本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維素酶解領(lǐng)域，涉及一種利用污泥蛋白為酶解助劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解糖化的方法。

背景技術(shù)：

木質(zhì)纖維素是廉價(jià)且豐富的可再生資源。隨著能源危機(jī)的不斷嚴(yán)峻及人們對(duì)環(huán)境問(wèn)題的日益重視，高效開(kāi)發(fā)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)資源已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。木質(zhì)纖維素水解糖化是其資源利用過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在眾多水解方法中，酶解具有徹底、條件溫和、副產(chǎn)物少、環(huán)保、糖損耗低等特點(diǎn)備受青睞。但由于木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)與組成復(fù)雜，纖維素酶壽命短、穩(wěn)定性差、活性低等缺陷，致使木質(zhì)纖維素酶解糖化效率低、成本高。為此世界各國(guó)學(xué)者開(kāi)展了大量研究致力于解決上述問(wèn)題。例如利用PEG4000(0.5％～2％w/v)強(qiáng)化玉米芯酶解，纖維素的轉(zhuǎn)化率隨著PEG4000比例的增加而增大，Li J.H.,Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2012,89,1；吳澤等通過(guò)設(shè)計(jì)一種臥式平推流酶解反應(yīng)器，在低能耗、高傳質(zhì)的環(huán)境下實(shí)現(xiàn)酶解工藝的連續(xù)化，吳澤，纖維素科學(xué)與技術(shù)，2013，21，2；Zhang通過(guò)白腐菌聯(lián)合堿預(yù)處理協(xié)同強(qiáng)化楊木的酶解糖化作用，效果顯著，Zhang Liming,et al.,Industrial Crops and Products,2016,86。綜上所述，這些方法均在一定程度上強(qiáng)化了木質(zhì)纖維素的酶解效率，但是酶解糖化成本并沒(méi)有降低，相反加入的酶解助劑又額外增加了投入成本，同時(shí)纖維素酶的活性也并沒(méi)有顯著提高。

對(duì)于污泥蛋白，來(lái)源于城市污泥，主要作為發(fā)泡劑使用，目前還沒(méi)有用于酶解助劑的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種利用污泥蛋白為酶解助劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解糖化的方法，采用污泥蛋白作為酶解助劑，成本低，強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解糖化效率。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

包括以下步驟：

1)將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉碎過(guò)篩，得到木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉；將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉浸泡于去離子水中，充分浸泡后分離出木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉；

2)取城市污泥調(diào)節(jié)pH值為9～12，再經(jīng)超聲處理后冷卻至室溫，分離出上清液并干燥得到污泥蛋白粉；

3)向步驟1)中分離得到的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉中加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液混合均勻，得到混合溶液，再向混合溶液中加入纖維素酶和污泥蛋白粉，得到酶解液；其中，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉和纖維素酶的比為1g：(5～20)FPU，污泥蛋白粉和混合溶液的質(zhì)量體積比為(0.5～2.5)mg：1mL；酶解液在35～50℃進(jìn)行酶解反應(yīng)25～48h，完成利用污泥蛋白為酶解助劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素的酶解糖化。

進(jìn)一步地，步驟1)中木質(zhì)纖維素生物質(zhì)采用雜交楊木屑；過(guò)篩采用的40～80目篩網(wǎng)。

進(jìn)一步地，步驟1)中浸泡時(shí)間為1～4h。

進(jìn)一步地，步驟2)中用氧化鈣或氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值；制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中，4℃貯藏備用。

進(jìn)一步地，步驟2)中超聲處理是在108W和20.024kHz的超聲波作用下反應(yīng)20～40min。

進(jìn)一步地，步驟2)中分離是在3000r/min離心分離10～15min。

進(jìn)一步地，步驟2)中上清液于25～40℃干燥5d得污泥蛋白粉。

進(jìn)一步地，步驟3)中每0.5克木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中加入5～10mL的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

進(jìn)一步地，步驟3)中檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的濃度為0.075mol/L，pH值為4.8。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

1、本發(fā)明方法采用污泥蛋白作為酶解助劑，污泥蛋白的加入降低了木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的非特異性吸收，節(jié)省了纖維素酶的用量；同時(shí)污泥蛋白還能降低酶的熱失活，保證酶的活性；此外，在污泥蛋白表面活性的作用下，大大降低了酶與氣液界面的接觸，避免了纖維素酶的損耗。2、在強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解糖化的同時(shí)，也實(shí)現(xiàn)了污泥的資源化利用，使其變廢為寶，減少了環(huán)境污染，有效的解決了污泥處理處置問(wèn)題。3、通過(guò)污泥蛋白的加入，在達(dá)到強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解糖化效率的同時(shí)，還簡(jiǎn)化了生物質(zhì)的預(yù)處理工序與成本。并且污泥蛋白加入后，可在更短的時(shí)間內(nèi)(＜50h)達(dá)到較高的效率，而目前的研究均要在90h甚至100h以上才能達(dá)到相同高度的酶解率，本方法縮短了反應(yīng)時(shí)間，有效降低了水解單糖因過(guò)度水解而造成的損失。本發(fā)明以污泥蛋白作為酶解助劑，強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解糖化作用，不僅實(shí)現(xiàn)了污泥的資源化利用，還提高了污泥蛋白的附加值，同時(shí)更降低了木質(zhì)纖維素酶解糖化成本，這對(duì)解決能源危機(jī)將具有重要意義。

【附圖說(shuō)明】

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1酶解時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2酶解時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3酶解時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響。

【具體實(shí)施方式】

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明方法通過(guò)如下步驟進(jìn)行的：

1)城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過(guò)大體積雜物；木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過(guò)篩(40～80目)，將過(guò)篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時(shí)間1～4h，抽濾分離出木屑粉。雜交楊木屑可用任何木質(zhì)纖維素生物質(zhì)代替。

2)將選好城市污泥用氧化鈣或氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH為9～12，取300～500mL調(diào)節(jié)好pH的污泥置于1L反應(yīng)器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應(yīng)20～40min。然后將反應(yīng)物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離10～15min。取出上清液于25～40℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。

3)將步驟1)中分離得到的木屑粉作為底物，取0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入5～10mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合，得到混合溶液，然后再分別向燒瓶中加入纖維素酶和污泥蛋白粉，充分混合，其中，纖維素酶的添加量為5～20FPU/g底物；污泥蛋白粉和混合溶液的質(zhì)量體積比為(0.5～2.5)mg：1mL。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度35～50℃，反應(yīng)時(shí)間25～48h。在一定的反應(yīng)時(shí)間間隔后，取出樣品進(jìn)行還原糖與酶活性分析。

本發(fā)明提供了一種利用污泥蛋白為酶解助劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解糖化的方法，首先將城市污泥超聲破解制備污泥蛋白粉，然后將制得的污泥蛋白粉與纖維素酶一起作用于經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)，具有新穎、獨(dú)特、成本低等特點(diǎn)，克服現(xiàn)有技術(shù)酶活性低、效率低、成本高等缺陷。

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

(1)城市污泥、生物質(zhì)的取樣：

城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過(guò)大體積雜物；木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過(guò)篩(40目)，將過(guò)篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時(shí)間1h。

(2)污泥蛋白的制備：

將選好城市污泥用氧化鈣調(diào)節(jié)pH為9，取300mL調(diào)節(jié)好pH的污泥置于1L反應(yīng)器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應(yīng)20min。然后將反應(yīng)物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離10min。取出上清液于25℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。

(3)酶解反應(yīng)：

取(2)中浸泡后的樣品0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入5mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后在分別向燒瓶中加入5FPU/g的纖維素酶和0.5mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度35℃，反應(yīng)時(shí)間48h。在一定的反應(yīng)間隔后，取出樣品進(jìn)行還原糖與酶活性分析。

效果分析：

上述實(shí)施例中在污泥蛋白的作用下，纖維素酶活性由8750U提高到了12145U，酶活性得到了顯著提高。

對(duì)于酶解糖化效率，見(jiàn)圖1，由圖可知，在酶解48h后，還原糖得率即已達(dá)到519.11mg/g，而Jin等在相關(guān)研究中，當(dāng)Ca(OH)₂劑量為1.75％(w/v)，預(yù)處理溫度160℃，酶載量120FPU/g，酶解時(shí)間96h，還原糖得率才達(dá)到500mg/g以上，Jin Shuguang,Bioresource Technology，2016，205。

實(shí)施例2

(1)城市污泥、生物質(zhì)的取樣：

城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過(guò)大體積雜物；木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過(guò)篩(50目)，將過(guò)篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時(shí)間2h。

(2)污泥蛋白的制備：

將選好城市污泥用氧化鈣調(diào)節(jié)pH為10.5，取350mL調(diào)節(jié)好pH的污泥置于1L反應(yīng)器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應(yīng)25min。然后將反應(yīng)物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離11min。取出上清液于30℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。

(3)酶解反應(yīng)：

取(2)中浸泡后的樣品0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入6mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后在分別向燒瓶中加入7FPU/g的纖維素酶和1mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度40℃，反應(yīng)時(shí)間48h。在一定的反應(yīng)間隔后，取出樣品進(jìn)行還原糖與酶活性分析。

效果分析：

上述實(shí)施例中在污泥蛋白的作用下，纖維素酶活性由8750U提高到了16584U，酶活性得到了顯著提高。

對(duì)于酶解糖化效率，見(jiàn)圖2，由圖可知，在酶解48h后，還原糖得率達(dá)530.35mg/g。

實(shí)施例3

(1)城市污泥、生物質(zhì)的取樣：

城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過(guò)大體積雜物；木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過(guò)篩(60目)，將過(guò)篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時(shí)間2.5h。

(2)污泥蛋白的制備：

將選好城市污泥用氧化鈣調(diào)節(jié)pH為11，取400mL調(diào)節(jié)好pH的污泥置于1L反應(yīng)器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應(yīng)30min。然后將反應(yīng)物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離12min。取出上清液于35℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。

(3)酶解反應(yīng)：

取(2)中浸泡后的樣品0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入7mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后在分別向燒瓶中加入10FPU/g的纖維素酶和1.5mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度45℃，反應(yīng)時(shí)間48h。在一定的反應(yīng)間隔后，取出樣品進(jìn)行還原糖與酶活性分析。

效果分析：

上述實(shí)施例中在污泥蛋白的作用下，纖維素酶活性由8750U提高到了18489U，酶活性得到了顯著提高。

對(duì)于酶解糖化效率，見(jiàn)圖3，由圖可知，在酶解48h后，還原糖得率達(dá)到525.76mg/g。

實(shí)施例4

城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過(guò)大體積雜物；木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過(guò)篩(70目)，將過(guò)篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時(shí)間3h。將選好城市污泥用氧化鈣調(diào)節(jié)pH為11.5，取450mL調(diào)節(jié)好pH的污泥置于1L反應(yīng)器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應(yīng)35min。然后將反應(yīng)物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離13min。取出上清液于37℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。取浸泡后的木屑0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入8mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后在分別向燒瓶中加入15FPU/g的纖維素酶和2mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度48℃，反應(yīng)時(shí)間48h。

實(shí)施例5

城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過(guò)大體積雜物；木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過(guò)篩(80目)，將過(guò)篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時(shí)間4h。將選好城市污泥用氧化鈣調(diào)節(jié)pH為12，取500mL調(diào)節(jié)好pH的污泥置于1L反應(yīng)器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應(yīng)40min。然后將反應(yīng)物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離15min。取出上清液于40℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。取浸泡后的木屑0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入10mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后在分別向燒瓶中加入20FPU/g的纖維素酶和2.5mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間48h。

上述方法既增強(qiáng)了酶活性、節(jié)省了酶載量、降低了成本、又提高了生物質(zhì)還原糖得率，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了污泥的資源化利用；此外，污泥蛋白的加入顯著地縮短了反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)一步降低了水解單糖因過(guò)度水解而造成的損失。

以上述及內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說(shuō)明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。