本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域中的干擾素領(lǐng)域，具體涉及一種重組雞干擾素λ(rChIFN-λ)基因的克隆表達及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

IFN-λ是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類細胞因子，命名為Ⅲ型干擾素，其家族成員包括IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3與IFN-λ4，但雞IFN-λ只有一種ChIFN-λ,DNA片段為561bp，蛋白大小約為22kDa。雞IFN-λ具有一對特異的功能受體復合體(IFN-λR1/IL-10R2)，當雞IFN-λ與受體復合體結(jié)合時，導致受體異二聚體化，可激活下游JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導，從而發(fā)揮廣泛的生物學效應(yīng)，包括抗病毒效應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤等等。已經(jīng)有研究表明IFN-λ在一下病毒中發(fā)揮良好的抗病毒效應(yīng)，比如，流感病毒、單純皰疹病毒、肝炎病毒等。

新城疫是由禽副黏病毒科新城疫病毒(Newcastle Disease,ND)引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞與火雞。該病主要損害消化道、胃腸道與神經(jīng)系統(tǒng)。新城疫不僅嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)，同時也對世界經(jīng)濟業(yè)造成巨大損失，被世界動物衛(wèi)生組織列為法定報告疾病，被中國列為一類動物疫病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于發(fā)明一種高效抗病毒活性重組雞干擾素λ(rChIFN-λ)基因的克隆表達及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述的雞干擾素λ生產(chǎn)簡便，成本低，活性高，對新城疫和流感有良好的治療效果。

本發(fā)明的第一目的是提供上述重組雞干擾素λ(rChIFN-λ)蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明的另一目的是提供該蛋白的生產(chǎn)方法和原核表達質(zhì)粒pET32a-rChIFNλ的制備方法。

本發(fā)明的再一目的是提供該蛋白在細胞上抑制病毒繁殖和在臨床上治療動物病毒性疫病的應(yīng)用和效果。

為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

步驟一：引物設(shè)計與合成。根據(jù)Genbank提供的雞IFN-λ的基因序列(GenBank no.KF680102.1)，設(shè)計一對引物IFN-λ-F1,IFN-λ-R1，通過SignalP預測并除去信號肽，設(shè)計引物，分別在上下游插入EcoR1與Hind3兩個酶切位點，為IFN-λ-F,IFN-λ-R。序列如下：

IFN-λ-F1：ATGGTATGCTACGGGGTCAC

IFN-λ-R1：CTAAGTGCAATCCTCGCGCTG

IFN-λ-F：CCGGAATTCCAGGTCACCCCGAAGAA

IFN-λ-R：CCCAAGCTTCTAAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

步驟二：基因克隆與鑒定。用SPF雞胚自制雞胚成纖維(CEF)細胞，使用POLY(I:C)刺激2h后，抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)得到擴增雞IFN-λ基因的模板cDNA，使用IFN-λ-F,IFN-λ-R引物擴增出雞IFN-λ去信號肽的基因片段。

步驟三：將基因克隆至pMD-19T載體。將雞IFN-λ基因連接至pMD-19T載體，16℃連接4h以上，轉(zhuǎn)化至含氨芐瓊脂平板，挑取單克隆菌放入LB培養(yǎng)基中搖菌，菌液PCR鑒定出陽性克隆，測序正確后擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pMD-19T-rChIFN-λ。

步驟四：構(gòu)建pET32a-rChIFN-λ重組質(zhì)粒。分別將pMD-19T-rChIFN-λ與pET32a空載體用EcoR1與Hind3快切酶雙酶切，膠回收后用T4連接酶，常溫連接30min以上，轉(zhuǎn)化至含氨芐瓊脂平板，挑取單克隆菌放入LB培養(yǎng)基中搖菌，菌液PCR鑒定出陽性克隆，測序正確后擴大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pET32a-rChIFN-λ。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明能提煉出較高濃度與活性的蛋白，為后續(xù)實驗打下良好基礎(chǔ)，且在細胞層面有良好抗病毒活性，針對雞新城疫在動物體內(nèi)有顯著療效。

附圖說明

圖1為PCR擴增的雞IFN-λ基因瓊脂糖核酸電泳圖；其中，泳道M為DNA marker DL2000，泳道1為陰性對照，泳道2為chIFN-λ基因擴增結(jié)果。

圖2為SDS-PAGE鑒定重組雞干擾素λ(rChIFN-λ)蛋白表達結(jié)果圖；其中，泳道M為低分子量蛋白Marker，泳道1為pET-32a空載體包涵體變性前，泳道2為pET-32a空載體包涵體復性后，泳道3為重組雞干擾素λ(rChIFN-λ)包涵體變性前，泳道4為重組雞干擾素λ(rChIFN-λ)包涵體復性后。

圖3為Western blot鑒定重組雞干擾素λ(rChIFN-λ)蛋白表達結(jié)果圖；其中，泳道M為低分子量蛋白Marker，泳道1為pET-32a空載體上清對照，泳道2為pET-32a空載體包涵體對照，泳道3為重組雞干擾素λ(rChIFN-λ)上清，泳道4為重組雞干擾素λ(rChIFN-λ)包涵體沉淀。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。但本發(fā)明并不限于此。

實施例1雞IFN-λ基因原核表達載體的構(gòu)建

(1)相關(guān)引物設(shè)計與合成

引物設(shè)計是根據(jù)Genbank提供的雞IFN-λ的基因序列(GenBank no.KF680102.1)，設(shè)計一對引物IFN-λ-F1,IFN-λ-R1，通過SignalP預測并除去信號肽，設(shè)計引物，分別在上下游插入EcoR1與Hind3兩個酶切位點，為IFN-λ-F,IFN-λ-R。序列如下：

IFN-λ-F1：ATGGTATGCTACGGGGTCAC

IFN-λ-R1：CTAAGTGCAATCCTCGCGCTG

IFN-λ-F：CCGGAATTCCAGGTCACCCCGAAGAA

IFN-λ-R：CCCAAGCTTCTAAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

(2)基因克隆與鑒定

取10日齡SPF雞胚，用鑷子去除頭、四肢和內(nèi)臟，將雞肉剪碎后胰酶消化4min,過濾，制成CEF細胞，傳代一次之后，使用POLY(I:C)刺激，2h后，棄上清，取細胞樣品抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)得到擴增雞IFN-λ基因的模板cDNA，先使用IFN-λ-F1,IFN-λ-R1擴增出雞IFN-λ基因，再使用IFN-λ-F,IFN-λ-R引物進行擴增，擴增出雞IFN-λ基因去信號肽片段。反應(yīng)體系如下：25μl Premix ExTaq酶，2.5μl模板DNA(cDNA)，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，蒸餾水補至50μl。反應(yīng)程序如下：94℃預變性4min,94℃變性1min,55℃退火30s,72℃延伸40s,72℃延伸7min，其中第2至第4步35個循環(huán)。核酸電泳條帶大小約492bp。

(3)將基因克隆至pMD-19T載體

將rChIFN-λ基因連接至pMD-19T載體，反應(yīng)體系如下：5.0μl Ligation SolutionⅠ，0.5μl pMD 19-T vector，4.5μl chIFN-λ+αPCR回收產(chǎn)物。16℃連接4h以上，用DH5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化至含氨芐瓊脂平板，37℃放置過夜，挑取單克隆菌放入含氨芐LB培養(yǎng)基中搖菌6-8h，菌液PCR鑒定出陽性克隆，反應(yīng)體系如下：7.5μl Premix rTaq酶,6.1μl ddH₂O，0.2μl上游引物IFN-λ-F，0.2μl下游引物IFN-α-R，1.0μl菌液，反應(yīng)程序如下：94℃預變性4min,94℃變性1min,55℃退火30s,72℃延伸40s,72℃延伸7min，其中第2至第4步30個循環(huán)。挑選鑒定陽性樣品送測序，測序正確后擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pMD-19T-rChIFN-λ。

(4)pET32a-rChIFN-λ重組質(zhì)粒構(gòu)建

分別將pMD-19T-rChIFN-λ與pET32a空載體用EcoR1與Hind3快切酶雙酶切，反應(yīng)體系如下：1.5μl EcoR1酶，1.5μl Hind3酶，5μl 10×Buffer,2-5μg質(zhì)粒，ddH₂O補至50μl，37℃水浴30min。膠回收后用T4連接酶，酶切產(chǎn)物按照pMD-19T-rChIFN-λ：pET32a空載體＝3:1的比例加入8μl，1μl T4連接酶，1μl T4連接Buffer，常溫連接30min以上，轉(zhuǎn)化至含氨芐瓊脂平板，挑取單克隆菌放入含氨芐LB培養(yǎng)基中搖菌，菌液PCR鑒定出陽性克隆，送測序，測序正確后擴大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pET32a-rChIFN-λ+α。

實施例2蛋白表達與鑒定

將重組質(zhì)粒pET32a-rChIFN-λ用BL21感受態(tài)轉(zhuǎn)化，單克隆菌擴大培養(yǎng)后，按照1:100比例接種氨芐LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)，直至OD600nm值為0.6左右時，加入IPTG誘導表達后，菌液離心，棄上清，PBS重懸、離心清洗2次后，超聲破碎儀200W裂解15min，4℃離心分離出沉淀，用預冷PBS清洗2次，用含8M尿素的Lysis Equilibration Buffer溶解包涵體，室溫孵育60min，4℃離心出去不溶雜質(zhì)，上清用0.45μm濾器過濾，將其與Ni柱結(jié)合，用不同濃度咪唑洗脫液洗脫直至OD280值為0，最后用含有250mmol/L咪唑的Elution Buffer洗脫，收集濾液。將濾液放入用EDTA處理過的透析袋中，分別用8M,6M,4M,2M,0M,PBS進行梯度透析，每次間隔12h，最后用SDS-PAGE鑒定。

實施例3體外抗病毒活性鑒定

將DF-1細胞鋪板至96孔板細胞板，待長至80％-90％，將rChIFN-λ以4倍梯度稀釋100μl加入每孔，分別從4^-1-4^-10,，每個梯度24個重復，于37℃孵育12h，分別將100TCID50VSV,NDV,AIV病毒加入，100μl每孔，于37℃孵育1h，將病毒液棄掉，用PBS洗2次，換上2％血清DMEM，放于37℃48h，檢測病毒含量。結(jié)果顯示：rChIFN-λ對DF-1細胞產(chǎn)生良好的保護能力，在體外DF-1細胞上有良好的VSV,AIV抗病毒活性，分別為1.87*10³IU/mg，7.8*10³IU/mg。

實施例4體內(nèi)抗病毒活性鑒定

在2周齡SPF雞上檢測rChIFN-λ抗病毒活性。給2周齡SPF雞靜脈注射100μg rChIFN-λ，4h后，以同樣的量再次進行靜脈注射，再隔2h后注射攻新城疫病毒。之后1、3、5、7、9、11天采集咽拭子與泄殖腔拭子，普通雞胚接胚檢測排毒；每日觀察雞采食與精神狀況；記錄死亡情況。結(jié)果顯示：rChIFN-λ組對SPF雞的保護率可達到33％,而攻毒對照組的存活率僅8％；此外，咽拭子與泄殖腔拭子結(jié)果顯示，rChIFN-λ組與攻毒對照組比較，可推遲4-9d排毒，且排毒量明顯降低；rChIFN-λ組的SPF雞采食正常，精神良好。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

華南農(nóng)業(yè)大學

一種重組雞干擾素λ（rChIFN-λ）基因的克隆表達及其制備方法和應(yīng)用

（1） 雞IFN-λ基因

ATGGTATGCT ACGGGGTCAC AATTATTTTG GTGGGGACCC TGGGGTCCCT CCTGGTGGGT 60

GCCTTCCCCC AGGTCACCCC GAAGAAGAGC TGCAGCCTCT CCAAGTACCA GTTCCCTGCA 120

CCTTTGGAGT TGAAGGCAGT GTGGAGGATG AAGGAGCAGT TTGAAGACAT CATGCTGTTA 180

ACAAACAGAA AATGCAACAC CAGACTCTTC CATCGGAAGT GGGACATAGC TGAGCTGTCG 240

GTACCTGACC GAATCACCCT GGTGGAGGCT GAGCTGGACC TCACCATCAC CGTGCTCACA 300

AACCCCACAA CCCAGAGACT GGCAGAGACG TGCCAACAGC CCCTGGCCTT CCTTACCCAA 360

GTCCAGGAGG ACCTGCGAGA CTGCTTGGCC CTCGAGGCAC CTTCACATCA GCCCTCTGGG 420

AAACTGAGGC ACTGGCTGCA GAAGCTGGAG ACAGCCAAGA AGAAGGAGAC CGCCGGCTGC 480

CTGGAGGCCT CAGCCATCCT CCACATCTTC CAAGTACTGA ACGACCTGCG GTGGCAGCCC 540

AGCGCGAGGA TTGCACTTAG 560

（2） IFN-λ-F1

ATGGTATGCT ACGGGGTCAC 20

（3） IFN-λ-R1

CTAAGTGCAA TCCTCGCGCT G 21

（4） IFN-λ-F

CCGGAATTCC AGGTCACCCC GAAGAA 26

（5） IFN-λ-R

CCCAAGCTTC TAAGTGCAAT CCTCGCGCTG GGC 33