
但從胎盤壁蛻膜組織分離干細胞的方法和技術(shù)目前還不是完全成熟，較難得到純凈的母親源間充質(zhì)干細胞，而且每一份胎盤壁蛻膜組織的處理、分離和培養(yǎng)都需要消耗一定的人力、物力和時間成本。因此將壁蛻膜組織凍存并且在有需要的時候復(fù)蘇進行干細胞分離的做法相對更符合成本效益。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供了一種壁蛻膜組織凍存、復(fù)蘇及分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的方法，可應(yīng)用于母親來源的壁蛻膜組織的保存，壁蛻膜組織可以在液氮深低溫環(huán)境長期保存，避免復(fù)蘇過程中細胞存活率流失。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
壁蛻膜組織凍存、復(fù)蘇及分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的方法，包括以下步驟：
(1)胎盤組織的預(yù)處理：在無菌環(huán)境下采集胎盤及母血，存放于胎盤組織采集套裝內(nèi)，貼好標(biāo)簽，維持溫度在4-22℃，送達實驗室進行處理；取出胎盤后，75％酒精噴灑消毒胎盤組織的外表面2min后，迅速用組織保護液清洗沖洗組織外表面的殘留血液和血凝塊，并對胎盤和母血樣本進行檢測，檢測的項目包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)；皰疹病毒(eb)；巨細胞病毒(cmv)；艾滋病毒(hiv)；梅毒螺旋體(tp)；乙肝病毒(hbv)；丙肝病毒(hcv)；嗜t細胞病毒(htlv)、細菌和真菌等；
(2)胎盤壁蛻膜組織的分離及處理：將分離獲得的胎盤用生理鹽水清洗后，剝離壁蛻膜，并將分離下來的壁蛻膜剪成2mm3小塊置于離心管中；
(3)胎盤壁蛻膜組織的凍存：配制壁蛻膜組織凍存液，4℃條件下低溫冷藏，然后按每管1ml分裝到凍存管中，降溫，最后于-196℃過夜保存，待微生物檢測為陰性后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存；
(4)胎盤壁蛻膜組織的復(fù)蘇：將步驟(3)冷凍的胎盤壁蛻膜組織從液氮中取出，37℃條件快速解凍，利用間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基清洗壁蛻膜組織，過濾去除廢液，以使凍存的壁蛻膜組織復(fù)蘇；
(5)從胎盤壁蛻膜組織中分離間充質(zhì)干細胞：使用accutasetm細胞消化液對壁蛻膜組織進行消化，將消化后的壁蛻膜進行過濾，洗滌后得間充質(zhì)干細胞，將間充質(zhì)干細胞在臨床級無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；此后每3天換液一次，至細胞融合度達80％以上時，對間充質(zhì)干細胞進行傳代，使用accutasetm細胞消化液消化后，用臨床級無血清培養(yǎng)傳代培養(yǎng)；
(6)壁蛻膜干細胞的傳代培養(yǎng)：當(dāng)貼壁細胞融合率達到80％左右，可利用accutasetm細胞消化液將貼壁細胞脫離平皿底部，離心后移除上清液，并加入間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞，接種于t25細胞培養(yǎng)瓶進行傳代，并進行擴增培養(yǎng)；此后每3天換液一次直至融合率達到80％后，即得，必要時再進行傳代。
進一步，步驟(1)中所述的組織保護液，為dmem/f12和1％的抗生素構(gòu)成；抗生素為青霉素、鏈霉素或兩性霉素b。
進一步，步驟(2)中所述剝離壁蛻膜的步驟為手術(shù)器械剝離胎盤表面的羊膜，完整分離胎盤組織邊緣連接的絨毛膜組織及附著于表面的壁蛻膜組織，用組織保護液清洗血液和血凝塊，刮取壁蛻膜組織，清洗后收集于50ml離心管中。
進一步，步驟(3)中所述的降溫程序如下：先于4℃平衡30min，然后以1℃/min的速度降至-5℃，接著以21℃/min的速度降至-54℃，再以10℃/min的速度升溫至-21℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接著以10℃/min的速度降至-80℃，之后置于液氮罐中，深度儲存。
進一步，步驟(3)中所述的組織凍存液含有海藻糖、dmso、人血白蛋白和無血清完全培養(yǎng)基。
進一步，步驟(5)中所述的臨床級無血清培養(yǎng)基的成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基dmem/f12、20-50ng/ml血小板衍生生長因子(pdgf-bb)、10-20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、5-10ng/ml干細胞生長因子(scf)、10-20ng/ml表皮細胞生長因子(egf)、3-5mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、20-100ug/ml維生素c、1～5mmol/mll-谷氨酰胺、5-30g/l人血白蛋白(hsa)、5-10μg/ml胰島素、30-40ng/ml纖粘連蛋白、1-2x10-6mol/l氫化可的松、100u/ml青霉素及100mg/ml鏈霉素。
進一步，步驟(5)中所述的accutasetm細胞消化液是一種包含有蛋白水解酶和膠原酶活性的一種細胞消化液。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
(1)本發(fā)明是將剝離后的壁蛻膜組織剪碎，直接凍存的方法。每一份組織的處理和分離后的細胞培養(yǎng)都需要一定的時間和人員的消耗。因此將壁蛻膜組織凍存并且在有需要的時候復(fù)蘇進行干細胞分離的做法相對更符合成本效益。
(2)本發(fā)明方法可應(yīng)用于母親來源的壁蛻膜組織的保存，壁蛻膜組織可以在液氮深低溫環(huán)境長期保存，避免復(fù)蘇過程中細胞存活率流失，復(fù)蘇能得到間充質(zhì)干細胞，細胞生長狀態(tài)好、增殖能力強、細胞存活率在96％以上，多向分化性能好，具有向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞分化的能力。
(3)本發(fā)明使用的accutasetm細胞消化液，具有蛋白酶和膠原酶活性，是胰酶/edta的替換產(chǎn)品，能溫和有效的壁蛻膜組織和間充質(zhì)干細胞，凍存后細胞具更高復(fù)蘇率。同時該消化液消化細胞時，不需清洗或中和反應(yīng)，節(jié)省細胞傳代時間。
(4)本發(fā)明使用無血清培養(yǎng)基，并添加不同組分的細胞因子，來促進間充質(zhì)干細胞的增殖和抑制分化，同時，可避免血清批次間質(zhì)量變動，避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染，適合臨床級間充質(zhì)干細胞的擴增培養(yǎng)用。
(5)本發(fā)明方法獲得間充質(zhì)干細胞為母親源，不同于臍帶和胎盤來源的胎兒干細胞，制備的間充質(zhì)干細胞可作為自體干細胞回輸用于產(chǎn)婦自身多種疾病的治療，同時可以通過該間充質(zhì)干細胞定制多種干細胞類美容及抗衰產(chǎn)品用于產(chǎn)婦自身。
附圖說明
附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制，在附圖中：
圖1不同代次壁蛻膜間充質(zhì)干細胞形態(tài)圖，a:p1代；b：p3代；c:p5代；d：p7代
圖2壁蛻膜間充質(zhì)干細胞生長曲線圖
圖3壁蛻膜間充質(zhì)干細胞流式檢測圖
圖4壁蛻膜間充質(zhì)干細胞成脂成骨分化圖
圖5壁蛻膜間充質(zhì)干細胞str鑒定
具體實施方式
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
壁蛻膜組織凍存的方法
(1)胎盤組織的采集和預(yù)處理
在無菌環(huán)境下采集胎盤及母血，存放于胎盤組織采集套裝內(nèi)，貼好標(biāo)簽，維持溫度在4-22℃，送達實驗室進行處理；取出胎盤后，75％酒精噴灑消毒胎盤組織的外表面2min后，迅速用組織保護液清洗沖洗組織外表面的殘留血液和血凝塊。并對胎盤和母血樣本進行檢測，檢測的項目包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)；皰疹病毒(eb)；巨細胞病毒(cmv)；艾滋病毒(hiv)；梅毒螺旋體(tp)；乙肝病毒(hbv)；丙肝病毒(hcv)；嗜t細胞病毒(htlv)、細菌和真菌等。
(2)胎盤壁蛻膜組織的分離及處理
手術(shù)器械剝離胎盤表面的羊膜，完整分離胎盤組織邊緣連接的絨毛膜組織及附著于表面的壁蛻膜組織，用組織保護液清洗血液和血凝塊，刮取壁蛻膜組織，清洗后收集于50ml離心管中。
(3)胎盤壁蛻膜組織的凍存
配制壁蛻膜組織凍存液：所述臍帶組織凍存液中含有2mmol/ml海藻糖、15％dmso、2.5％人血白蛋白+無血清完全培養(yǎng)基，配好的冷存液放在4℃冰箱暫存。
將剪碎的壁蛻膜組織和配制好的凍存液加入凍存管中，然后將凍存管放入程序降溫儀中進行程控降溫，降溫程序如下：先于4℃平衡30min，然后以1℃/min的速度降至-5℃，接著以21℃/min的速度降至-54℃，再以10℃/min的速度升溫至-21℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接著以10℃/min的速度降至-80℃，之后置于液氮罐中，深度儲存。
通過程序降溫儀降溫，梯度降溫凍存壁蛻膜組織，根據(jù)壁蛻膜組織凍存過程中的升溫及降溫的規(guī)律設(shè)定相應(yīng)的凍存速率，能最大限度的保護壁蛻膜組織細胞不受損傷。通過本發(fā)明采用的壁蛻膜組織凍存方法能夠保存壁蛻膜組織15-20年以上，根據(jù)使用情況進行復(fù)蘇組織塊用于細胞培養(yǎng)。
壁蛻膜組織復(fù)蘇的方法
將冷凍的壁蛻膜組織從液氮中取出，放在恒溫水浴里解凍至一半凍存液開始融化，利用無血清培養(yǎng)基(其中包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基dmem/f12、50ng/ml血小板衍生生長因子(pdgf-bb)、20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、5ng/ml干細胞生長因子(scf)、10ng/ml表皮細胞生長因子(egf)、3mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、50ug/ml維生素c、5mmol/mll-谷氨酰胺、20g/l人血白蛋白(hsa)、50μg/ml胰島素、340ng/ml纖粘連蛋白、2x10-6mol/l氫化可的松、100u/ml青霉素及100mg/ml鏈霉素)進行清洗壁蛻膜組織，利用100um過濾器將廢液去掉，重復(fù)清洗3遍。
壁蛻膜間充質(zhì)干細胞分離和培養(yǎng)方法
根據(jù)洗壁蛻膜組織的總體積加入1倍體積的accutasetm消化液，溶液37℃消化組織塊0.5h，整個消化在恒溫氣相搖床中進行，消化完成后，消化液用篩網(wǎng)過濾，用200目的濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織，洗滌后1500g離心10min得到間充質(zhì)干細胞。
得到間充質(zhì)干細胞按2×104/cm2接種于細胞料培養(yǎng)皿，采用無血清培養(yǎng)基，置37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3天后換液，棄去非貼壁細胞，以后每3天半量換液。至細胞融合度達80％以上時，對間充質(zhì)干細胞進行傳代，使用accutasetm細胞消化液消化后，用臨床級無血清培養(yǎng)傳代培養(yǎng)。
accutasetm細胞消化液是一種包含有蛋白水解酶和膠原酶活性的一種細胞消化液，是胰酶/edta消化液的完美替換產(chǎn)品，對干細胞消化更加溫和，能增加細胞產(chǎn)量和存活率。
利用accutasetm細胞消化液將貼壁細胞脫離平皿底部，離心后移除上清液，并加入間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞，接種于t75細胞培養(yǎng)瓶進行傳代，并進行擴增培養(yǎng)；此后每3天換液一次直至融合率達到80％后，即得，必要時再進行傳代。
并取部分細胞進行細菌、真菌和病毒原微生物檢查，細胞活力檢測、細胞增殖能力檢測、流式抗體檢測、多向分化檢測、細胞str的鑒定檢測等。
細胞生長曲線的測定
取第3代的間充質(zhì)干細胞胰酶消化后接種(密度為1.0×104個/ml)于24孔板中，置于37.5℃、含5％co2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每天隨機抽取3個孔用胰酶消化、計數(shù)，每孔計3次數(shù)取平均值，持續(xù)7d。取每孔加20μl的濃度為5mg/ml的噻唑藍(mtt)，繼續(xù)培養(yǎng)；4小時后小心移去培養(yǎng)上清；每孔加入100μl的二甲基亞砜，微量振蕩器震蕩5分鐘；置酶標(biāo)儀上測490nm下的光吸收值，統(tǒng)計學(xué)分析后繪制出生長曲線。p3代間充質(zhì)干細胞生長曲線如圖2所示。圖1不同代次壁蛻膜間充質(zhì)干細胞形態(tài)圖。
流式細胞檢測
將5×106間充質(zhì)干細胞消化成單細胞懸液；以pbs洗滌兩遍后調(diào)整濃度至1×105/ml，流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)記陽性指標(biāo)cd29、cd90、cd73和cd105，陰性指標(biāo)cd19、cd34、cd45、hla-dr，陽性細胞率均超過99％，陰性指標(biāo)符合低于1％，符合間充質(zhì)干細胞的特征，如圖3所示。
多向分化能力檢測
分別取60mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的p5代間充質(zhì)干細胞，待生長到80％-90％匯合度時，去掉培養(yǎng)基，用pbs洗滌3次。加入成脂細胞誘導(dǎo)液(參考間充質(zhì)干細胞成脂分化培養(yǎng)基(adm)說明書配制)和成骨細胞誘導(dǎo)液(間充質(zhì)干細胞成脂分化培養(yǎng)基(odm)說明書誘導(dǎo)培養(yǎng)，對照組加入常規(guī)完全培養(yǎng)液，每2-3d更換一次培養(yǎng)液。每日觀察細胞生長狀態(tài)及細胞的形態(tài)變化，適時對誘導(dǎo)后的成骨細胞、成脂細胞進行茜素紅、油紅o染色鑒定。油紅o染色后可見到誘導(dǎo)組細胞內(nèi)產(chǎn)生的脂滴可以染成紅色，茜素紅s染色后發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)形成的結(jié)節(jié)處細胞顯亮紅色，表明本方法制備的間充質(zhì)干細胞具有多向分化能力，結(jié)果如圖4所示。
細胞str的鑒定
分別取同一個體來源的壁蛻膜間充質(zhì)干細胞5×105和胎兒臍帶組織，選用中德美聯(lián)agcuex22熒光檢測試劑盒對樣本進行擴增，在abi3730型遺傳分析儀上進行自動激光熒光毛細管電泳檢測，檢測結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示通過本發(fā)明方法可得到純凈的，不含胎兒dna污染的母親源間充質(zhì)干細胞。
最后應(yīng)說明的是：以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換，但是凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。