本發(fā)明屬于植物保護和生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種弱酸/堿處理稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過表達菌株抑制其侵染水稻SA途徑相關(guān)基因上調(diào)的方法。
背景技術(shù)：
隨著對全球氣候變化對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響的越來越多關(guān)注，許多研究集中在各種氣候變化對植物病害流行的影響，以及氣候改變植物病原菌與寄主互作的特定機制方面。植物病害的出現(xiàn)源于感病寄主植物、病原菌以及適于病害發(fā)展的環(huán)境條件三者間的互作，這就是已知的病害三角。環(huán)境條件的改變加重了植物病害發(fā)病癥狀，且與44％的新病害流行有關(guān)。環(huán)境條件的改變能對病原菌及寄主植物產(chǎn)生直接影響。
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)因其對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重危害而被認為是影響水稻生產(chǎn)最為嚴重的子囊菌亞門真菌之一。正常條件下，落在寄主植物表面的分生孢子開始發(fā)芽，很快分化出芽管形成特化的侵染細胞即附著胞，稻瘟病菌株利用高度特化的侵染結(jié)構(gòu)——附著胞穿透寄主植物。成功穿透寄主后，侵染菌絲在寄主細胞內(nèi)快速生長同時出現(xiàn)梭形病斑。5到7天時，病斑上產(chǎn)生大量分生孢子，開始新一輪的侵染循環(huán)。在侵染過程中，病原菌侵染的寄主植物周圍的pH、溫度、濕度、以及寄主植物細胞的微環(huán)境如植物響應(yīng)病原菌侵染時產(chǎn)生的SA和JA等激素水平上升或下降都會影響到病原菌侵染寄主過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、裂解酶類或次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。與pH相關(guān)的真菌細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也有不少報道，真菌能在范圍較廣的pH值范圍內(nèi)生長發(fā)育，真菌通過分泌酸性或堿性物質(zhì)調(diào)控其周圍的pH以利于其侵染和定殖。構(gòu)巢曲霉菌中的7個蛋白與pH識別相關(guān)，其中的兩個蛋白PalH和PalI是推測膜蛋白，PalH(7個預(yù)測跨膜螺旋)攜帶有pH識別活性。通過對PACC缺失菌株的研究表明，pH信號途徑在各種致病真菌毒性中的作用。PACC的缺失會對真菌分泌代謝產(chǎn)物或裂解酶產(chǎn)生極大地負作用。因此，pH信號途徑似乎控制許多細胞功能，而這些細胞功能與病菌的各種侵染過程相關(guān)。Landraud等人研究發(fā)現(xiàn)，當?shù)疚敛【晏幱趬A性條件下，轉(zhuǎn)錄因子PACC在的表達量明顯上調(diào)。PacC在稻瘟病菌生物學(xué)方面具有重要作用，而且pH是影響稻瘟病菌與寄主互作過程的一種重要因子。由此可以看出，環(huán)境因子(溫度、濕度、pH、活性氧、感染寄主的微環(huán)境的pH等)在稻瘟病菌與寄主水稻互作過程具有重要作用。
目前，大部分研究主要集中在pH如何影響寄主與病原互作機制的研究，有關(guān)pH如何影響受病原菌效應(yīng)蛋白基因過表達菌株侵染的水稻SA途徑相關(guān)基因表達的研究很少涉及。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種抑制侵染水稻SA途徑相關(guān)基因上調(diào)的方法。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)上述目的：
本發(fā)明包括以下步驟：
(1)利用弱酸/堿pH5,pH5.5,pH8,pH8.4溶液處理稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過表達菌株孢子；
(2)用不同pH處理后的孢子懸浮液噴霧接種水稻葉片；
(3)于0h,24h,48h,72h和96h時間點取樣，提取水稻樣品總RNA；
(4)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，real-timeRT-PCR檢測cDNA；
(5)分析SA途徑相關(guān)的兩個主要基因PAL和EDS1在不同時間點的表達。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明是一種弱酸/堿處理稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過表達菌株抑制其侵染水稻SA途徑相關(guān)基因上調(diào)的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供一種更為簡便、直接有效準確地定量弱酸/堿處理的病原菌基因過表達菌株侵染水稻后對水稻SA途徑相關(guān)基因表達的影響，為更快速準確地分析水稻與稻瘟病菌互作時對弱酸/堿響應(yīng)機制的研究提供重要的實驗依據(jù)。
具體實施方式
下面對本發(fā)明作進一步說明：
本發(fā)明包括以下步驟：
(1)利用弱酸/堿pH5,pH5.5,pH8,pH8.4溶液處理稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過表達菌株孢子；
(2)用不同pH處理后的孢子懸浮液噴霧接種水稻葉片；
(3)于0h,24h,48h,72h和96h時間點取樣，提取水稻樣品總RNA；
(4)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，real-timeRT-PCR檢測cDNA；
(5)分析SA途徑相關(guān)的兩個主要基因PAL和EDS1在不同時間點的表達。
本發(fā)明中pH5/pH8處理稻瘟菌孢子、稻瘟病菌孢子噴霧接種、水稻育苗、水稻總RNA提取、real-time RT-PCR及數(shù)據(jù)分析等方法均與常規(guī)相同。
本發(fā)明的有益效果是全面而準確的檢測經(jīng)弱酸/堿(pH5,pH5.5,pH8,pH8.4)處理的稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過表達菌株孢子懸浮液噴霧接種于水稻葉片上，于不同時間點取樣，提取水稻葉片總RNA，real-time RT-PCR分析受侵染水稻SA途徑相關(guān)基因PAL和EDS1的表達?？朔艘延醒芯坎【c寄主互作時對非生物因子響應(yīng)機制時借助溫室設(shè)計各種弱酸處理以觀察寄主表型變化、以及篩選大量水稻防御相關(guān)基因表達等周期長和效率低的弊端，最終達到為今后測定弱酸/堿影響受病原菌效應(yīng)蛋白過表達菌株侵染水稻SA途徑相關(guān)基因的表達方法提供有效準確的目的。具體方法是分別采用弱酸/堿(pH5,pH5.5,pH8,pH8.4)處理稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過表達菌株孢子，將處理后的孢子懸浮液噴霧接種于水稻葉片上，于不同時間點(0h,24h,48h,72h和96h)取樣，提取樣品總RNA，real-time RT-PCR分析SA途徑相關(guān)的兩個基因(PAL和EDS1)的表達量?？煽焖佟⒅苯訙蚀_地了解弱酸/堿處理的病原菌基因過表達菌株侵染水稻后對水稻SA途徑相關(guān)基因表達的影響，克服了已有研究病菌與寄主互作時對非生物因子響應(yīng)機制時借助溫室設(shè)計各種弱酸處理以觀察寄主表型變化、以及篩選大量水稻防御相關(guān)基因表達等周期長和效率低的弊端。
實施例一：
采用pH5處理稻瘟病菌孢子懸浮液，將孢子懸浮液接種于三葉一心期的水稻葉片上，28℃黑暗保濕24h后，置于溫室中進行保溫保濕。于接種0h、24h、48h和96h取樣，TrizolRNA提取試劑盒提取樣品總RNA，利用實時熒光定量試劑盒進行SA途徑相關(guān)的兩個基因(PAL和EDS1)表達量檢測(表1)。
表1 PAL和EDS1在pH5.0處理稻瘟菌過表達菌株侵染水稻不同時間點表達量
實施例二：
采用pH5.5處理稻瘟病菌孢子懸浮液，將孢子懸浮液接種于三葉一心期的水稻葉片上，28℃黑暗保濕24h后，置于溫室中進行保溫保濕。于接種0h、24h、48h和96h取樣，TrizolRNA提取試劑盒提取樣品總RNA，利用實時熒光定量試劑盒進行SA途徑相關(guān)的兩個基因(PAL和EDS1)表達量檢測(表2)。
表2 PAL和EDS1在pH5.5處理稻瘟菌過表達菌株侵染水稻不同時間點表達量
實施例三：
采用pH8.0處理稻瘟病菌孢子懸浮液，將孢子懸浮液接種于三葉一心期的水稻葉片上，28℃黑暗保濕24h后，置于溫室中進行保溫保濕。于接種0h、24h、48h和96h取樣，TrizolRNA提取試劑盒提取樣品總RNA，利用實時熒光定量試劑盒進行SA途徑相關(guān)的兩個基因(PAL和EDS1)表達量檢測(表3)。
表3 PAL和EDS1在pH8.0處理稻瘟菌過表達菌株侵染水稻不同時間點表達量
實施例四：
采用pH8.4處理稻瘟病菌孢子懸浮液，將孢子懸浮液接種于三葉一心期的水稻葉片上，28℃黑暗保濕24h后，置于溫室中進行保溫保濕。于接種0h、24h、48h和96h取樣，TrizolRNA提取試劑盒提取樣品總RNA，利用實時熒光定量試劑盒進行SA途徑相關(guān)的兩個基因(PAL和EDS1)表達量檢測(表4)。
表4 PAL和EDS1在pH8.4處理稻瘟菌過表達菌株侵染水稻不同時間點表達量
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。