本發(fā)明涉及能夠識別源自MAGE-A1抗原短肽的TCR，本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)導上述TCR來獲得的MAGE-A1特異性的T細胞，及他們在預防和治療MAGE-A1相關疾病中的用途。

背景技術：

MAGE-A1作為一種內(nèi)源性腫瘤抗原，在細胞內(nèi)生成后被降解成小分子多肽，并與MHC(主組織相容性復合體)分子結(jié)合形成復合物，被呈遞到細胞表面。研究顯示，KVLEYVIKV是衍生自MAGE-A1的短肽。MAGE-A1蛋白在多種腫瘤類型中均有表達，包括黑色素瘤，以及其他固體腫瘤如胃癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌等。對于上述疾病的治療，可以采用化療和放射性治療等方法，但都會對自身的正常細胞造成損害。

T細胞過繼免疫治療是將對靶細胞抗原具有特異性的反應性T細胞轉(zhuǎn)入病人體內(nèi)，使其針對靶細胞發(fā)揮作用。T細胞受體(TCR)是T細胞表面的一種膜蛋白，其能夠識別相應的靶細胞表面的抗原短肽。在免疫系統(tǒng)中，通過抗原短肽特異性的TCR與短肽-主組織相容性復合體(pMHC復合物)的結(jié)合引發(fā)T細胞與抗原呈遞細胞(APC)直接的物理接觸，然后T細胞及APC兩者的其他細胞膜表面分子就發(fā)生相互作用，引起一系列后續(xù)的細胞信號傳遞和其他生理反應，從而使得不同抗原特異性的T細胞對其靶細胞發(fā)揮免疫效應。因此，本領域技術人員致力于分離出對MAGE-A1抗原短肽具有特異性的TCR，以及將該TCR轉(zhuǎn)導T細胞來獲得對MAGE-A1抗原短肽具有特異性的T細胞，從而使他們在細胞免疫治療中發(fā)揮作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種識別MAGE-A1抗原短肽的T細胞受體。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種T細胞受體(TCR)，所述TCR能夠與KVLEYVIKV-HLA A0201復合物結(jié)合。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，所述TCRα鏈可變域的CDR3的氨基酸序列為AFPSGGGADGLT(SEQ ID NO:12)；和/或所述TCRβ鏈可變域的CDR3的氨基酸序列為ASSVEGYPSYEQY(SEQ ID NO:15)。

在另一優(yōu)選例中，所述TCRα鏈可變域的3個互補決定區(qū)(CDR)為：

αCDR1-SSNFYA (SEQ ID NO:10)

αCDR2-MTLNGDE (SEQ ID NO:11)

αCDR3-AFPSGGGADGLT (SEQ ID NO:12)；和/或

所述TCRβ鏈可變域的3個互補決定區(qū)為：

βCDR1-SGDLS (SEQ ID NO:13)

βCDR2-YYNGEE (SEQ ID NO:14)

βCDR3-ASSVEGYPSYEQY (SEQ ID NO:15)。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，所述TCRα鏈可變域為與SEQ ID NO:1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列；和/或所述TCRβ鏈可變域為與SEQ ID NO：5具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:1。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:5。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR為αβ異質(zhì)二聚體，其包含TCRα鏈恒定區(qū)TRAC*01和TCRβ鏈恒定區(qū)TRBC1*01或TRBC2*01。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈氨基酸序列為SEQ ID NO：3和/或所述TCR的β鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:7。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR是可溶的。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR為單鏈。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR是由α鏈可變域與β鏈可變域通過肽連接序列連接而成。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR在α鏈可變區(qū)氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或α鏈J基因短肽氨基酸倒數(shù)第3位、倒數(shù)第5位或倒數(shù)第7位中具有一個或多個突變；和/或所述TCR在β鏈可變區(qū)氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或β鏈J基因短肽氨基酸倒數(shù)第2位、倒數(shù)第4位或倒數(shù)第6位中具有一個或多個突變，其中氨基酸位置編號按IMGT(國際免疫遺傳學信息系統(tǒng))中列出的位置編號。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈可變域氨基酸序列包含SEQ ID NO:32和/或所述TCR的β鏈可變域氨基酸序列包含SEQ ID NO:34。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的氨基酸序列為SEQ ID NO:30。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包括(a)除跨膜結(jié)構域以外的全部或部分TCRα鏈；以及(b)除跨膜結(jié)構域以外的全部或部分TCRβ鏈；

并且(a)和(b)各自包含功能性可變結(jié)構域,或包含功能性可變結(jié)構域和所述TCR鏈恒定結(jié)構域的至少一部分。

在另一優(yōu)選例中，半胱氨酸殘基在所述TCR的α和β鏈恒定域之間形成人工二硫鍵。

在另一優(yōu)選例中，在所述TCR中形成人工二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了選自下列的一組或多組位點：

TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57；

TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77；

TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17；

TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59；

TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15；

TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54；

TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19；和

TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:26和/或所述TCR的β鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:28。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間含有人工鏈間二硫鍵。

在另一優(yōu)選例中，其特征在于，在所述TCR中形成人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了選自下列的一組或多組位點：

TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸；

TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位氨基酸；

TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸；或

TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結(jié)構域以外的全部或部分β鏈恒定域，但其不包含α鏈恒定域，所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質(zhì)二聚體。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈和/或β鏈的C-或N-末端結(jié)合有偶聯(lián)物。

在另一優(yōu)選例中，與所述T細胞受體結(jié)合的偶聯(lián)物為可檢測標記物、治療劑、PK修飾部分或任何這些物質(zhì)的組合。優(yōu)選地，所述治療劑為抗-CD3抗體。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種多價TCR復合物，其包含至少兩個TCR分子，并且其中的至少一個TCR分子為本發(fā)明第一方面所述的TCR。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發(fā)明第一方面所述的TCR分子的核酸序列或其互補序列。

在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子包含編碼TCRα鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:33。

在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子包含編碼TCRβ鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO:35。

在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子包含編碼TCRα鏈的核苷酸序列SEQ ID NO：4和/或包含編碼TCRβ鏈的核苷酸序列SEQ ID NO：8。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第三方面所述的核酸分子；優(yōu)選地，所述的載體為病毒載體；更優(yōu)選地，所述的載體為慢病毒載體。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種分離的宿主細胞，所述的宿主細胞中含有本發(fā)明第四方面所述的載體或基因組中整合有外源的本發(fā)明第三方面所述的核酸分子。

本發(fā)明的第六方面，提供了一種細胞，所述細胞轉(zhuǎn)導本發(fā)明第三方面所述的核酸分子或本發(fā)明第四方面所述的載體；優(yōu)選地，所述細胞為T細胞或干細胞。

本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有藥學上可接受的載體以及本發(fā)明第一方面所述的TCR、本發(fā)明第二方面所述的TCR復合物、本發(fā)明第三方面所述的核酸分子、本發(fā)明第四方面所述的載體、或本發(fā)明第六方面所述的細胞。

本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的T細胞受體、或本發(fā)明第二方面所述的TCR復合物、本發(fā)明第三方面所述的核酸分子、本發(fā)明第四方面所述的載體、或本發(fā)明第六方面所述的細胞的用途，用于制備治療腫瘤或自身免疫疾病的藥物。

本發(fā)明的第九方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適量的本發(fā)明第一方面所述的T細胞受體、或本發(fā)明第二方面所述的TCR復合物、本發(fā)明第三方面所述的核酸分子、本發(fā)明第四方面所述的載體、或本發(fā)明第六方面所述的細胞、或本發(fā)明第七方面所述的藥物組合物；

優(yōu)選地，所述的疾病為腫瘤，優(yōu)選地所述腫瘤包括黑色素瘤，以及其他實體腫瘤如胃癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等。

應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e和圖1f分別為TCRα鏈可變域氨基酸序列、TCRα鏈可變域核苷酸序列、TCRα鏈氨基酸序列、TCRα鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRα鏈氨基酸序列以及具有前導序列的TCRα鏈核苷酸序列。

圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為TCRβ鏈可變域氨基酸序列、TCRβ鏈可變域核苷酸序列、TCRβ鏈氨基酸序列、TCRβ鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRβ鏈氨基酸序列以及具有前導序列的TCRβ鏈核苷酸序列。

圖3為單克隆細胞的CD8⁺及四聚體-PE雙陽性染色結(jié)果。

圖4a和圖4b分別為可溶性TCRα鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖5a和圖5b分別為可溶性TCRβ鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖6為純化后得到的可溶性TCR的膠圖。最左側(cè)泳道為還原膠，中間泳道為分子量標記(marker)，最右側(cè)泳道為非還原膠。

圖7a和圖7b分別為單鏈TCR的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖8a和圖8b分別為單鏈TCRα鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖9a和圖9b分別為單鏈TCRβ鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖10a和圖10b分別為單鏈TCR連接序列(linker)的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖11為純化后得到的可溶性單鏈TCR的膠圖。左側(cè)泳道為分子量標記(marker)，右側(cè)泳道為非還原膠。

圖12為本發(fā)明可溶性TCR與KVLEYVIKV-HLA A0201復合物結(jié)合的ForteBio動力學圖譜。

圖13為本發(fā)明可溶性單鏈TCR與KVLEYVIKV--HLA A0201復合物結(jié)合的BIAcore動力學圖譜。

圖14為轉(zhuǎn)導本發(fā)明TCR的效應細胞的激活實驗結(jié)果。

圖15為轉(zhuǎn)導本發(fā)明TCR的效應細胞的殺傷實驗結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，找到了與MAGE-A1抗原短肽KVLEYVIKV(SEQ ID NO:9)能夠特異性結(jié)合的TCR，所述抗原短肽KVLEYVIKV可與HLA A0201形成復合物并一起被呈遞到細胞表面。本發(fā)明還提供了編碼所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的載體。另外，本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)導本發(fā)明TCR的細胞。

術語

MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)，可以是Ⅰ類或Ⅱ類MHC分子。因此，其對于抗原的呈遞具有特異性，不同的個體有不同的MHC，能呈遞一種蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC細胞表面。人類的MHC通常稱為HLA基因或HLA復合體。

T細胞受體(TCR)，是呈遞在主組織相容性復合體(MHC)上的特異性抗原肽的唯一受體。在免疫系統(tǒng)中，通過抗原特異性的TCR與pMHC復合物的結(jié)合引發(fā)T細胞與抗原呈遞細胞(APC)直接的物理接觸，然后T細胞及APC兩者的其他細胞膜表面分子就發(fā)生相互作用，這就引起了一系列后續(xù)的細胞信號傳遞和其他生理反應，從而使得不同抗原特異性的T細胞對其靶細胞發(fā)揮免疫效應。

TCR是由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異質(zhì)二聚體形式存在的細胞膜表面的糖蛋白。在95％的T細胞中TCR異質(zhì)二聚體由α和β鏈組成，而5％的T細胞具有由γ和δ鏈組成的TCR。天然αβ異質(zhì)二聚TCR具有α鏈和β鏈，α鏈和β鏈構成αβ異源二聚TCR的亞單位。廣義上講，α和β各鏈包含可變區(qū)、連接區(qū)和恒定區(qū)，β鏈通常還在可變區(qū)和連接區(qū)之間含有短的多變區(qū)，但該多變區(qū)常視作連接區(qū)的一部分。各可變區(qū)包含嵌合在框架結(jié)構(framework regions)中的3個CDR(互補決定區(qū))，CDR1、CDR2和CDR3。CDR區(qū)決定了TCR與pMHC復合物的結(jié)合，其中CDR3由可變區(qū)和連接區(qū)重組而成，被稱為超變區(qū)。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個“結(jié)構域”即可變域和恒定域，可變域由連接的可變區(qū)和連接區(qū)構成。TCR恒定域的序列可以在國際免疫遺傳學信息系統(tǒng)(IMGT)的公開數(shù)據(jù)庫中找到，如TCR分子α鏈的恒定域序列為“TRAC*01”，TCR分子β鏈的恒定域序列為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外，TCR的α和β鏈還包含跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，胞質(zhì)區(qū)很短。

在本發(fā)明中，術語“本發(fā)明多肽”、“本發(fā)明的TCR”、“本發(fā)明的T細胞受體”可互換使用。

天然鏈間二硫鍵與人工鏈間二硫鍵

在天然TCR的近膜區(qū)Cα與Cβ鏈間存在一組二硫鍵，本發(fā)明中稱為“天然鏈間二硫鍵”。在本發(fā)明中，將人工引入的，位置與天然鏈間二硫鍵的位置不同的鏈間共價二硫鍵稱為“人工鏈間二硫鍵”。

為方便描述二硫鍵的位置，本發(fā)明中TRAC*01與TRBC1*01或TRBC2*01氨基酸序列的位置編號按從N端到C端依次的順序進行位置編號，如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從N端到C端依次的順序第60個氨基酸為P(脯氨酸)，則本發(fā)明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Pro60，也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸，又如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從N端到C端依次的順序第61個氨基酸為Q(谷氨酰胺)，則本發(fā)明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Gln61，也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸，其他以此類推。本發(fā)明中，可變區(qū)TRAV與TRBV的氨基酸序列的位置編號，按照IMGT中列出的位置編號。如TRAV中的某個氨基酸，IMGT中列出的位置編號為46，則本發(fā)明中將其描述為TRAV第46位氨基酸，其他以此類推。本發(fā)明中，其他氨基酸的序列位置編號有特殊說明的，則按特殊說明。

發(fā)明詳述

TCR分子

在抗原加工過程中，抗原在細胞內(nèi)被降解，然后通過MHC分子攜帶至細胞表面。T細胞受體能夠識別抗原呈遞細胞表面的肽-MHC復合物。因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種能夠結(jié)合KVLEYVIKV-HLA A0201復合物的TCR分子。優(yōu)選地，所述TCR分子是分離的或純化的。該TCR的α和β鏈各具有3個互補決定區(qū)(CDR)。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述TCR的α鏈包含具有以下氨基酸序列的CDR：

αCDR1-SSNFYA (SEQ ID NO:10)

αCDR2-MTLNGDE (SEQ ID NO:11)

αCDR3-AFPSGGGADGLT (SEQ ID NO:12)；和/或

所述TCRβ鏈可變域的3個互補決定區(qū)為：

βCDR1-SGDLS (SEQ ID NO:13)

βCDR2-YYNGEE (SEQ ID NO:14)

βCDR3-ASSVEGYPSYEQY (SEQ ID NO:15)。

可以將上述本發(fā)明的CDR區(qū)氨基酸序列嵌入到任何適合的框架結(jié)構中來制備嵌合TCR。只要框架結(jié)構與本發(fā)明的TCR的CDR區(qū)兼容，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明公開的CDR區(qū)就能夠設計或合成出具有相應功能的TCR分子。因此，本發(fā)明TCR分子是指包含上述α和/或β鏈CDR區(qū)序列及任何適合的框架結(jié)構的TCR分子。本發(fā)明TCRα鏈可變域為與SEQ ID NO:1具有至少90％，優(yōu)選地95％，更優(yōu)選地98％序列相同性的氨基酸序列；和/或本發(fā)明TCRβ鏈可變域為與SEQ ID NO：5具有至少90％，優(yōu)選地95％，更優(yōu)選地98％序列相同性的氨基酸序列。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，本發(fā)明的TCR分子是由α與β鏈構成的異質(zhì)二聚體。具體地，一方面所述異質(zhì)二聚TCR分子的α鏈包含可變域和恒定域，所述α鏈可變域氨基酸序列包含上述α鏈的CDR1(SEQ ID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。優(yōu)選地，所述TCR分子包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更優(yōu)選地，所述TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:1。另一方面，所述異質(zhì)二聚TCR分子的β鏈包含可變域和恒定域，所述β鏈可變域氨基酸序列包含上述β鏈的CDR1(SEQ ID NO:13)、CDR2(SEQ ID NO：14)和CDR3(SEQ ID NO:15)。優(yōu)選地，所述TCR分子包含β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:5。更優(yōu)選地，所述TCR分子的β鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:5。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，本發(fā)明的TCR分子是由α鏈的部分或全部和/或β鏈的部分或全部組成的單鏈TCR分子。有關單鏈TCR分子的描述可以參考文獻Chung et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,12654-12658。根據(jù)文獻中所述，本領域技術人員能夠容易地構建包含本發(fā)明CDRs區(qū)的單鏈TCR分子。具體地，所述單鏈TCR分子包含Vα、Vβ和Cβ，優(yōu)選地按照從N端到C端的順序連接。

所述單鏈TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列包含上述α鏈的CDR1(SEQ ID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。優(yōu)選地，所述單鏈TCR分子包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更優(yōu)選地，所述單鏈TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:1。所述單鏈TCR分子的β鏈可變域氨基酸序列包含上述β鏈的CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ ID NO：14)和CDR3(SEQ ID NO：15)。優(yōu)選地，所述單鏈TCR分子包含β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:5。更優(yōu)選地，所述單鏈TCR分子的β鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:5。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，本發(fā)明的TCR分子的恒定域是人的恒定域。本領域技術人員知曉或可以通過查閱相關書籍或IMGT(國際免疫遺傳學信息系統(tǒng))的公開數(shù)據(jù)庫來獲得人的恒定域氨基酸序列。例如，本發(fā)明TCR分子α鏈的恒定域序列可以為“TRAC*01”，TCR分子β鏈的恒定域序列可以為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。IMGT的TRAC*01中給出的氨基酸序列的第53位為Arg，在此表示為：TRAC*01外顯子1的Arg53，其他以此類推。優(yōu)選地，本發(fā)明TCR分子α鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，和/或β鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO:7。

天然存在的TCR是一種膜蛋白，通過其跨膜區(qū)得以穩(wěn)定。如同免疫球蛋白(抗體)作為抗原識別分子一樣，TCR也可以被開發(fā)應用于診斷和治療，這時需要獲得可溶性的TCR分子?？扇苄缘腡CR分子不包括其跨膜區(qū)?？扇苄訲CR有很廣泛的用途，它不僅可用于研究TCR與pMHC的相互作用，也可用作檢測感染的診斷工具或作為自身免疫病的標志物。類似地，可溶性TCR可以被用來將治療劑(如細胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)輸送到呈遞特異性抗原的細胞，另外，可溶性TCR還可與其他分子(如，抗-CD3抗體)結(jié)合來重新定向T細胞，從而使其靶向呈遞特定抗原的細胞。本發(fā)明也獲得了對MAGE-A1抗原短肽具有特異性的可溶性TCR。

為獲得可溶性TCR，一方面，本發(fā)明TCR可以是在其α和β鏈恒定域的殘基之間引入人工二硫鍵的TCR。半胱氨酸殘基在所述TCR的α和β鏈恒定域間形成人工鏈間二硫鍵。半胱氨酸殘基可以取代在天然TCR中合適位點的其他氨基酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵。例如，取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基來形成二硫鍵。引入半胱氨酸殘基以形成二硫鍵的其他位點還可以是：TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77；TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17；TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59；TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15；TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54；TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19；或TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。即半胱氨酸殘基取代了上述α與β鏈恒定域中任一組位點?？稍诒景l(fā)明TCR恒定域的一個或多個C末端截短最多50個、或最多30個、或最多15個、或最多10個、或最多8個或更少的氨基酸，以使其不包括半胱氨酸殘基來達到缺失天然二硫鍵的目的，也可通過將形成天然二硫鍵的半胱氨酸殘基突變?yōu)榱硪话被醽磉_到上述目的。

如上所述，本發(fā)明的TCR可以包含在其α和β鏈恒定域的殘基間引入的人工二硫鍵。應注意，恒定域間含或不含上文所述的引入的人工二硫鍵，本發(fā)明的TCR均可含有TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列可通過存在于TCR中的天然二硫鍵連接。

為獲得可溶性TCR，另一方面，本發(fā)明TCR還包括在其疏水芯區(qū)域發(fā)生突變的TCR，這些疏水芯區(qū)域的突變優(yōu)選為能夠使本發(fā)明可溶性TCR的穩(wěn)定性提高的突變，如在公開號為WO2014/206304的專利文獻中所述。這樣的TCR可在其下列可變域疏水芯位置發(fā)生突變：(α和/或β鏈)可變區(qū)氨基酸第11，13，19，21，53，76，89，91，94位，和/或α鏈J基因(TRAJ)短肽氨基酸位置倒數(shù)第3,5,7位,和/或β鏈J基因(TRBJ)短肽氨基酸位置倒數(shù)第2,4,6位，其中氨基酸序列的位置編號按國際免疫遺傳學信息系統(tǒng)(IMGT)中列出的位置編號。本領域技術人員知曉上述國際免疫遺傳學信息系統(tǒng)，并可根據(jù)該數(shù)據(jù)庫得到不同TCR的氨基酸殘基在IMGT中的位置編號。

本發(fā)明中疏水芯區(qū)域發(fā)生突變的TCR可以是由一柔性肽鏈連接TCR的α與β鏈的可變域而構成的穩(wěn)定性可溶單鏈TCR。應注意，本發(fā)明中柔性肽鏈可以是任何適合連接TCRα與β鏈可變域的肽鏈。如在本發(fā)明實施例4中構建的單鏈可溶性TCR，其α鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:32，編碼的核苷酸序列為SEQ ID NO:33；β鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:34，編碼的核苷酸序列為SEQ ID NO:35。

另外，對于穩(wěn)定性而言，專利文獻201510260322.4還公開了在TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間引入人工鏈間二硫鍵能夠使TCR的穩(wěn)定性顯著提高。因此，本發(fā)明的高親和力TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間還可以含有人工鏈間二硫鍵。具體地，在所述TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間形成人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了：TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸；TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位氨基酸；TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸；或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸。優(yōu)選地，這樣的TCR可以包含(ⅰ)除其跨膜結(jié)構域以外的全部或部分TCRα鏈，和(ⅱ)除其跨膜結(jié)構域以外的全部或部分TCRβ鏈，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恒定域，α鏈與β鏈形成異質(zhì)二聚體。更優(yōu)選地，這樣的TCR可以包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結(jié)構域以外的全部或部分β鏈恒定域，但其不包含α鏈恒定域，所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質(zhì)二聚體。

本發(fā)明的TCR也可以多價復合體的形式提供。本發(fā)明的多價TCR復合體包含兩個、三個、四個或更多個本發(fā)明TCR相結(jié)合而形成的多聚物，如可以用p53的四聚結(jié)構域來產(chǎn)生四聚體，或多個本發(fā)明TCR與另一分子結(jié)合而形成的復合物。本發(fā)明的TCR復合物可用于體外或體內(nèi)追蹤或靶向呈遞特定抗原的細胞，也可用于產(chǎn)生具有此類應用的其他多價TCR復合物的中間體。

本發(fā)明的TCR可以單獨使用，也可與偶聯(lián)物以共價或其他方式結(jié)合，優(yōu)選以共價方式結(jié)合。所述偶聯(lián)物包括可檢測標記物(為診斷目的，其中所述TCR用于檢測呈遞KVLEYVIKV-HLA A0201復合物的細胞的存在)、治療劑、PK(蛋白激酶)修飾部分或任何以上這些物質(zhì)的組合結(jié)合或偶聯(lián)。

用于診斷目的的可檢測標記物包括但不限于：熒光或發(fā)光標記物、放射性標記物、MRI(磁共振成像)或CT(電子計算機X射線斷層掃描技術)造影劑、或能夠產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的酶。

可與本發(fā)明TCR結(jié)合或偶聯(lián)的治療劑包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌轉(zhuǎn)移評論(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌癥免疫學和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy)51，565)；3.細胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美國國家科學院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌癥免疫學和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌癥研究(Cancer Research)63，3202)；4.抗體Fc片段(Mosquera等，2005，免疫學雜志(The Journal Of Immunology)174，4381)；5.抗體scFv片段(Zhu等，1995，癌癥國際期刊(International Journal of Cancer)62,319)；6.金納米顆粒/納米棒(Lapotko等，2005，癌癥通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美國化學學會雜志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；7.病毒顆粒(Peng等，2004，基因治療(Gene therapy)11，1234)；8.脂質(zhì)體(Mamot等，2005，癌癥研究(Cancer research)65，11631)；9.納米磁粒；10.前藥激活酶(例如，DT-心肌黃酶(DTD)或聯(lián)苯基水解酶-樣蛋白質(zhì)(BPHL))；11.化療劑(例如，順鉑)或任何形式的納米顆粒等。

另外，本發(fā)明的TCR還可以是包含衍生自超過一種物種序列的雜合TCR。例如，有研究顯示鼠科TCR在人T細胞中比人TCR能夠更有效地表達。因此，本發(fā)明TCR可包含人可變域和鼠的恒定域。這一方法的缺陷是可能引發(fā)免疫應答。因此，在其用于過繼性T細胞治療時應當有調(diào)節(jié)方案來進行免疫抑制，以允許表達鼠科的T細胞的植入。

應理解，本文中氨基酸名稱采用國際通用的單英文字母或三英文字母表示，氨基酸名稱的單英文字母與三英文字母的對應關系如下：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。

核酸分子

本發(fā)明的第二方面提供了編碼本發(fā)明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子，所述部分可以是一個或多個CDR，α和/或β鏈的可變域，以及α鏈和/或β鏈。

編碼本發(fā)明第一方面TCR分子α鏈CDR區(qū)的核苷酸序列如下：

αCDR1-tccagcaatttttatgcc (SEQ ID NO:16)

αCDR2-atgactttaaatggggatgaa (SEQ ID NO:17)

αCDR3-gccttcccttcaggaggaggtgctgacggactcacc(SEQ ID NO:18)

編碼本發(fā)明第一方面TCR分子β鏈CDR區(qū)的核苷酸序列如下：

βCDR1-tctggagacctctct (SEQ ID NO:19)

βCDR2-tattataatggagaagag (SEQ ID NO:20)

βCDR3-gccagcagcgtagaaggctacccctcctacgagcagtac(SEQ ID NO:21)

因此，編碼本發(fā)明TCRα鏈的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，和/或編碼本發(fā)明TCRβ鏈的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。

本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈的，該核酸分子可以是RNA或DNA，并且可以包含或不包含內(nèi)含子。優(yōu)選地，本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列不包含內(nèi)含子但能夠編碼本發(fā)明多肽，例如編碼本發(fā)明TCRα鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2和/或編碼本發(fā)明TCRβ鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:6?；蛘?，編碼本發(fā)明TCRα鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:33和/或編碼本發(fā)明TCRβ鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:35。更優(yōu)選地，本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:8?；蛘撸景l(fā)明核酸分子的核苷酸序列為SEQ ID NO:31。

應理解，由于遺傳密碼的簡并，不同的核苷酸序列可以編碼相同的多肽。因此，編碼本發(fā)明TCR的核酸序列可以與本發(fā)明附圖中所示的核酸序列相同或是簡并的變異體。以本發(fā)明中的其中一個例子來說明，“簡并的變異體”是指編碼具有SEQ ID NO:1的蛋白序列，但與SEQ ID NO:2的序列有差別的核酸序列。

核苷酸序列可以是經(jīng)密碼子優(yōu)化的。不同的細胞在具體密碼子的利用上是不同的，可以根據(jù)細胞的類型，改變序列中的密碼子來增加表達量。哺乳動物細胞以及多種其他生物的密碼子選擇表是本領域技術人員公知的。

本發(fā)明的核酸分子全長序列或其片段通?？梢杂玫幌抻赑CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明TCR(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。

載體

本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸分子的載體，包括表達載體，即能夠在體內(nèi)或體外表達的構建體。常用的載體包括細菌質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。

病毒遞送系統(tǒng)包括但不限于腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體。

優(yōu)選地，載體可以將本發(fā)明的核苷酸轉(zhuǎn)移至細胞中，例如T細胞中，使得該細胞表達MAGE-A1抗原特異性的TCR。理想的情況下，該載體應當能夠在T細胞中持續(xù)高水平地表達。

細胞

本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的載體或編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞。所述宿主細胞中含有本發(fā)明的載體或染色體中整合有本發(fā)明的核酸分子。宿主細胞選自：原核細胞和真核細胞，例如大腸桿菌、酵母細胞、CHO細胞等。

另外，本發(fā)明還包括表達本發(fā)明的TCR的分離的細胞，特別是T細胞。該T細胞可衍生自從受試者分離的T細胞，或者可以是從受試者中分離的混合細胞群，諸如外周血淋巴細胞(PBL)群的一部分。如，該細胞可以分離自外周血單核細胞(PBMC)，可以是CD4⁺輔助T細胞或CD8⁺細胞毒性T細胞。該細胞可在CD4⁺輔助T細胞/CD8⁺細胞毒性T細胞的混合群中。一般地，該細胞可以用抗體(如，抗-CD3或抗-CD28的抗體)活化，以便使它們能夠更容易接受轉(zhuǎn)染，例如用包含編碼本發(fā)明TCR分子的核苷酸序列的載體進行轉(zhuǎn)染。

備選地，本發(fā)明的細胞還可以是或衍生自干細胞，如造血干細胞(HSC)。將基因轉(zhuǎn)移至HSC不會導致在細胞表面表達TCR，因為干細胞表面不表達CD3分子。然而，當干細胞分化為遷移至胸腺的淋巴前體(lymphoid precursor)時，CD3分子的表達將啟動在胸腺細胞的表面表達該引入的TCR分子。

有許多方法適合于用編碼本發(fā)明TCR的DNA或RNA進行T細胞轉(zhuǎn)染(如，Robbins等.，(2008)J.Immunol.180:6116-6131)。表達本發(fā)明TCR的T細胞可以用于過繼免疫治療。本領域技術人員能夠知曉進行過繼性治療的許多合適方法(如，Rosenberg等.，(2008)Nat Rev Cancer8(4)：299-308)。

MAGE-A1抗原相關疾病

本發(fā)明還涉及在受試者中治療和/或預防與MAGE-A1相關疾病的方法，其包括過繼性轉(zhuǎn)移MAGE-A1特異性T細胞至該受試者的步驟。該MAGE-A1特異性T細胞可識別KVLEYVIKV-HLA A0201復合物。

本發(fā)明的MAGE-A1特異性的T細胞可用于治療任何呈遞MAGE-A1抗原短肽KVLEYVIKV-HLA A0201復合物的MAGE-A1相關疾病。包括但不限于腫瘤，如黑色素瘤，以及其他實體腫瘤如胃癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等。

治療方法

可以通過分離患有與MAGE-A1抗原相關疾病的病人或志愿者的T細胞，并將本發(fā)明的TCR導入上述T細胞中，隨后將這些基因工程修飾的細胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)來進行治療。因此，本發(fā)明提供了一種治療MAGE-A1相關疾病的方法，包括將分離的表達本發(fā)明TCR的T細胞，優(yōu)選地，該T細胞來源于病人本身，輸入到病人體內(nèi)。一般地，包括(1)分離病人的T細胞，(2)用本發(fā)明核酸分子或能夠編碼本發(fā)明TCR分子的核酸分子體外轉(zhuǎn)導T細胞，(3)將基因工程修飾的T細胞輸入到病人體內(nèi)。分離、轉(zhuǎn)染及回輸?shù)募毎臄?shù)量可以由醫(yī)師決定。

本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明的TCR能夠與MAGE-A1抗原短肽復合物KVLEYVIKV-HLA A0201結(jié)合，同時轉(zhuǎn)導了本發(fā)明TCR的細胞能夠被特異性激活并且對靶細胞具有很強的殺傷作用。

下面的具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。

實施例1 克隆MAGE-A1抗原短肽特異性T細胞

利用合成短肽KVLEYVIKV(SEQ ID NO.:9；北京賽百盛基因技術有限公司)刺激來自于基因型為HLA-A0201的健康志愿者的外周血淋巴細胞(PBL)。將KVLEYVIKV短肽與帶有生物素標記的HLA-A0201復性,制備pHLA單倍體。這些單倍體與用PE標記的鏈霉親和素(BD公司)組合成PE標記的四聚體，分選該四聚體及抗-CD8-APC雙陽性細胞。擴增分選的細胞，并按上述方法進行二次分選，隨后用有限稀釋法進行單克隆。單克隆細胞用四聚體染色，篩選到的雙陽性克隆如圖3所示。

實施例2 獲取MAGE-A1抗原短肽特異性T細胞克隆的TCR基因與載體的構建

用Quick-RNA^TM MiniPrep(ZYMO research)抽提實施例1中篩選到的抗原短肽KVLEYVIKV特異性、HLA-A0201限制性的T細胞克隆的總RNA。cDNA的合成采用clontech的SMART RACE cDNA擴增試劑盒，采用的引物是設計在人類TCR基因的C端保守區(qū)。將序列克隆至T載體(TAKARA)上進行測序。應注意，該序列為互補序列，不包含內(nèi)含子。經(jīng)測序，該雙陽性克隆表達的TCR的α鏈和β鏈序列結(jié)構分別如圖1和圖2所示，圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e和圖1f分別為TCRα鏈可變域氨基酸序列、TCRα鏈可變域核苷酸序列、TCRα鏈氨基酸序列、TCRα鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRα鏈氨基酸序列以及具有前導序列的TCRα鏈核苷酸序列；圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為TCRβ鏈可變域氨基酸序列、TCRβ鏈可變域核苷酸序列、TCRβ鏈氨基酸序列、TCRβ鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRβ鏈氨基酸序列以及具有前導序列的TCRβ鏈核苷酸序列。

經(jīng)鑒定，α鏈包含具有以下氨基酸序列的CDR：

αCDR1-SSNFYA (SEQ ID NO:10)

αCDR2-MTLNGDE (SEQ ID NO:11)

αCDR3-AFPSGGGADGLT (SEQ ID NO:12)

β鏈包含具有以下氨基酸序列的CDR：

βCDR1-SGDLS (SEQ ID NO:13)

βCDR2-YYNGEE (SEQ ID NO:14)

βCDR3-ASSVEGYPSYEQY (SEQ ID NO:15)

通過重疊(overlap)PCR分別將TCRα鏈和β鏈的全長基因克隆至慢病毒表達載體pLenti(addgene)。具體為：用overlap PCR將TCRα鏈和TCRβ鏈的全長基因進行連接得到TCRα-2A-TCRβ片段。將慢病毒表達載體及TCRα-2A-TCRβ酶切連接得到pLenti-TRA-2A-TRB-IRES-NGFR質(zhì)粒。作為對照用,同時也構建表達eGFP的慢病毒載體pLenti-eGFP。之后再用293T/17包裝假病毒。

實施例3 MAGE-A1抗原短肽特異性可溶TCR的表達、重折疊和純化

為獲得可溶的TCR分子，本發(fā)明的TCR分子的α和β鏈可以分別只包含其可變域及部分恒定域，并且α和β鏈的恒定域中分別引入了一個半胱氨酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵，引入半胱氨酸殘基的位置分別為TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC2*01外顯子1的Ser57；其α鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別如圖4a和圖4b所示，其β鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別如圖5a和圖5b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗和加下劃線字母表示。通過＜＜分子克隆實驗室手冊＞＞(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的標準方法將上述TCRα和β鏈的目的基因序列經(jīng)合成后分別插入到表達載體pET28a+(Novagene)，上下游的克隆位點分別是NcoI和NotI。插入片段經(jīng)過測序確認無誤。

將TCRα和β鏈的表達載體分別通過化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進入表達細菌BL21(DE3),細菌用LB培養(yǎng)液生長，于OD₆₀₀＝0.6時用終濃度0.5mM IPTG誘導，TCR的α和β鏈表達后形成的包涵體通過BugBuster Mix(Novagene)進行提取，并且經(jīng)BugBuster溶液反復多次洗滌，包涵體最后溶解于6M鹽酸胍,10mM二硫蘇糖醇(DTT),10mM乙二胺四乙酸(EDTA),20mM Tris(pH 8.1)中。

溶解后的TCRα和β鏈以1：1的質(zhì)量比快速混合于5M尿素,0.4M精氨酸,20mM Tris(pH 8.1),3.7mM cystamine,6.6mMβ-mercapoethylamine(4℃)中，終濃度為60mg/mL?；旌虾髮⑷芤褐糜?0倍體積的去離子水中透析(4℃)，12小時后將去離子水換成緩沖液(20mM Tris,pH 8.0)繼續(xù)于4℃透析12小時。透析完成后的溶液經(jīng)0.45μM的濾膜過濾后，通過陰離子交換柱(HiTrap Q HP,5ml,GE Healthcare)純化。洗脫峰含有復性成功的α和β二聚體的TCR通過SDS-PAGE膠確認。TCR隨后通過凝膠過濾層析(HiPrep 16/60，Sephacryl S-100HR，GE Healthcare)進一步純化。純化后的TCR純度經(jīng)過SDS-PAGE測定大于90％，濃度由BCA法確定。本發(fā)明得到的可溶性TCR的SDS-PAGE膠圖如圖6所示。

實施例4 MAGE-A1抗原短肽特異性的可溶性單鏈TCR的產(chǎn)生

根據(jù)專利文獻WO2014/206304中所述，利用定點突變的方法將實施例2中TCRα與β鏈的可變域構建成了一個以柔性短肽(linker)連接的穩(wěn)定的可溶性單鏈TCR分子。該單鏈TCR分子的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖7a和圖7b所示。其α鏈可變域的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖8a和圖8b所示；其β鏈可變域的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖9a和圖9b所示；其linker序列的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖10a和圖10b所示。

將目的基因經(jīng)Nco Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切，與經(jīng)過Nco Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切的pET28a載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆進行PCR篩選，對陽性重組子進行測序，確定序列正確后抽提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3),用于表達。

實施例5 MAGE-A1抗原短肽特異性的可溶性單鏈TCR的表達、復性和純化

將實施例4中制備的含有重組質(zhì)粒pET28a-模板鏈的BL21(DE 3)菌落全部接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.5mM，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。5000rpm離心15min收獲細胞沉淀物，用Bugbuster Master Mix(Merck)裂解細胞沉淀物，6000rpm離心15min回收包涵體，再用Bugbuster(Merck)進行洗滌以除去細胞碎片和膜組分，6000rpm離心15min,收集包涵體。將包涵體溶解在緩沖液(20mM Tris-HCl pH 8.0,8M尿素)中，高速離心去除不溶物，上清液用BCA法定量后進行分裝，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

向5mg溶解的單鏈TCR包涵體蛋白中，加入2.5mL緩沖液(6M Gua-HCl，50mM Tris-HCl pH 8.1，100mM NaCl，10mM EDTA)，再加入DTT至終濃度為10mM,37℃處理30min。用注射器向125mL復性緩沖液(100mM Tris-HCl pH 8.1,0.4M L-精氨酸,5M尿素,2mM EDTA,6.5mMβ-mercapthoethylamine,1.87mM Cystamine)中滴加上述處理后的單鏈TCR，4℃攪拌10min，然后將復性液裝入截留量為4kDa的纖維素膜透析袋,透析袋置于1L預冷的水中，4℃緩慢攪拌過夜。17小時后，將透析液換成1L預冷的緩沖液(20mM Tris-HCl pH 8.0)，4℃繼續(xù)透析8h，然后將透析液換成相同的新鮮緩沖液繼續(xù)透析過夜。17小時后，樣品經(jīng)0.45μm濾膜過濾，真空脫氣后通過陰離子交換柱(HiTrap Q HP,GE Healthcare)，用20mM Tris-HCl pH 8.0配制的0-1M NaCl線性梯度洗脫液純化蛋白，收集的洗脫組分進行SDS-PAGE分析，包含單鏈TCR的組分濃縮后進一步用凝膠過濾柱(Superdex 7510/300,GE Healthcare)進行純化，目標組分也進行SDS-PAGE分析。

用于BIAcore分析的洗脫組分進一步采用凝膠過濾法測試其純度。條件為：色譜柱Agilent Bio SEC-3(300A，φ7.8×300mm)，流動相為150mM磷酸鹽緩沖液，流速0.5mL/min，柱溫25℃，紫外檢測波長214nm。

本發(fā)明獲得的可溶性單鏈TCR的SDS-PAGE膠圖如圖11所示。

實施例6 結(jié)合表征

本實施例證明了可溶性的本發(fā)明TCR分子能夠與KVLEYVIKV-HLA A0201復合物特異性結(jié)合。

分別使用ForteBio(Octet QKe System)和BIAcore(T200)實時分析系統(tǒng)檢測實施例3和實施例5中得到的TCR分子與KVLEYVIKV-HLA A0201復合物的結(jié)合活性。將抗鏈霉親和素的抗體(GenScript)加入偶聯(lián)緩沖液(10mM醋酸鈉緩沖液，pH 4.77)，然后將抗體流過預先用EDC和NHS活化過的CM5芯片，使抗體固定在芯片表面，最后用乙醇胺的鹽酸溶液封閉未反應的活化表面，完成偶聯(lián)過程，偶聯(lián)水平約為15,000RU。

使低濃度的鏈霉親和素流過已包被抗體的芯片表面，然后將KVLEYVIKV-HLA A0201復合物流過檢測通道，另一通道作為參比通道，再將0.05mM的生物素以10μL/min的流速流過芯片2min，封閉鏈霉親和素剩余的結(jié)合位點。

上述KVLEYVIKV-HLA A0201復合物的制備過程如下：

a.純化

收集100ml誘導表達重鏈或輕鏈的E.coli菌液，于4℃8000g離心10min后用10ml PBS洗滌菌體一次，之后用5ml BugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck)劇烈震蕩重懸菌體，并于室溫旋轉(zhuǎn)孵育20min，之后于4℃，6000g離心15min，棄去上清，收集包涵體。

將上述包涵體重懸于5ml BugBuster Master Mix中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育5min；加30ml稀釋10倍的BugBuster，混勻，4℃6000g離心15min；棄去上清，加30ml稀釋10倍的BugBuster重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，重復兩次，加30ml 20mM Tris-HCl pH 8.0重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，最后用20mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵體，SDS-PAGE檢測包涵體純度，BCA試劑盒測濃度。

b.復性

將合成的短肽KVLEYVIKV(北京賽百盛基因技術有限公司)溶解于DMSO至20mg/ml的濃度。輕鏈和重鏈的包涵體用8M尿素、20mM Tris pH 8.0、10mM DTT來溶解，復性前加入3M鹽酸胍、10mM醋酸鈉、10mM EDTA進一步變性。將KVLEYVIKV肽以25mg/L(終濃度)加入復性緩沖液(0.4M L-精氨酸、100mM Tris pH 8.3、2mM EDTA、0.5mM氧化性谷胱甘肽、5mM還原型谷胱甘肽、0.2mM PMSF，冷卻至4℃)，然后依次加入20mg/L的輕鏈和90mg/L的重鏈(終濃度，重鏈分三次加入，8h/次)，復性在4℃進行至少3天至完成，SDS-PAGE檢測能否復性成功。

c.復性后純化

用10體積的20mM Tris pH 8.0作透析來更換復性緩沖液，至少更換緩沖液兩次來充分降低溶液的離子強度。透析后用0.45μm醋酸纖維素濾膜過濾蛋白質(zhì)溶液，然后加載到HiTrap Q HP(GE通用電氣公司)陰離子交換柱上(5ml床體積)。利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，20mM Tris pH 8.0配制的0-400mM NaCl線性梯度液洗脫蛋白，pMHC約在250mM NaCl處洗脫，收集諸峰組分，SDS-PAGE檢測純度。

d.生物素化

用Millipore超濾管將純化的pMHC分子濃縮，同時將緩沖液置換為20mM Tris pH 8.0，然后加入生物素化試劑0.05M Bicine pH 8.3、10mM ATP、10mM MgOAc、50μM D-Biotin、100μg/ml BirA酶(GST-BirA)，室溫孵育混合物過夜，SDS-PAGE檢測生物素化是否完全。

e.純化生物素化后的復合物

用Millipore超濾管將生物素化標記后的pMHC分子濃縮至1ml，采用凝膠過濾層析純化生物素化的pMHC，利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，用過濾過的PBS預平衡HiPrep^TM16/60S200HR柱(GE通用電氣公司)，加載1ml濃縮過的生物素化pMHC分子，然后用PBS以1ml/min流速洗脫。生物素化的pMHC分子在約55ml時作為單峰洗脫出現(xiàn)。合并含有蛋白質(zhì)的組分，用Millipore超濾管濃縮，BCA法(Thermo)測定蛋白質(zhì)濃度，加入蛋白酶抑制劑cocktail(Roche)將生物素化的pMHC分子分裝保存在-80℃。

分別利用Data Analysis 7.1和BIAcore Evaluation軟件計算動力學參數(shù)，得到本發(fā)明可溶性的TCR分子以及本發(fā)明構建的可溶性單鏈TCR分子與KVLEYVIKV-HLA A0201復合物結(jié)合的動力學圖譜分別如圖12和圖13所示。圖譜顯示，本發(fā)明得到的可溶性TCR分子以及可溶性單鏈TCR分子都能夠與KVLEYVIKV-HLA A0201復合物結(jié)合。同時，還利用上述方法檢測了本發(fā)明可溶性的TCR分子與其他幾種無關抗原短肽與HLA復合物的結(jié)合活性，結(jié)果顯示本發(fā)明TCR分子與其他無關抗原均無結(jié)合。

實施例7 MAGE A1抗原短肽特異性TCR慢病毒包裝與原代T細胞轉(zhuǎn)染

(a)通過293T細胞的快速介導瞬時轉(zhuǎn)染(Express-In-mediated transient transfection)制備慢病毒

利用第三代慢病毒包裝系統(tǒng)包裝含有編碼所需TCR的基因的慢病毒。利用快速介導瞬時轉(zhuǎn)染(Express-In-mediated transient transfection)(開放生物系統(tǒng)公司(Open Biosystems))，用4種質(zhì)粒(含有實施例2所述pLenti-RHAMMTRA-2A-TRB-IRES-NGFR的一種慢病毒載體，以及含有構建傳染性但非復制型慢病毒顆粒所必需的其他組分的3種質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染293T細胞。

為進行轉(zhuǎn)染，第0天種細胞，在15厘米培養(yǎng)皿，種上1.7×10⁷個293T細胞，使細胞均勻分布在培養(yǎng)皿上，匯合度略高于50％。第1天轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，包裝pLenti-TRA-2A-TRB-IRES-NGFR和pLenti-eGFP假病毒，將以上表達質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pMDLg/pRRE,pRSV-REV和pMD.2G混勻，一個15厘米直徑平皿的用量如下：22.5微克：15微克:15微克：7.5微克。轉(zhuǎn)染試劑PEI-MAX與質(zhì)粒的比例是2:1，每個平皿PEI-MAX的使用量為120微克。具體操作為：把表達質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒加入1800微升OPTI-MEM((吉布可公司(Gibco)，目錄號31985-070)培養(yǎng)基中混合均勻，室溫靜置5分鐘成為DNA混合液；取相應量PEI與1800微升OPTI-MEM培養(yǎng)基混合均勻，室溫靜置5分鐘成為PEI混合液。把DNA混合液和PEI混合液混合在一起并在室溫靜置30分鐘，再添加3150微升OPTI-MEM培養(yǎng)基，混合均勻后加入到已經(jīng)轉(zhuǎn)換成11.25毫升OPTI-MEM的293T細胞中，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基混合均勻，37℃/5％CO2下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染5-7小時，去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，換成含有10％胎牛血清的DMEM((吉布可公司(Gibco)，目錄號C11995500bt))完全培養(yǎng)基，37℃/5％CO₂下培養(yǎng)。第3和第4天收集含有包裝的慢病毒的培養(yǎng)基上清。為收獲包裝的慢病毒，把所收集到的培養(yǎng)上清3000g離心15分鐘去除細胞碎片，再經(jīng)0.22微米過濾器(默克密理博(Merck Millipore)，目錄號SLGP033RB)過濾，最后用50KD截留量的濃縮管(默克密理博(Merck Millipore)，目錄號UFC905096)進行濃縮，除去大部分上清液，最后濃縮到1毫升，等分分裝后-80℃凍存。取假病毒樣品進行病毒滴度測定，步驟參照p24ELISA(Clontech，目錄號632200)試劑盒說明書。作為對照用，同時也包轉(zhuǎn)pLenti-eGFP的假病毒。

(b)用含有MAGE A1抗原短肽特異性的T細胞受體基因的慢病毒轉(zhuǎn)導原代T細胞

從健康志愿者的血液中分離到CD8+T細胞，再用包裝的慢病毒轉(zhuǎn)導。計數(shù)這些細胞，在48孔板中，在含有50IU/ml IL-2和10ng/ml IL-7的含10％FBS(吉布可公司(Gibco)，目錄號C10010500BT)的1640(吉布可公司(Gibco)，目錄號C11875500bt)培養(yǎng)基中以1×10⁶個細胞/毫升(0.5毫升/孔)與預洗滌的抗CD3/CD28抗體-包被小珠(T細胞擴增物，life technologies，目錄號11452D)共孵育過夜刺激，細胞：珠＝3：1。

刺激過夜后，根據(jù)p24ELISA試劑盒所測到的病毒滴度，按MOI＝10的比例加入已濃縮的MAGE A1抗原短肽特異性T細胞受體基因的慢病毒，32℃，900g離心感染1小時。感染完畢后去除慢病毒感染液，用含有50IU/ml IL-2和10ng/ml IL-7的含10％FBS的1640培養(yǎng)基重懸細胞，37℃/5％CO₂下培養(yǎng)3天。次日按同樣方法進行第二輪感染。第二次轉(zhuǎn)導3天后計數(shù)細胞，稀釋細胞至0.5×10⁶個細胞/毫升。每兩天計數(shù)一次細胞，替換或加入含有50IU/ml IL-2和10ng/ml IL-7的新鮮培養(yǎng)基，維持細胞在0.5×10⁶-1×10⁶個細胞/毫升。從第3天開始通過流式細胞術分析細胞，從第5天開始用于功能試驗(例如，IFN-γ釋放的ELISPOT和非放射性細胞毒性檢測)。從第10天開始或在細胞減緩分裂和尺寸變小之時，冷凍儲存等分細胞，至少4×10⁶個細胞/管(1×10⁷個細胞/毫升，90％FBS/10％DMSO)。

實施例8 轉(zhuǎn)導本發(fā)明TCR的T細胞的激活實驗

ELISPOT方案

進行以下試驗以證明TCR轉(zhuǎn)導的T細胞對靶細胞特異性的激活反應。利用ELISPOT試驗檢測的IFN-γ產(chǎn)量作為T細胞激活的讀出值。

試劑

試驗培養(yǎng)基：10％FBS(吉布可公司(Gibco)，目錄號16000-044)，RPMI1640(吉布可公司(Gibco)，目錄號C11875500bt)

洗滌緩沖液(PBST)：0.01M PBS/0.05％吐溫20

PBS(吉布可公司(Gibco)，目錄號C10010500BT)

PVDF ELISPOT 96孔板(默克密理博(Merck Millipore)，目錄號MSIPS4510)

人IFN-γELISPOT PVDF-酶試劑盒(BD)裝有所需的所有其他試劑(捕捉和檢測抗體，鏈霉親和素-堿性磷酸酶和BCIP/NBT溶液)

方法

靶細胞制備

本實驗中所用的靶細胞為T2細胞。在實驗培養(yǎng)基中制備靶細胞：靶細胞濃度調(diào)至2.0×10⁵個/毫升，每孔取100微升從而得2.0×10⁴個細胞/孔。

效應細胞制備

本實驗的效應細胞(T細胞)是實施例7中經(jīng)流式細胞術分析表達本發(fā)明MAGE A1抗原短肽特異性TCR的CD8+T細胞，并以同一志愿者未轉(zhuǎn)染本發(fā)明TCR的CD8+T作為對照組。用抗CD3/CD28包被珠(T細胞擴增物，life technologies)刺激T細胞，用攜帶MAGE A1抗原短肽特異性TCR基因的慢病毒轉(zhuǎn)導(依據(jù)實施例7)，在含有50IU/ml IL-2和10ng/ml IL-7的含10％FBS的1640培養(yǎng)基擴增直至轉(zhuǎn)導后9-12天，然后將這些細胞置于試驗培養(yǎng)基中，300g常溫離心10分鐘進行洗滌。然后將細胞以2×所需終濃度重懸在試驗培養(yǎng)基中。同樣處理陰性對照效應細胞。

短肽溶液制備

在相應靶細胞(T2)實驗組加入對應短肽，使短肽在ELISPOT孔板中的終濃度為1μg/ml。

ELISPOT

按照生產(chǎn)商提供的說明書，如下所述準備孔板：以每塊板10毫升無菌PBS按1：200稀釋抗人IFN-γ捕捉抗體，然后將100微升的稀釋捕捉抗體等分加入各孔。4℃下孵育孔板過夜。孵育后，洗滌孔板以除去多余的捕捉抗體。加入100微升/孔含有10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，并在室溫下溫育孔板2小時以封閉孔板。然后從孔板中洗去培養(yǎng)基，通過在紙上輕彈和輕拍ELISPOT孔板以除去任何殘余的洗滌緩沖液。

然后采用以下順序?qū)⒃囼灥闹T組分加入ELISPOT孔板：

100微升靶細胞2*10⁵個細胞/毫升(得到總共約2*10⁴個靶細胞/孔)。

100微升效應細胞(1*10⁴個對照效應細胞/孔和MAGE A1 TCR陽性T細胞/孔)。

所有孔一式兩份制備添加。

然后溫育孔板過夜(37℃/5％CO₂)第二天，棄培養(yǎng)基，用雙蒸水洗滌孔板2次，再用洗滌緩沖液洗滌3次，在紙巾上輕拍以除去殘余的洗滌緩沖液。然后用含有10％FBS的PBS按1：200稀釋檢測抗體，按100微升/孔加入各孔。室溫下溫育孔板2小時，再用洗滌緩沖液洗滌3次，在紙巾上輕拍孔板以除去過量的洗滌緩沖液。

用含有10％FBS的PBS按1：100稀釋鏈霉親和素-堿性磷酸酶，將100微升稀釋的鏈霉親和素-堿性磷酸酶加入各孔并在室溫下溫育孔板1小時。然后用洗滌緩沖液洗滌4次PBS洗滌2次，在紙巾上輕拍孔板以除去過量的洗滌緩沖液和PBS。洗滌完畢后加入試劑盒提供的BCIP/NBT溶液100微升/孔進行顯影。在顯影期間用錫箔紙覆蓋孔板避光，靜置5-15分鐘。在此期間常規(guī)檢測顯影孔板的斑點，確定終止反應的最佳時間。去除BCIP/NBT溶液并用雙蒸水沖洗孔板以中止顯影反應，甩干，然后將孔板底部去除，在室溫下干燥孔板直至每個孔完全干燥，再利用免疫斑點平板計數(shù)計(CTL，細胞技術有限公司(Cellular Technology Limited))計數(shù)孔板內(nèi)底膜形成的斑點。

結(jié)果

通過ELISPOT實驗(如上所述)檢驗本發(fā)明TCR轉(zhuǎn)導的T細胞對負載MAGE A1抗原短肽GLSNLTHVL的靶細胞起反應的IFN-γ釋放。利用graphpad prism6繪制各孔中觀察到的ELSPOT斑點數(shù)量。

實驗結(jié)果如圖14所示，轉(zhuǎn)導本發(fā)明TCR的T細胞對負載其特異的短肽的靶細胞有很好的激活反應，而未轉(zhuǎn)導本發(fā)明TCR的T細胞基本沒有激活反應。

實施例9 轉(zhuǎn)導本發(fā)明TCR的細胞的殺傷實驗

本實施例通過非放射性細胞毒性實驗，測定LDH的釋放，從而驗證轉(zhuǎn)導本發(fā)明TCR的細胞的殺傷功能。該試驗是51Cr釋放細胞毒性試驗的比色替代試驗，定量測定細胞裂解后釋放的乳酸脫氫酶(LDH)。采用30分鐘偶聯(lián)的酶反應來檢測釋放在培養(yǎng)基中的LDH，在酶反應中LDH可使一種四唑鹽(INT)轉(zhuǎn)化為紅色的甲臜(formazan)。生成的紅色產(chǎn)物的量與裂解的細胞數(shù)成正比?？梢杂脴藴实?6孔讀板計收集490nm可見光吸光值數(shù)據(jù)。

本領域技術人員熟知利用LDH的釋放實驗檢測細胞功能的方法。本實施例效應細胞(T細胞)是實施例7中經(jīng)流式細胞術分析表達本發(fā)明MAGE A1抗原短肽特異性TCR的CD8+T細胞，靶細胞系為293T和U266B1。根據(jù)nanostring結(jié)果，其中，U266B1表達MAGE A1抗原，293T基本不表達MAGE A1抗原，以此作為對照。

首先準備LDH平板。實驗第1天，按以下順序?qū)⒃囼灥母鱾€組分加入平板：培養(yǎng)基調(diào)整效應細胞至2X10⁶個細胞/毫升，培養(yǎng)基調(diào)整各靶細胞系至5X10⁵個細胞/毫升。混合均勻后取100μL靶細胞系5X10⁵個細胞/毫升(即50,000個細胞/孔)、100μL效應細胞2X10⁶個細胞/毫升(即200,000個細胞/孔)加入對應孔中，并設置三個復孔。同時設置效應細胞自發(fā)孔，靶細胞自發(fā)孔，靶細胞最大孔，體積校正對照孔及培養(yǎng)基背景對照孔。溫育過夜(37℃，5％CO₂)。實驗第2天，檢測顯色，終止反應后用酶標儀(Bioteck)在490nm記錄吸光值。實驗結(jié)果如圖15所示，圖中曲線NC-293T為未轉(zhuǎn)染本發(fā)明TCR的效應細胞對293T細胞系的反應；曲線NC-U266B1為未轉(zhuǎn)染本發(fā)明TCR的效應細胞對U266B1細胞系的反應；曲線TCR-293T為轉(zhuǎn)染本發(fā)明TCR的效應細胞對293T細胞系的反應；曲線TCR-U266B1為轉(zhuǎn)染本發(fā)明TCR的效應細胞對U266B1細胞系的反應。從結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)導本發(fā)明TCR的效應細胞對表達相關抗原的靶細胞具有殺傷作用，而對不表達相關抗原的靶細胞基本沒有殺傷作用。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

序列表

<110> 廣州市香雪制藥股份有限公司

<120> 識別MAGE-A1抗原短肽的T細胞受體

<130> P2017-0068

<150> CN201610190650.6

<151> 2016-03-29

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRα鏈可變域

<400> 1

Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu Gly

1 5 10 15

Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro Ser Ser Asn Phe Tyr Ala

20 25 30

Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Ala Leu Phe

35 40 45

Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser Ala

50 55 60

Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Lys Gly Ser

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe Pro Ser Gly Gly

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr His Leu Ile Ile Gln

100 105 110

Pro Tyr

<210> 2

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRα鏈可變域

<400> 2

atactgaacg tggaacaaag tcctcagtca ctgcatgttc aggagggaga cagcaccaat 60

ttcacctgca gcttcccttc cagcaatttt tatgccttac actggtacag atgggaaact 120

gcaaaaagcc ccgaggcctt gtttgtaatg actttaaatg gggatgaaaa gaagaaagga 180

cgaataagtg ccactcttaa taccaaggag ggttacagct atttgtacat caaaggatcc 240

cagcctgaag actcagccac atacctctgt gccttccctt caggaggagg tgctgacgga 300

ctcacctttg gcaaagggac tcatctaatc atccagccct at 342

<210> 3

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRα鏈

<400> 3

Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu Gly

1 5 10 15

Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro Ser Ser Asn Phe Tyr Ala

20 25 30

Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Ala Leu Phe

35 40 45

Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser Ala

50 55 60

Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Lys Gly Ser

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe Pro Ser Gly Gly

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr His Leu Ile Ile Gln

100 105 110

Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser

115 120 125

Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln

130 135 140

Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys

145 150 155 160

Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val

165 170 175

Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn

180 185 190

Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys

195 200 205

Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn

210 215 220

Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val

225 230 235 240

Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

245 250

<210> 4

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRα鏈

<400> 4

atactgaacg tggaacaaag tcctcagtca ctgcatgttc aggagggaga cagcaccaat 60

ttcacctgca gcttcccttc cagcaatttt tatgccttac actggtacag atgggaaact 120

gcaaaaagcc ccgaggcctt gtttgtaatg actttaaatg gggatgaaaa gaagaaagga 180

cgaataagtg ccactcttaa taccaaggag ggttacagct atttgtacat caaaggatcc 240

cagcctgaag actcagccac atacctctgt gccttccctt caggaggagg tgctgacgga 300

ctcacctttg gcaaagggac tcatctaatc atccagccct atatccagaa ccctgaccct 360

gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 420

tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 480

actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 540

aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 600

ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc aagctggtcg agaaaagctt tgaaacagat 660

acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg attgggttcc gaatcctcct cctgaaagtg 720

gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg ctgtggtcca gc 762

<210> 5

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRβ鏈可變域

<400> 5

Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln

35 40 45

Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu Glu Arg Phe

50 55 60

Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Leu Ser Ser

65 70 75 80

Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu

85 90 95

Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr

100 105 110

Val Thr

<210> 6

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRβ鏈可變域

<400> 6

gattctggag tcacacaaac cccaaagcac ctgatcacag caactggaca gcgagtgacg 60

ctgagatgct cccctaggtc tggagacctc tctgtgtact ggtaccaaca gagcctggac 120

cagggcctcc agttcctcat tcagtattat aatggagaag agagagcaaa aggaaacatt 180

cttgaacgat tctccgcaca acagttccct gacttgcact ctgaactaaa cctgagctct 240

ctggagctgg gggactcagc tttgtatttc tgtgccagca gcgtagaagg ctacccctcc 300

tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca ca 342

<210> 7

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRβ鏈

<400> 7

Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln

35 40 45

Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu Glu Arg Phe

50 55 60

Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Leu Ser Ser

65 70 75 80

Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu

85 90 95

Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr

100 105 110

Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe

115 120 125

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val

130 135 140

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

145 150 155 160

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro

165 170 175

Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser

180 185 190

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe

195 200 205

Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr

210 215 220

Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp

225 230 235 240

Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val

245 250 255

Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu

260 265 270

Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg

275 280 285

Lys Asp Ser Arg Gly

290

<210> 8

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRβ鏈

<400> 8

gattctggag tcacacaaac cccaaagcac ctgatcacag caactggaca gcgagtgacg 60

ctgagatgct cccctaggtc tggagacctc tctgtgtact ggtaccaaca gagcctggac 120

cagggcctcc agttcctcat tcagtattat aatggagaag agagagcaaa aggaaacatt 180

cttgaacgat tctccgcaca acagttccct gacttgcact ctgaactaaa cctgagctct 240

ctggagctgg gggactcagc tttgtatttc tgtgccagca gcgtagaagg ctacccctcc 300

tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtg 360

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540

cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660

gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720

ggtagagcag actgtggctt cacctccgag tcttaccagc aaggggtcct gtctgccacc 780

atcctctatg agatcttgct agggaaggcc accttgtatg ccgtgctggt cagtgccctc 840

gtgctgatgg ccatggtcaa gagaaaggat tccagaggc 879

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗原短肽

<400> 9

Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α CDR1

<400> 10

Ser Ser Asn Phe Tyr Ala

1 5

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α CDR2

<400> 11

Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu

1 5

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α CDR3

<400> 12

Ala Phe Pro Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr

1 5 10

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β CDR1

<400> 13

Ser Gly Asp Leu Ser

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β CDR2

<400> 14

Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu

1 5

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β CDR3

<400> 15

Ala Ser Ser Val Glu Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α CDR1

<400> 16

tccagcaatt tttatgcc 18

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α CDR2

<400> 17

atgactttaa atggggatga a 21

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α CDR3

<400> 18

gccttccctt caggaggagg tgctgacgga ctcacc 36

<210> 19

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β CDR1

<400> 19

tctggagacc tctct 15

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β CDR2

<400> 20

tattataatg gagaagag 18

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β CDR3

<400> 21

gccagcagcg tagaaggcta cccctcctac gagcagtac 39

<210> 22

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有前導序列的TCRα鏈

<400> 22

Met Glu Lys Asn Pro Leu Ala Ala Pro Leu Leu Ile Leu Trp Phe His

1 5 10 15

Leu Asp Cys Val Ser Ser Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser

20 25 30

Leu His Val Gln Glu Gly Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro

35 40 45

Ser Ser Asn Phe Tyr Ala Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys

50 55 60

Ser Pro Glu Ala Leu Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys

65 70 75 80

Lys Gly Arg Ile Ser Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr

85 90 95

Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys

100 105 110

Ala Phe Pro Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly

115 120 125

Thr His Leu Ile Ile Gln Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val

130 135 140

Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe

145 150 155 160

Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp

165 170 175

Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe

180 185 190

Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys

195 200 205

Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro

210 215 220

Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu

225 230 235 240

Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg

245 250 255

Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg

260 265 270

Leu Trp Ser Ser

275

<210> 23

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有前導序列的TCRα鏈

<400> 23

atggagaaga atcctttggc agccccatta ctaatcctct ggtttcatct tgactgcgtg 60

agcagcatac tgaacgtgga acaaagtcct cagtcactgc atgttcagga gggagacagc 120

accaatttca cctgcagctt cccttccagc aatttttatg ccttacactg gtacagatgg 180

gaaactgcaa aaagccccga ggccttgttt gtaatgactt taaatgggga tgaaaagaag 240

aaaggacgaa taagtgccac tcttaatacc aaggagggtt acagctattt gtacatcaaa 300

ggatcccagc ctgaagactc agccacatac ctctgtgcct tcccttcagg aggaggtgct 360

gacggactca cctttggcaa agggactcat ctaatcatcc agccctatat ccagaaccct 420

gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 480

accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 540

gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 600

agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 660

accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa 720

acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg 780

aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagc 828

<210> 24

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有前導序列的TCRβ鏈

<400> 24

Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr

20 25 30

Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp

35 40 45

Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe

50 55 60

Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu

65 70 75 80

Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn

85 90 95

Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Val Glu Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr

115 120 125

Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val

130 135 140

Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala

145 150 155 160

Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu

165 170 175

Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp

180 185 190

Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys

195 200 205

Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg

210 215 220

Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp

225 230 235 240

Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

245 250 255

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln

260 265 270

Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys

275 280 285

Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met

290 295 300

Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 25

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有前導序列的TCRβ鏈

<400> 25

atgggcttca ggctcctctg ctgtgtggcc ttttgtctcc tgggagcagg cccagtggat 60

tctggagtca cacaaacccc aaagcacctg atcacagcaa ctggacagcg agtgacgctg 120

agatgctccc ctaggtctgg agacctctct gtgtactggt accaacagag cctggaccag 180

ggcctccagt tcctcattca gtattataat ggagaagaga gagcaaaagg aaacattctt 240

gaacgattct ccgcacaaca gttccctgac ttgcactctg aactaaacct gagctctctg 300

gagctggggg actcagcttt gtatttctgt gccagcagcg tagaaggcta cccctcctac 360

gagcagtact tcgggccggg caccaggctc acggtcacag aggacctgaa aaacgtgttc 420

ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc 480

acactggtgt gcctggccac aggcttctac cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 540

aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc 600

gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg 660

cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 720

gagtggaccc aggatagggc caaacctgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt 780

agagcagact gtggcttcac ctccgagtct taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc 840

ctctatgaga tcttgctagg gaaggccacc ttgtatgccg tgctggtcag tgccctcgtg 900

ctgatggcca tggtcaagag aaaggattcc agaggc 936

<210> 26

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可溶性TCRα鏈

<400> 26

Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu Gly

1 5 10 15

Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro Ser Ser Asn Phe Tyr Ala

20 25 30

Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Ala Leu Phe

35 40 45

Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser Ala

50 55 60

Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Lys Gly Ser

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe Pro Ser Gly Gly

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr His Leu Ile Ile Gln

100 105 110

Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser

115 120 125

Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln

130 135 140

Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys

145 150 155 160

Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val

165 170 175

Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn

180 185 190

Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser

195 200 205

<210> 27

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 可溶性TCRα鏈

<400> 27

attctgaacg tggaacaaag tcctcagtca ctgcatgttc aggagggaga cagcaccaat 60

ttcacctgca gcttcccttc cagcaatttt tatgccttac actggtacag atgggaaact 120

gcaaaaagcc ccgaggcctt gtttgtaatg actttaaatg gggatgaaaa gaagaaagga 180

cgaataagtg ccactcttaa taccaaggag ggttacagct atttgtacat caaaggatcc 240

cagcctgaag actcagccac atacctctgt gccttccctt caggaggagg tgctgacgga 300

ctcacctttg gcaaagggac tcatctaatc atccagccct atatccagaa ccctgaccct 360

gccgtgtacc agctgagaga ctctaagtcg agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 420

tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 480

tgtgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 540

aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 600

ttccccagcc cagaaagttc c 621

<210> 28

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可溶性TCRβ鏈

<400> 28

Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln

35 40 45

Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu Glu Arg Phe

50 55 60

Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Leu Ser Ser

65 70 75 80

Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu

85 90 95

Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr

100 105 110

Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe

115 120 125

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val

130 135 140

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

145 150 155 160

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro

165 170 175

Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser

180 185 190

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe

195 200 205

Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr

210 215 220

Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp

225 230 235 240

Gly Arg Ala Asp

<210> 29

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 可溶性TCRβ鏈

<400> 29

gatagcggcg tgacccaaac cccaaagcac ctgatcacag caactggaca gcgagtgacg 60

ctgagatgct cccctaggtc tggagacctc tctgtgtact ggtaccaaca gagcctggac 120

cagggcctcc agttcctcat tcagtattat aatggagaag agagagcaaa aggaaacatt 180

cttgaacgat tctccgcaca acagttccct gacttgcact ctgaactaaa cctgagctct 240

ctggagctgg gggactcagc tttgtatttc tgtgccagca gcgtagaagg ctacccctcc 300

tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtg 360

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420

gccacactgg tgtgcctggc caccggtttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc tgcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540

cccgccctca atgactccag atacgctctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600

tggcaggacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660

gacgagtgga cccaggatag ggccaaaccc gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720

ggtagagcag ac 732

<210> 30

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈TCR

<400> 30

Ala Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu

1 5 10 15

Gly Asp Ser Val Asn Ile Thr Cys Ser Phe Pro Ser Ser Asn Phe Tyr

20 25 30

Ala Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Ala Leu

35 40 45

Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser

50 55 60

Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Lys Arg

65 70 75 80

Val Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe Pro Ser Gly

85 90 95

Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr His Leu Met Ile

100 105 110

Gln Pro Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr Gly Asp Ser Gly Val Thr Gln

130 135 140

Thr Pro Lys His Leu Ser Val Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg

145 150 155 160

Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser

165 170 175

Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu

180 185 190

Arg Ala Lys Gly Asn Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro

195 200 205

Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Ile Ser Ser Val Glu Pro Gly Asp Ser

210 215 220

Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu

225 230 235 240

Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

245 250

<210> 31

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈TCR

<400> 31

gctattctta atgttgaaca gagcccgcaa tctctgcatg tgcaggaagg tgatagtgtt 60

aacatcacct gctcctttcc gagctctaat ttctatgcgc tgcactggta ccgctgggaa 120

accgcgaaaa gcccggaagc cctgtttgtc atgacgctga acggtgacga gaaaaagaaa 180

ggccgcattt cagccaccct gaatacgaaa gaaggttatt cgtacctgta tatcaaacgt 240

gttcagccgg aagatagcgc aacctatctg tgtgcttttc cgtctggcgg tggcgcagac 300

ggtctgacct tcggtaaagg cacgcatctg atgattcaac cgggtggcgg ttcagaaggc 360

ggtggctcgg aaggtggcgg tagcgaaggc ggtggctctg aaggtggcac cggtgattca 420

ggcgtgaccc agacgccgaa acacctgtct gtcgcgaccg gtcaacgtgt gacgctgcgt 480

tgcagtccgc gttccggtga tctgtcagtt tactggtatc agcaatcgct ggaccagggc 540

ctgcaattcc tgattcagta ttacaacggt gaagaacgcg caaaaggcaa tatcccggaa 600

cgttttagtg ctcagcaatt cccggatctg cattccgaac tgaatatcag ttccgttgaa 660

ccgggtgaca gtgcgctgta tttttgtgcc tcatcggtcg aaggctaccc gagctatgaa 720

cagtacttcg gtccgggcac ccgtctgacg gttctg 756

<210> 32

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈TCRα鏈

<400> 32

Ala Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu

1 5 10 15

Gly Asp Ser Val Asn Ile Thr Cys Ser Phe Pro Ser Ser Asn Phe Tyr

20 25 30

Ala Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Ala Leu

35 40 45

Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser

50 55 60

Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Lys Arg

65 70 75 80

Val Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe Pro Ser Gly

85 90 95

Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr His Leu Met Ile

100 105 110

Gln Pro

<210> 33

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈TCRα鏈

<400> 33

gctattctta atgttgaaca gagcccgcaa tctctgcatg tgcaggaagg tgatagtgtt 60

aacatcacct gctcctttcc gagctctaat ttctatgcgc tgcactggta ccgctgggaa 120

accgcgaaaa gcccggaagc cctgtttgtc atgacgctga acggtgacga gaaaaagaaa 180

ggccgcattt cagccaccct gaatacgaaa gaaggttatt cgtacctgta tatcaaacgt 240

gttcagccgg aagatagcgc aacctatctg tgtgcttttc cgtctggcgg tggcgcagac 300

ggtctgacct tcggtaaagg cacgcatctg atgattcaac cg 342

<210> 34

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈TCRβ鏈

<400> 34

Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ser Val Ala Thr Gly

1 5 10 15

Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln

35 40 45

Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Pro Glu Arg Phe

50 55 60

Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Ile Ser Ser

65 70 75 80

Val Glu Pro Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu

85 90 95

Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr

100 105 110

Val Leu

<210> 35

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈TCRβ鏈

<400> 35

gattcaggcg tgacccagac gccgaaacac ctgtctgtcg cgaccggtca acgtgtgacg 60

ctgcgttgca gtccgcgttc cggtgatctg tcagtttact ggtatcagca atcgctggac 120

cagggcctgc aattcctgat tcagtattac aacggtgaag aacgcgcaaa aggcaatatc 180

ccggaacgtt ttagtgctca gcaattcccg gatctgcatt ccgaactgaa tatcagttcc 240

gttgaaccgg gtgacagtgc gctgtatttt tgtgcctcat cggtcgaagg ctacccgagc 300

tatgaacagt acttcggtcc gggcacccgt ctgacggttc tg 342

<210> 36

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈TCR連接序列

<400> 36

Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr Gly

20

<210> 37

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈TCR連接序列

<400> 37

ggtggcggtt cagaaggcgg tggctcggaa ggtggcggta gcgaaggcgg tggctctgaa 60

ggtggcaccg gt 72