本發(fā)明屬于廢水吸附劑及其制備和應用技術領域，涉及一種處理含鈾廢水的鈾酰離子結合七肽和編碼該七肽的核酸，含有該核酸的載體、細胞，以及鈾酰離子結合七肽的應用。

背景技術：

隨著核工業(yè)的發(fā)展，天然鈾的需求量不斷增加，在鈾礦冶工業(yè)的各主要生產(chǎn)環(huán)節(jié)以及鈾元素的應用中，產(chǎn)生了大量的含鈾放射性廢水。這些含鈾廢水如不進行排放前處理，將對地表水、地下水和土壤產(chǎn)生放射性污染，從而對環(huán)境及人類健康構成極大危害。如何減少廢水中鈾的放射性危害，同時有效回收利用昂貴而且有限的鈾資源，已成為制約鈾工業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要問題之一。

生物吸附技術的出現(xiàn)給重金屬污染處理帶來了新的轉(zhuǎn)機。其中，微生物吸附成本低、效率高、在處理含鈾廢水和回收鈾資源方面有著廣闊的應用前景。微生物細胞對廢水中重金屬離子的吸附一般可分為胞內(nèi)吸附、細胞表面吸附和胞外吸附。胞內(nèi)吸附主要是通過重金屬離子與細胞內(nèi)的金屬硫蛋白、金屬硫蛋白樣蛋白、植物螯合素等金屬結合蛋白相結合，在細胞內(nèi)沉淀固定。研究發(fā)現(xiàn)，在多種微生物、動物和植物細胞內(nèi)普遍存在對金屬離子具有親和能力的蛋白質(zhì)(肽)，稱為金屬結合蛋白(肽)，它們可與環(huán)境中的金屬離子通過化學結合作用形成復合物，進而降低、富集或消除金屬離子對生物細胞的毒性。金屬結合肽的應用范圍較廣，其中應用領域之一是環(huán)境中重金屬污染的生物修復。目前研究的金屬結合肽主要為天然存在的結合肽，但是，天然結合肽種類有限，且未發(fā)現(xiàn)鈾酰離子特異性結合肽。

隨機肽庫技術的出現(xiàn)為研究并篩選鈾酰離子特異性結合肽提供了一條有效的途徑。隨機肽庫是由與細胞外殼蛋白融合表達的多肽所組成，庫中包含上億種多肽分子，分別呈現(xiàn)在不同的細胞表面，眾多重組細胞即組成了隨機肽庫。近年來，隨機肽庫技術已應用于抗原表位篩選、新受體及天然配體結構域的識別和鑒定、藥物篩選和設計等研究領域。利用隨機肽庫技術篩選鈾酰離子結合肽，并研究該結合肽對廢水中鈾酰離子的吸附作用，具有較好的應用前景。

酵母菌被認為是富集金屬離子的良好微生物，對鈾離子有較強的吸附作用，具有安全、培養(yǎng)簡單、生長迅速等優(yōu)良特性，同時，酵母細胞易于固定化處理，方便機械化和自動化應用。通過細胞表面展示技術將鈾酰離子結合肽展示在酵母細胞表面，使結合肽與環(huán)境中的鈾酰離子直接作用，可以有效提高吸附速率及吸附量。同時，結合肽螯合鈾酰離子并將其堆積在細胞表面，不需要破碎菌體細胞就可以將鈾酰離子洗脫下來，既方便金屬離子的回收利用，也可使細胞循環(huán)用于金屬除污，降低生產(chǎn)成本。由于吸附作用主要取決于細胞表面結合肽的螯合作用，而不依賴于細胞的生命活動，因此，即使制備的細胞失去了生命活力，只要保證結合肽的正確折疊結構，就不會降低細胞對鈾酰離子的吸附量，這無疑將簡化細胞吸附劑的使用條件及操作程序。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種處理含鈾廢水的鈾酰離子結合七肽，其對水溶液中的鈾酰離子具有高親和力，同時還提供了鈾酰離子結合七肽的編碼核酸，含有該核酸的載體、細胞，以及鈾酰離子結合七肽的應用。本發(fā)明通過篩選鈾酰離子結合七肽，并在酵母細胞表面進行展示制備吸附劑，具有潛在的提高細胞吸附量的能力，是一條極具前途的開發(fā)新型鈾酰離子吸附材料的有效途徑。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

鈾酰離子結合七肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

編碼鈾酰離子結合七肽的核酸，其編碼SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，編碼SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

一種載體，其為含有如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示多核苷酸序列的載體。

一種細胞，其為含有上述載體，或者轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有上述核酸的釀酒酵母細胞，細胞表面展示了鈾酰離子結合七肽。

一種鈾酰離子特異性結合七肽在制備處理含鈾酰離子廢水的吸附材料中的應用。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明通過篩選噬菌體隨機七肽庫，得到了兩種鈾酰離子結合七肽。試驗證明，鈾酰離子結合七肽對水溶液中的鈾酰離子具有高親和力，能與鈾酰離子特異性結合，將鈾酰離子結合七肽展示在酵母細胞表面制備吸附材料，可有效提高酵母細胞對廢水中鈾酰離子的吸附作用，具有較好的應用前景。同時本發(fā)明所述的結合肽的篩選方法，也為篩選其它金屬離子結合肽提供了切實可行的技術方案。

附圖說明

圖1為鈾酰離子結合七肽對鈾酰離子的親和性測定；

圖2為鈾酰離子結合七肽對其它金屬離子的反篩實驗；

圖3為本發(fā)明實施例2中的重組表達載體pYD-7-4、pYD-7-5示意圖；

圖4為釀酒酵母細胞EBY100-7-4、EBY100-7-5的免疫熒光檢測；

圖5為溶液初始液pH對酵母工程菌吸附鈾酰離子的影響；

圖6為吸附時間對酵母工程菌吸附鈾酰離子的影響；

圖7為鈾酰離子初始濃度對酵母工程菌吸附鈾酰離子的影響；

圖8為溫度對對酵母工程菌吸附鈾酰離子的影響。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍中。

實施例1

本實施例中提供了一種鈾酰離子結合七肽的篩選方法，包括以下步驟：

(1)鈾酰離子螯合樹脂的制備

在無菌條件下，移取100μl樹脂于1.5mL離心管中，13000rpm，5min離心，去上清。用1mL無菌水重懸樹脂，13000rpm，5min離心，重復4次。將處理過的樹脂加入150mL，濃度為20μg/mL的無菌鈾標溶液中，150rpm振蕩過夜。13000rpm，10min離心，去上清，獲得了鈾酰離子螯合樹脂(M^U+)。實驗中設置滅菌超純水處理的樹脂作為對照(M^-)。

(2)隨機七肽庫的第一輪篩選

取100μl M^U+、M^-樹脂各一支，各加入1000μl 0.1％TBST(pH7.4)，清洗2遍。在M^U+、M^-樹脂中分別加入10μl噬菌體七肽庫(購于美國New England Biolabs，NEB公司)。25℃，100rpm室溫溫和混勻1h，4℃2000rpm離心30s。分別加入1000μl 0.1％TBST，100rpm震蕩1min后，4℃2000rpm離心30s，棄上清，清洗2次。加入500μl 20mmolID，4℃2000rpm離心30s，棄上清，清洗2次。加入1000μl 0.1％TBST，4℃2000rpm離心30s，清洗5次。加入300μl 200mmol ID，100rpm，25℃搖床20min；4℃2000rpm離心30s，取上清，重復2次。合并2次的上清液，即為第一輪篩選后的噬菌體洗脫物。根據(jù)常規(guī)M13方法，測定少量(1μl)洗脫物的滴度。

(3)噬菌體洗脫液的擴增

將10μl洗脫物加入到20ml ER2738培養(yǎng)物中(該菌體應處于對數(shù)前期)，37℃劇烈搖動(150rpm)培養(yǎng)4.5h。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物至一新離心管中，4℃10000rpm離心10min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，再離心。轉(zhuǎn)移80％上清到一新管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4℃沉淀至少60min。4℃，12000rpm離心15min，去上清液。4℃，12000rpm離心30s，去除殘留上清液。加入1mL TBS重懸沉淀物，轉(zhuǎn)移懸液到微量離心管中，4℃14000rpm離心5min，沉淀殘余細胞。轉(zhuǎn)移上清到另一新鮮微量離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl沉淀上清液，冰上孵育30min。沉淀物重懸于200μl TBS，4℃10000rpm離心1min，沉淀任何殘余的不溶物。上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，即為第一輪噬菌體洗脫物的擴增物。

(4)第二輪篩選

將擴增后的噬菌體液用TBS稀釋為1×10¹²cfu/mL，取100μl分別加入到M^U+、M^-樹脂中。第二輪篩中選用1000μl 0.3％TBST，清洗4次，棄上清。加入500μl 20mmolID清洗4次，棄上清。加入1000μl 0.3％TBST清洗8次，棄上清。加入300μl 200mmolID，100rpm，25℃搖床20min。2000rpm，4℃離心30s，取上清，重復2次，合并2次的上清液，即為第二輪篩選后的噬菌體洗脫物。測洗脫物的滴度。

在篩選過程中，計算每輪M^U+樹脂的洗脫物滴度與M^-樹脂的洗脫物滴度的比值(P/N值)，來反映特異性結合噬菌體的富集程度。結果顯示(如表1)，經(jīng)過兩輪篩選，噬菌體富集度逐漸升高，表明得到了與鈾酰離子特異結合的噬菌體克隆。

表1 兩輪親和篩選對噬菌體的富集

(5)單克隆噬菌體的擴增

將ER2738過夜培養(yǎng)物按1：100的比例稀釋至20ml LB液體培養(yǎng)基中。用滅菌吸頭隨機挑取20個藍色噬菌斑，分別加入到ER2738培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)4.5-5h。將培養(yǎng)物于4℃12000rpm離心30s。取上清轉(zhuǎn)入新管中，離心。取80％的上清轉(zhuǎn)入新離心管中，此即為擴增的單克隆噬菌體。

(6)噬菌體展示短肽對鈾酰離子的親和性測定

為了檢測篩選到的噬菌體與鈾酰離子的親和性，隨機挑選20個噬菌體單克隆并進行擴增，分別將噬菌體擴增液與M^U+、M^-兩種樹脂混合，通過洗脫反應，測得各處理洗脫液的噬菌體滴度，計算M^U+樹脂的洗脫物滴度與M^-樹脂的洗脫物滴度比值(P/N值)。結果發(fā)現(xiàn)，20個噬菌體展示的七肽對鈾酰離子均具有一定的親和力，但是，不同的結合肽親和力不同，其中7-1、7-4、7-5、7-8、7-10、7-12、7-16這7條結合肽對鈾酰離子的親和性較高，結果如圖1。

(7)反篩實驗

制備鈰、銫、鍶、釓、釤5種混合金屬離子的螯合樹脂(M^H+)及鈾酰離子螯合樹脂(M^U+)，設置滅菌超純水處理的樹脂作為對照(M^-)。取100μl M^H+、M^U+、M^-樹脂各一支，分別加入1000μl0.1％TBST(pH7.4)清洗2次。擴增含有上述7條結合肽的噬菌體克隆，將M^H+、M^U+、M^-三種樹脂分別與噬菌體擴增液混合，25℃，130rpm搖床室溫1h。加入1000μl 0.1％TBST，2000rpm，4℃離心15s，棄上清，清洗10次。加入500μl 20mmol ID，2000rpm，4℃離心15s，棄上清，清洗8次。加入0.1％的TBST，2000rpm，4℃離心15s，棄上清，清洗10次。加入300μl 200mmol的ID，200rpm，25℃洗脫20min，2000rpm，4℃離心20s，取上清，重復2次。合并2次的洗脫液，測滴度，計算P/N值，結果如圖2。

結果表明，7-4、7-5噬菌體對鈾酰離子的親和力遠高于對混合金屬離子的親和力。說明，噬菌體7-4、7-5中插入的七肽為鈾酰離子特異性結合肽。

(8)噬菌體DNA序列測定

挑取7-4和7-5的噬菌體克隆，用-28gIII(如SEQ ID NO：5所示)和-96gIII測序引物(如SEQ ID NO：6所示)交由蘇州金唯智生物科技有限公司測序。得到的兩條鈾酰離子結合七肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。推測其相應的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

實施例2

本實施例中提供了一種鈾酰離子結合七肽在釀酒酵母細胞表面的展示方法，包括以下步驟：

(1)表面展示載體的構建

由蘇州金唯智生物科技有限公司合成兩條鈾酰離子結合七肽的編碼DNA序列，并連接到表面展示載體pYD1上，形成表達載體pYD-7-4和pYD-7-5(如圖3所示)。

(2)釀酒酵母細胞的轉(zhuǎn)化

活化釀酒酵母EBY100菌株，挑取5個單菌落至50mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，170rpm過夜培養(yǎng)至OD600至1.0。將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋于新的50mL YPD液體培養(yǎng)基中，使OD600為0.6，30℃，170rpm培養(yǎng)3h，測OD600達1.0。用50mL離心管收集菌體，2500rpm離心5min，棄上清，用40mL 1×TE重懸菌體。2500rpm繼續(xù)離心5min，棄上清，菌體用2mL 1×LiAc/0.5×TE重懸。30℃，80rpm溫育1h；分裝，每管100μl。在管中加入表達載體(pYD-7-4、pYD-7-5、pYD1)、SS-DNA及700μl 1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE，混合均勻；30℃溫育30min，后加入88μl DMSO，混合均勻。42℃熱激7min；4000rpm離心1min，除去上清，收集菌體。用1mL 1×TE重懸菌體，4000rpm繼續(xù)離心1min，去上清，菌體用100μl 1×TE重懸。涂布于MD選擇性平板，30℃倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)36h后，在MD選擇性平板上，有酵母菌落出現(xiàn)。

(3)釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的誘導表達及免疫熒光檢測

挑單菌落至10ml含有2％葡萄糖的YNB-CAA培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)過夜，至OD600于2～5之間，3000～5000rpm，室溫離心5～10min。雙蒸水洗滌沉淀，離心5min，重復2次。用含有2％半乳糖的YNB-CAA培養(yǎng)基重懸細胞，至OD600為0.5～1。20℃，180rpm震蕩培養(yǎng)24h，即為表達了結合七肽的酵母細胞。

取誘導后的細胞培養(yǎng)液，3000～5000rpm，4℃離心5～10min。1×PBS洗滌細胞，3000～5000rpm，4℃離心5～10min，重復三次。用250μl的1×PBS，1mg/ml BSA重懸細胞，加入1μg抗6×His標簽的免疫球蛋白(IgG)。冰浴30min，不時混勻，3000～5000rpm，4℃離心5～10min。1×PBS清洗細胞2次。250μl 1×PBS，1mg/ml BSA重懸細胞，加入1μg的抗鼠IgG-FITC。黑暗條件下冰浴30min，不時顛倒離心管。1ml 1×PBS清洗細胞2次。40μl 1×PBS重懸細胞，熒光顯微觀察(如圖4)。結果表明結合肽7-4、7-5在酵母細胞表面成功表達。將成功表達結合肽7-4、7-5的酵母工程菌分別命名為EBY100-7-4、EBY100-7-5，將表達了載體pYD1的酵母細胞命名為EBY100-pYD。

實施例3

本實施例中提供了一種鈾酰離子結合七肽在制備處理含鈾廢水的吸附材料中的應用，包括以下步驟：分別挑取酵母工程菌EBY100-7-4、EBY100-7-5單菌落至10ml含有2％葡萄糖的YNB-CAA培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)過夜，至OD600于2～5之間，3000～5000rpm，室溫離心5～10min。雙蒸水洗滌沉淀，離心5min，重復2次。用含有2％半乳糖的YNB-CAA培養(yǎng)基重懸細胞，至OD600為0.5～1。20℃，180rpm震蕩培養(yǎng)24h，收集細胞，雙蒸水洗滌，冷凍干燥后，即可用于含鈾廢水的處理。試驗設酵母細胞EBY100-pYD、EBY100處理為對照。

試驗例

(1)pH值對酵母工程菌吸附鈾酰離子的影響

準確量取50mL，25μg/ml的鈾標溶液于150ml的錐形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH調(diào)節(jié)pH值，使pH值分別為3.50、4.32、4.73、5.34、5.78、6.13、6.58、6.89、7.23。分別加入0.03g酵母工程菌EBY100-7-1、EBY100-7-4，在28℃，145rpm的恒溫振蕩器上吸附12h。13000rpm室溫離心5min，取上清，用偶氮胂Ⅲ光度法測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設置酵母細胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。

鈾酰離子的吸附量按照以下公式計算(下同)：

式中：q_e－吸附量，mg/g；V－溶液的體積，L；C_e－鈾酰離子溶液平衡濃度，mg/L；C₀－鈾酰離子溶液初始濃度，mg/L；m－吸附劑質(zhì)量，g。

結果顯示(如圖5)，溶液的初始pH值對吸附劑吸附鈾(VI)的性能影響顯著，當pH為4.73時，四種吸附劑對鈾酰離子的吸附量最大。其中酵母工程菌EBY100-7-4和EBY100-7-5對鈾酰離子的吸附量分別為80.83mg/g、79.47mg/g，顯著高于酵母細胞EBY100和EBY100-pYD。結果表明，鈾酰離子結合肽7-4、7-5在酵母細胞表面的展示顯著提高了細胞對鈾酰離子的吸附量。

(2)吸附時間對酵母工程菌吸附鈾酰離子的影響

準確量取50mL，25μg/ml的鈾標溶液于150ml的錐形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH調(diào)節(jié)pH值為4.73。分別加入0.03g酵母工程菌EBY100-7-1、EBY100-7-4，在28℃，145rpm的恒溫振蕩器上分別吸附0h、0.25h、0.75h、1h、2h、3h、4h、5h和6h。13000rpm室溫離心5min，取上清，用偶氮胂Ⅲ光度法測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設置酵母細胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。

結果顯示(如圖6)，隨著吸附時間的延長，四種細胞對鈾酰離子的吸附量逐漸增加，在3h時吸附基本達到平衡。其中酵母工程菌EBY100-7-4和EBY100-7-5對鈾酰離子的吸附量分別為80.30mg/g、80.35mg/g，比酵母細胞EBY100分別提高了26.71％和26.79％。

(3)初始濃度對酵母工程菌吸附鈾離子的影響

鈾酰離子的初始濃度是影響吸附的重要因素。設置鈾酰離子初始濃度分別為10、20、30、40、50、60、80、100mg/L。加入0.03g酵母工程菌EBY100-7-1、EBY100-7-4，在28℃，145rpm的恒溫振蕩器上吸附3h。13000rpm室溫離心5min，取上清，用偶氮胂Ⅲ光度法測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設置酵母細胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。

結果顯示(如圖7)，隨著鈾酰離子初始濃度的增加，四種細胞對鈾酰離子的吸附量不斷增加，其中酵母工程菌EBY100-7-4和EBY100-7-5對鈾酰離子的吸附量顯著高于酵母細胞EBY100-pYD和EBY100。表明鈾酰離子結合肽7-4、7-5增強了酵母細胞對鈾酰離子的吸附作用。

(4)吸附溫度對酵母工程菌吸附鈾酰離子的影響

準確量取50mL，50μg/ml的鈾標溶液于150ml的錐形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH調(diào)節(jié)pH值為4.73。分別加入0.03g酵母工程菌EBY100-7-1、EBY100-7-4，在不同溫度(288.15K、293.15K、298.15K、303.15K、308.15K、313.15K)下，145rpm的恒溫振蕩器上吸附3h。13000rpm室溫離心5min，取上清，用偶氮胂Ⅲ光度法測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設置酵母細胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。

結果顯示(如圖8)，試驗設置的6種溫度下，酵母工程菌EBY100-7-1、EBY100-7-4對鈾酰離子的吸附量均顯著高于酵母細胞EBY100和EBY100-pYD。表明鈾酰離子結合肽7-4、7-5增強了酵母細胞對鈾酰離子的吸附作用。

<110> 東華理工大學

<120> 鈾酰離子結合七肽

<160> 6

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<220>

<221> 短肽1

<222> (1)...(7)

<223>

<400> 1

Leu His Leu Pro Arg Met Thr

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<220>

<221> 短肽2

<222> (1)...(7)

<223>

<400> 2

Leu Ser Gln Arg Met Gln Arg

1 5

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<222> (1)...(21)

<223>

<400> 3

CTGCATCTTC CACGTATGAC T 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<222> (1)...(21)

<223>

<400> 4

CTCAGTCAGC GTATGCAGCG A 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<221> -28 gIII測序上游引物

<222> (1)...(22)

<223>

<400> 5

GTATGGGATT TTGCTAAACA AC 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<221> -96 gIII測序下游引物

<222> (1)...(20)

<223>

<400> 6

CCCTCATAGT TAGCGTAACG 20