本發(fā)明涉及寄生蟲分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種檢測小鼠錐蟲的引物對和試劑盒。

背景技術(shù)：

在自然界中，小鼠錐蟲（trypanosomamusculi）是一種呈全球性分布的寄生原蟲，借助媒介昆蟲跳蚤在哺乳動物間傳播，屬于匐錐蟲亞屬（subgenusherpetosoma），對于小鼠錐蟲的檢測，現(xiàn)有技術(shù)發(fā)展了許多現(xiàn)代化的檢測手段。比如利用its鑒定小鼠錐蟲，由于its與18s的技術(shù)有缺陷，只能區(qū)分其他亞屬，雖然已知該原蟲的廣泛分布性，由于公眾的忽視，流行病學(xué)的數(shù)據(jù)已經(jīng)過時，現(xiàn)階段有必要對其進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查以評估感染人的風(fēng)險。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，提供一種檢測小鼠錐蟲的引物。

本發(fā)明的第二個目的是提供含有所述引物的試劑盒。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

一種檢測小鼠錐蟲的引物對tm2-f和tm2-r，所述引物對的序列如seqidno：1和seqidno：2所示。

本發(fā)明將小鼠錐蟲和其他類似錐蟲的基因進(jìn)行比對，并經(jīng)過引物設(shè)計，篩選出一對能夠特異性檢測小鼠錐蟲的引物對。

因此，本發(fā)明還提供含有所述引物對的試劑盒。

優(yōu)選地，所述試劑盒內(nèi)還含有pcr擴增反應(yīng)試劑；這里所說的pcr擴增反應(yīng)試劑是指能夠使得樣本dna在上述引物對的作用下進(jìn)行pcr擴增反應(yīng)的試劑，現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)pcr擴增反應(yīng)試劑均可用于本發(fā)明。

所述pcr擴增反應(yīng)試劑可用商品化的試劑，例如primerstarmaxpremix。

優(yōu)選地，若為dna樣本，所述試劑盒的pcr擴增反應(yīng)體系為：12.5μl的pcr反應(yīng)試劑，引物tm2-f和引物tm2-r、100ng樣本dna，滅菌雙蒸水補齊至25μl，引物tm2-f和引物tm2-r在反應(yīng)體系中的終濃度分別為6.25pmol/l。

優(yōu)選地，若為血液樣本，所述試劑盒的pcr擴增反應(yīng)體系為：12.5μl的pcr反應(yīng)試劑，引物tm2-f和引物tm2-r、10μl樣本血液溶解液，滅菌雙蒸水補齊至25μl，引物tm2-f和引物tm2-r在反應(yīng)體系中的終濃度分別為6.25pmol/l。

優(yōu)選地，所述試劑盒的pcr擴增反應(yīng)條件為：30個反應(yīng)循環(huán)：98℃變性10s，52℃退火15s，72℃延伸8s。

利用該試劑盒進(jìn)行pcr檢測小鼠錐蟲的方法為：（1）提取樣本dna或者樣本血液；（2）在樣本dna或者樣本血液中加入pcr擴增反應(yīng)試劑進(jìn)行pcr擴增，進(jìn)行結(jié)果判定：若擴增出一條1313bp大小的條帶，則被檢測樣本中含有小鼠錐蟲，反之則被檢測樣本中沒有小鼠錐蟲。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明是利用kdna（kinetoplastdna）大環(huán)設(shè)計引物，即通過比對小鼠錐蟲和其他類似錐蟲的大環(huán)序列，篩選出一對能夠特異性檢測小鼠錐蟲的引物對tm2-f和tm2-r，所述引物對的序列如seqidno：1和seqidno：2所示；該引物對能特異性擴增出小鼠錐蟲的部分片段，且靈敏度高，能夠檢測出僅僅含有10個錐蟲的樣本，或者是1ng的dna樣本；利用該引物對能夠快速準(zhǔn)確的將其從其他錐蟲亞屬中，以及利什曼原蟲（leishmaniaamazonesis）鑒定出來，不需要昂貴的顯微鏡和專業(yè)的病原學(xué)知識，本發(fā)明所述方法的另一特點是基于大小鼠感染錐蟲的尾血直接進(jìn)行pcr檢測，提高了檢測的可操作性，檢測快速方便，可用于早期感染的檢測，同時適用于動物錐蟲混合感染的檢測，有利于開展流行病學(xué)調(diào)查以及可能適用于人類感染小鼠錐蟲的檢測。

附圖說明

圖1為tm2對小鼠錐蟲pcr檢測反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果；圖中：泳道m(xù)：dl2000marker，泳道1～6分別為50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃，泳道n為陰性對照。

圖2為tm1對小鼠錐蟲pcr檢測反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果；圖中：泳道m(xù)：dl2000marker，泳道1～6分別為50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃，泳道n為陰性對照。

圖3為tm2對小鼠錐蟲pcr檢測特異性實驗結(jié)果；圖中：泳道m(xù)：dl2000marker，泳道1～3為3種t.musculi（小鼠錐蟲）、4～6為3種t.lewisi（路氏錐蟲）、7～9為3種t.brucei（布氏錐蟲）、泳道10為t.evansi（伊氏錐蟲）、泳道11～13為3中t.equiperdum（馬媾疫錐蟲）、泳道14為t.cruzi（枯氏錐蟲）、泳道15為l.amazonensis（利什曼亞馬遜屬）、泳道n為陰性對照。

圖4為tm1對小鼠錐蟲pcr檢測特異性實驗結(jié)果；圖中：泳道m(xù)：dl2000marker，泳道1～3為3種t.musculi（小鼠錐蟲）、4～6為3種t.lewisi（路氏錐蟲）、7～9為3種t.brucei（布氏錐蟲）、泳道10為t.evansi（伊氏錐蟲）、泳道11～13為3中t.equiperdum（馬媾疫錐蟲）、泳道14為t.cruzi（枯氏錐蟲）、泳道15為l.amazonensis（利什曼亞馬遜屬）、泳道n為陰性對照。

圖5為tm2對小鼠錐蟲dna的pcr檢測靈敏度結(jié)果；圖中：泳道m(xù)：dl2000marker，泳道1～6分別為200ng、100ng、50ng、10ng、1ng、0.1ng，泳道n為陰性對照。

圖6為tm1對小鼠錐蟲dna的pcr檢測靈敏度結(jié)果；圖中：泳道m(xù)：dl2000marker，泳道1～6分別為200ng、100ng、50ng、10ng、1ng、0.1ng，泳道n為陰性對照。

圖7為tm2對小鼠錐蟲血液pcr檢測靈敏度結(jié)果；圖中：泳道m(xù)：dl2000marker，泳道1～5分別為10⁴個錐蟲、10³個錐蟲、10²個錐蟲、10個錐蟲、1個錐蟲，泳道n為陰性對照。

圖8為tm1對小鼠錐蟲血液pcr檢測靈敏度結(jié)果；圖中：泳道m(xù)：dl2000marker，泳道1～5分別為10⁴個錐蟲、10³個錐蟲、10²個錐蟲、10個錐蟲、1個錐蟲，泳道n為陰性對照。

圖9為pcr檢測血液樣本的流程圖。

圖10為pcr擴增目的片段，下劃線英文字母標(biāo)注的序列為引物結(jié)合區(qū)域。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)條件或按照制造廠商建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的意義相同。

小鼠錐蟲（t.mucsulifra）總dna的提?。?/p>

（1）在純化過的錐蟲樣品中加入snet緩沖液（在snet緩沖液中再加入蛋白酶k，蛋白酶k的終濃度為100μg/ml），56℃金屬浴消化3～5h；

（2）將步驟（1）的樣品取出，加入rna酶，37℃金屬浴消化0.5h；

（3）將步驟（2）的樣品去出，加入體積比為25：24：1的酚：氯仿：異戊醇，室溫下震蕩混勻成乳狀液后靜置2～5min；

（4）將步驟（3）的混合液用12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上層水相到新的離心管中；

（5）向步驟（4）的水相中加入等體積的異丙醇沉淀dna，12000rpm離心5分鐘后棄上清；

（6）將步驟（5）收集到的沉淀，用300μl預(yù)冷的70%乙醇洗滌，再12000rpm高速離心5min，棄上清，室溫?fù)]發(fā)酒精；

（7）用50μlte溶解dna樣品，測定dna含量。

實施例1引物設(shè)計

將小鼠錐蟲（ky426815）與路氏錐蟲（t.lewisicpo02，kr072974）、枯氏錐蟲（genbank：fj203996.1；genbank：dq343646.1；genbank：dq343645.1）的基因序列進(jìn)行比對設(shè)計引物，引物序列見表1；其中，tubulin為內(nèi)參基因。

實施例2pcr檢測體系溫度的確定

（1）建立pcr擴增反應(yīng)體系：12.5μl的primerstarmaxpremix（takara，japan），6.25pmol/l的正向引物和反向引物，100ng提取得到的dna，滅菌雙蒸水補齊至25μl，其中陰性對照為滅菌雙蒸水。

（2）pcr擴增反應(yīng)條件：30個反應(yīng)循環(huán)：98℃變性10s，（50～60℃）退火15s，72℃延伸8s。

（3）擴增產(chǎn)物分析：采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。取25μl的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)pcr擴增的最終反應(yīng)產(chǎn)物5μl，加入6×loadingbuffer，點樣至含有g(shù)oldview染料的1%的瓊脂糖凝膠中，220v電泳20min，在凝膠成相系統(tǒng)上成像觀察結(jié)果。對于tm2的擴增50℃～54℃均可以擴增出目的條帶且條帶亮度基本沒有變化，選擇52℃反應(yīng)溫度（圖1）；對于tm1的擴增50℃～60℃均可擴增出目的條帶（圖2）。

實施例3pcr檢測方法特異性實驗

按照實施例2的方法進(jìn)行pcr擴增。

（1）建立pcr擴增反應(yīng)體系：12.5μl的primerstarmaxpremix（takara，japan），6.25pmol/l的引物tm2-f、6.25pmol/l的引物tm2-r（或者6.25pmol/l的引物tm1-f、6.25pmol/l的引物tm1-r），100ngdna（15個樣品），滅菌雙蒸水補齊至25μl，其中陰性對照為滅菌雙蒸水。

（2）pcr擴增反應(yīng)條件：30個反應(yīng)循環(huán)：98℃變性10s，52℃退火15s，72℃延伸8s。

（3）擴增產(chǎn)物分析：采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。取25μl的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)pcr擴增的最終反應(yīng)產(chǎn)物5μl，加入6×loadingbuffer，點樣至含有g(shù)oldview染料的1%的瓊脂糖凝膠中，220v電泳20min，在凝膠成相系統(tǒng)上成像觀察結(jié)果。對于tm2只能擴增t.musculi的部分區(qū)域（1313bp），如圖3；說明這兩對引物均具有良好的特異性，與其他種屬dna沒有交叉反應(yīng)；tm1同樣也只能擴增t.musculi的部分區(qū)域（圖4）。

實施例4pcr檢測方法靈敏度實驗（dna）

按照實施例2的方法進(jìn)行pcr擴增，其中25μl體系中加入1μl不同濃度（200ng/μl、100ng/μl、50ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl）的dna（pcr的擴增條件同實施例3）。

按照實施例2中瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行擴增產(chǎn)物的分析，tm2最低可以檢測到1ngdna，結(jié)果如圖5；tm1最低可以檢測到1ngdna，結(jié)果如圖6。

實施例5pcr檢測方法靈敏度實驗（血液樣品）

收集1ml感染小鼠錐蟲的昆明小鼠尾血于小離心管中，分別用未接種錐蟲的小鼠尾血逐級稀釋；

一、皂素處理尾血得血液溶解液

（1）吸取5μl待測血液樣品于離心管中；

（2）向步驟（1）的待測樣品加入500μlsaponinlysisbuffer（0.22%nacl，0.015%saponin，1mmedta）；

（3）將步驟（2）的混合液用12000g離心1min，棄上清；

（4）將步驟（3）的沉淀用saponinlysisbuffer清洗三遍，用100μl1xpcrbuffer（50mmkcl，10mmtris-hcl，ph8.0，0.5%tween20，100μgofproteinasekperml）重懸；

（5）將步驟（4）的混合液置于56℃金屬恒溫酶解反應(yīng)60min；

（6）將步驟（5）的混合液置于95℃金屬恒溫酶變性失活反應(yīng)5min；

（7）將步驟（6）的混合液用12000g離心1min得血液溶解液用于pcr反應(yīng)。

二、建立pcr擴增反應(yīng)體系

12.5μl的primerstarmaxpremix（takara，japan），終濃度為6.25pmol/l的引物tm2-f和終濃度為6.25pmol/l的引物tm2-r，10μl血液溶解液（10³個錐蟲/μl、10²個錐蟲/μl、10個錐蟲/μl、1個錐蟲/μl、0.1個錐蟲/μl），滅菌雙蒸水補齊至25μl，其中陰性對照為滅菌雙蒸水。

12.5μl的primerstarmaxpremix（takara，japan），終濃度為6.25pmol/l的引物tm1-f和終濃度為6.25pmol/l的引物tm1-r，10μl血液溶解液（10³/μl、10²/μl、10/μl、1/μl、0.1/μl），滅菌雙蒸水補齊至25μl，其中陰性對照為滅菌雙蒸水。

pcr擴增反應(yīng)條件：同實施例3。

擴增產(chǎn)物分析：取25μl的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)pcr擴增的最終反應(yīng)產(chǎn)物5μl，加入6×loadingbuffer，點樣至含有g(shù)oldview染料的1%的瓊脂糖凝膠中，220v電泳20min，在凝膠成相系統(tǒng)上成像觀察結(jié)果；結(jié)果顯示：tm2能夠檢測最低含有10個錐蟲的血液樣品（圖7），而tm1則只能夠檢測最低含有10⁴個錐蟲的血液樣品（圖8），tm2引物的檢測靈敏度顯著高于tm1引物的檢測靈敏度。

在實際應(yīng)用中，tm1的檢測靈敏度與顯微鏡鏡檢相當(dāng)，因此，tm2引物適合用于感染早期小鼠錐蟲的檢測。

實施例6含有引物tm2的檢測試劑盒

試劑盒組成為：引物tm2-f和tm2-r；pcr反應(yīng)試劑，如primerstarmaxpremix。

sequencelisting

<110>中山大學(xué)

<120>一種檢測小鼠錐蟲的引物對和試劑盒

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>tm2-f

<400>1

tgggtttccaaatcctaa18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>tm2-r

<400>2

gggagataaagggatttc18

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>tm1-f

<400>3

taacgcaaagttccaaatag20

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>tm1-r

<400>4

gatgtaagagtagagttggagg22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>tubulinf

<400>5

ctggcttcaagtgcggtatcaa22

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>tubulinr

<400>6

gtactcctccacatcctcctcg22