本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和腫瘤防治技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種雌激素相關(guān)受體α作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的診斷標(biāo)記物的用途及其相關(guān)應(yīng)用。

背景技術(shù)：

皮膚癌是人類最普遍的癌癥之一，皮膚癌的發(fā)生主要是由于表皮細(xì)胞不可控的增長(zhǎng)所致，皮膚癌分為基底細(xì)胞癌(basalcellcarcinoma,bcc)、鱗狀細(xì)胞癌(squamouscellcarcinoma,scc)和黑色素瘤(melanoma)三種類型，它們分別起源于表皮的基底細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞和黑色素細(xì)胞。其中基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌又統(tǒng)稱為非黑素瘤(non-melanoma)，在非黑素瘤中，基底細(xì)胞癌所占比例(80％)大于鱗狀細(xì)胞癌(20％)，但由于鱗狀細(xì)胞癌具有轉(zhuǎn)移性，因此它的危害高于基底細(xì)胞癌。皮膚鱗狀細(xì)胞癌通常是局部的，但是可能會(huì)轉(zhuǎn)移。它可發(fā)生在身體的任何區(qū)域，但多發(fā)于暴露在陽光下的部位，如頭、頸、手背等，可能與紫外的福射有關(guān)。鱗狀細(xì)胞癌的治療目前可用局部藥物療法、切除法、電干燥、輻射療法等，但這些治療方法的弊端仍然存在。對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制的研究和尋找開發(fā)抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌的藥物是當(dāng)前皮膚腫瘤防治中的重要研究領(lǐng)域。

為了逆轉(zhuǎn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌，提高化療療效，本領(lǐng)域迫切需要通過多種方式研究皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的機(jī)制、皮膚鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)，并根據(jù)這些靶點(diǎn)設(shè)計(jì)治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌的新藥，從而引導(dǎo)皮膚鱗狀細(xì)胞癌靶向性治療。

孤兒核受體(orphannuclearreceptors,onrs)是屬于轉(zhuǎn)錄因子超家族中的一員，是一類無需與配體結(jié)合即可產(chǎn)生生物學(xué)功能的核受體，可直接參與調(diào)控多種功能有關(guān)的基因。err(estogen-relatedreceptors,nr3b)是一個(gè)重要的onr超家族，errs屬于第三類核受體超家族，主要包括3種亞型，分別是errα(nr3b1)、errβ(nr3b2)和errγ(nr3b3)。errs之所以被稱為“雌激素相關(guān)受體”是因?yàn)閑rrs不僅參與雌激素的復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系，并且與雌激素引起的疾病密切相關(guān)。而與此同時(shí)，errs和雌激素受體α(erα)享有較高的序列同源性，可被非激素信號(hào)激活。err主要包括3個(gè)功能域：n末端結(jié)構(gòu)域(n-terminaldomain,ntd)、dna結(jié)合域(dbd)和配體結(jié)合域(ligand-bindingdomain,lbd)，lbd還包括活化功能2(af2)基序。ntd保守度較低，包含了活化功能區(qū)1(activationfunction,af1)，主要參與轉(zhuǎn)錄后的共價(jià)修飾，例如磷酸化和泛素化的位點(diǎn)修飾。err受體dbd區(qū)域包含兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，主要是識(shí)別和結(jié)合靶基因dna的調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的特殊序列。err位于c端的lbd高度保守，包含用于受體二聚化的配體結(jié)合袋位點(diǎn)，可與輔激活因子如過氧化物酶體增殖因子受體γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ,pparγ)輔活化子1α(pparγcoactivator1α,pgc-1α)、pgc-1β和輔抑制因子相互作用，以此調(diào)節(jié)err的轉(zhuǎn)錄活性(相關(guān)文獻(xiàn)：biancos,et.al,jsteroidbiochemmolbiol.2012,130(3-5):180-185；giguèrev,et.al,coldspringharbsympquantbiol.2011,76:57-61；debloisg,et.al,natrevcancer.2013,13(1):27-36)。

errα在組織中表達(dá)較廣，如心臟、腸道、腦、脊髓、棕色脂肪、骨骼、腎和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中errα均表達(dá)，在其表達(dá)的眾多細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞核，基于特異性環(huán)境、營養(yǎng)或者代謝信號(hào)，參與許多生理過程，尤其是由erα參與調(diào)控的生理過程，并且影響erα的信號(hào)通路。errβ主要與生物發(fā)育相關(guān)，主要表達(dá)在肝、胃、骨骼肌、心臟、腎臟等部位。errγ主要表達(dá)于脊髓、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟及乳腺組織(相關(guān)文獻(xiàn)：steinra,et.al,endocrrelatcancer.2006,13suppl1:s25-32；ariaziea,et.al,currtopmedchem.2006,6(3):203-215；ranhotrahs,jreceptsignaltransductres.2010,30(4):193-205；ariaziea,et.al,cancerres.2002,62(22):6510-6518)。

近年來，研究揭示errα與雌激素相關(guān)的乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌等雌激素依賴性腫瘤密切相關(guān)，更有研究表明眾多非雌激素依賴性腫瘤如前列腺癌、胃腺癌和結(jié)直腸癌等的發(fā)生發(fā)展和臨床預(yù)后也與errα的表達(dá)相關(guān)。臨床研究證實(shí)，errα在乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌及前列腺癌等腫瘤中表達(dá)顯著上調(diào)，是一個(gè)預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。在惡性侵襲性乳腺癌細(xì)胞株mda-mb-231中，下調(diào)errα抑制了mda-mb-231的遷移能力，而再表達(dá)errα則恢復(fù)了mda-mb-231的遷移活性，表明errα在乳腺癌細(xì)胞的遷移中扮演著重要的角色。并且，errα可與hif-1α以蛋白－蛋白相互作用的方式結(jié)合，共調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)缺氧/常氧條件下hif-1α的靶基因轉(zhuǎn)錄。ao等在對(duì)errα參與低氧轉(zhuǎn)錄應(yīng)答與實(shí)體瘤生長(zhǎng)的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，errα可與hif-1α相互作用并促進(jìn)hif-1α誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，對(duì)hif-1α功能影響極為重要。通過上調(diào)/下調(diào)errα表達(dá)或使用errα抑制劑，可以有效抑制缺氧基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而降低體內(nèi)實(shí)體瘤的血管生成與增長(zhǎng)。這些研究表明，errα可能是多種腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)(相關(guān)文獻(xiàn)：suzukit.,et.al,cancerresearch.2004,64(13):4670-4676；steinr.a.,et.al,cancerres.2008,68(21):8805-8812；boudjadis.et.al,amjpathol.2013,183(1):266-276；aoa,et.al,procnatlacadsciusa.2008,105(22):7821-7826)。并且，errα反向激動(dòng)劑xct790抑制了多種腫瘤細(xì)胞的增殖及血管新生。errα反向激動(dòng)劑sr16388有效抑制了裸鼠荷瘤模型中前列腺癌的增長(zhǎng)。這些研究表明，靶向errα的調(diào)節(jié)劑有可能作為臨床上有效的抗腫瘤藥物(相關(guān)文獻(xiàn)：zhangl.,et.al,eurjpharmacol.2015,769:167-176；wuf.,et.al,chembiolinteract.2009,181(2):236-242；wangj.,et.al,cellprolif.2010,43(2):103-113；duellmans.,et.al,biochempharmacol.2010,80(6):819-826.)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于通過研究皮膚鱗狀細(xì)胞癌中errα的臨床意義以及調(diào)控皮膚鱗狀癌細(xì)胞增殖及遷移的分子途徑，結(jié)果顯示了errα可作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌治療新靶點(diǎn)，為皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者的治療提供切實(shí)可行的依據(jù)；下調(diào)或阻斷皮膚鱗狀細(xì)胞癌中errα分子表達(dá)的活性成分在制備抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物上的應(yīng)用。同時(shí)為皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者的診斷提供靈敏度良好的方法和試劑盒，并為治療提供切實(shí)可行的依據(jù)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人探究了errα在皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者的皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中的蛋白表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果顯示，errα在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中豐富表達(dá)，而在正常皮膚組織中則極微弱表達(dá)，標(biāo)志著這也許能成為一個(gè)新型生物標(biāo)志物。

繼而研究發(fā)現(xiàn)了errα在人皮膚鱗狀癌細(xì)胞a431有表達(dá)，errα反向激動(dòng)劑xct790及靶向errα的shrna處理a431后，顯著地抑制了a431的增殖及遷移。xct790將a431細(xì)胞周期阻滯在g0/g1期，誘導(dǎo)了bax上調(diào)及bcl-2下調(diào)。在分子作用機(jī)制上，xct790處理a431后，下調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)，調(diào)控stat3/atr/p53介導(dǎo)的信號(hào)通路。本發(fā)明有助于為膠質(zhì)瘤免疫治療提供新方向。本發(fā)明對(duì)于皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者治療方案的選擇、減少復(fù)發(fā)、改善患者的生存率等都具有重大意義。

本發(fā)明提供了errα在制備診斷或治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥劑中的用途，所述的errα是雌激素相關(guān)受體家族成員。

人errα在ncbi的登錄號(hào)是nm_004451.4，蛋白參見np_004442.3，steroidhormonereceptorerr1isoform1[homosapiens]。

errα可以作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的診斷標(biāo)記。

所述的抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥劑的活性成分是阻斷皮膚鱗狀細(xì)胞癌errα分子表達(dá)的制劑。

本發(fā)明還提供了一種抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥劑，所述的抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥劑的活性成分是阻斷皮膚鱗狀細(xì)胞癌errα分子表達(dá)的制劑；即下調(diào)或阻斷皮膚鱗狀細(xì)胞癌中errα分子表達(dá)的活性成分在制備抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物上的應(yīng)用；所述下調(diào)或阻斷皮膚鱗狀細(xì)胞癌中errα分子表達(dá)的活性成分為errα的拮抗劑或者反向激動(dòng)劑、errα的抗體、針對(duì)errα編碼序列的rna干擾分子或反義寡核苷酸。

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的試劑盒，所述的試劑盒中含有檢測(cè)errα表達(dá)量的試劑，利用該試劑盒檢測(cè)errα表達(dá)量，進(jìn)一步為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的臨床分期、皮膚鱗狀細(xì)胞癌病人預(yù)后或者皮膚鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)程提供佐證；進(jìn)一步地，所述的試劑盒中還含有errα的標(biāo)準(zhǔn)樣品或者分子量標(biāo)記；更優(yōu)選地，所述的試劑盒中含有檢測(cè)errα的擴(kuò)增引物或者結(jié)合多肽。

本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域，發(fā)明公開了errα作為抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)的應(yīng)用。利用此靶點(diǎn)可有效靶向治療抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌，提高療效同時(shí)降低毒副作用，對(duì)于開展抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌的靶向治療乃至開發(fā)新的個(gè)體化綜合治療方式，意義重大。errα目前的用途涉及作為多種腫瘤(但不包括皮膚腫瘤)及代謝性疾病的治療靶點(diǎn)，對(duì)于本發(fā)明涉及的errα在制備治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物中的用途屬于首次公開，由于errα在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，而且下調(diào)errα極顯著抑制皮膚鱗狀癌細(xì)胞的增殖及遷移活性，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，因此，errα在皮膚鱗狀細(xì)胞癌的防治上的應(yīng)用具有開創(chuàng)性的進(jìn)步。

附圖說明

圖1a為實(shí)施例中errαmrna在a431及hacat細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況；

圖1b為實(shí)施例中errα蛋白在a431及hacat細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況；

圖2a顯示了實(shí)施例中errα特異性反向激動(dòng)劑xct790劑量依賴性下調(diào)a431中errαmrna水平的結(jié)果；

圖2b顯示了實(shí)施例中xct790劑量依賴性下調(diào)a431中errα蛋白表達(dá)水平的結(jié)果；

圖2c顯示了實(shí)施例中xct790劑量依賴性抑制a431細(xì)胞增殖的結(jié)果；

圖2d顯示了實(shí)施例中xct790時(shí)間依賴性抑制a431細(xì)胞增殖的結(jié)果；

圖3a顯示了實(shí)施例中errαshrna下調(diào)a431中errαmrna水平的結(jié)果；

圖3b顯示了實(shí)施例中errαshrna下調(diào)a431中errα蛋白表達(dá)水平的結(jié)果；

圖3c顯示了實(shí)施例中errαshrna抑制a431細(xì)胞增殖的結(jié)果；

圖4a顯示了實(shí)施例中xct790抑制a431遷移的結(jié)果；

圖4b顯示了實(shí)施例中errαshrna抑制a431遷移的結(jié)果；

圖5顯示了實(shí)施例中免疫組化測(cè)定errα在人皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織及正常組織中的表達(dá)的免疫組化切片。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。

以下將詳細(xì)說明利用本發(fā)明進(jìn)行的關(guān)于errα在各項(xiàng)生物學(xué)及藥理學(xué)研究?jī)?nèi)容。

實(shí)施例1

使用熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)測(cè)試xct790及errαshrna對(duì)a431(人源皮膚鱗狀癌細(xì)胞)中errα的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。

本實(shí)施例闡明了本發(fā)明涉及的xct790及errαshrna可以有效地抑制人源皮膚鱗狀癌細(xì)胞a431中errα基因的轉(zhuǎn)錄，說明1)errαmrna在人皮膚鱗狀癌細(xì)胞中表達(dá)，且表達(dá)量高于正常皮膚細(xì)胞；2)用xct790或errαshrna顯著下調(diào)了a431中errαmrna水平。熒光定量pcr測(cè)試技術(shù)是本領(lǐng)域工作人員熟悉的技術(shù)。

1、細(xì)胞鋪板：

提前37℃溫浴10％fbs的dmem細(xì)胞培養(yǎng)液和胰酶，將無菌操作臺(tái)用酒精擦拭滅菌之后，將胰酶和dmem細(xì)胞培養(yǎng)液用酒精擦拭之后放進(jìn)無菌操作臺(tái)，取出狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)之后，如細(xì)胞已經(jīng)80％融合之后，開始傳代。洗棄培養(yǎng)皿內(nèi)的舊培養(yǎng)液，用無菌1mlpbs洗3-5遍之后，加入溫浴好的胰酶1ml，水平搖晃培養(yǎng)皿使胰酶分布均勻，消化充分。將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱1-2min，取出細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞間隙變大且細(xì)胞細(xì)胞收回突起變圓，立即加入10％fbs培養(yǎng)液的終止消化，用移液槍輕柔地吹打細(xì)胞，反復(fù)輕柔吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，形成均勻的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度。以細(xì)胞數(shù)5×10⁶個(gè)/孔將細(xì)胞懸液接種至6孔板中，每孔2ml，放入37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，吸棄原10％fbs培養(yǎng)液，并用無菌pbs洗3-5遍之后，換為0.1％fbs培養(yǎng)液，再饑餓培養(yǎng)24h，使細(xì)胞在g0/g1期處于均一化狀態(tài)。

2、細(xì)胞總rna提取與純度檢測(cè)：

1)在6孔板中a431或hacat在被相應(yīng)濃度的xct790(errαshrna)干預(yù)24h后，吸棄細(xì)胞上清舊培養(yǎng)液，每孔加入1mltrnzol試劑，并用1ml移液槍反復(fù)吹打10次左右，使細(xì)胞充分裂解。

2)將trnzol和細(xì)胞混合液倒入1.5ml無菌無rna酶離心管，于室溫靜置5min，以確保核酸蛋白復(fù)合物能夠充分分離。

3)加入200μl氯仿到上述裝有trnzol及細(xì)胞混合液的1.5ml離心管中，蓋緊管蓋后在旋轉(zhuǎn)震蕩儀上搖晃15s左右，于室溫下靜置3min后，于4℃，12000rpm離心機(jī)離心15min。離心后的混合液分為清晰的三層，用移液槍吸取含有rna的最上層水相，用移液槍取約450μl并轉(zhuǎn)移至新離心管中，將剩下的兩層連同離心管一同扔棄。避免誤吸入中間層。

4)以1:1比例向每管加入450μl異丙醇，與每管中的上述上清液輕柔翻轉(zhuǎn)混勻后，將淡黃色的混合液在室溫下放置約20min左右。置于4℃，12000rpm離心機(jī)離心10min，吸棄上清。留取少量上清液體于離心管底部防止rna被吸出，在室溫下將離心管蓋子打開使液體揮發(fā)至離心管底部的白色膠狀沉淀析出，離心管底部的白色膠狀沉淀即為所提rna。

5)再向每個(gè)離心管中加入1mldepc水配制的75％乙醇(防止rna降解)洗滌沉淀。于4℃，5000rpm離心機(jī)離心3min。離心后向沉淀反方向迅速倒掉上清液，蓋緊管蓋，短暫離心。再用移液槍吸棄管中剩余的少量液體。此過程反復(fù)三次，以提高rna純度。

6)室溫下將離心管蓋子打開敞開管口晾干約2～3min后，看到白色沉淀變?yōu)榘胪该骷纯桑R上加入15μldepc處理的ddh2o，反復(fù)吹打使rna充分溶解。

7)取2μl上述已提取的細(xì)胞溶解總rna，以1:50的比例加入98μldepc水稀釋為檢測(cè)樣品。用depc水調(diào)零校準(zhǔn)后，采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品在260nm及280nm處的吸光度值，每個(gè)待測(cè)樣品的吸光度值均重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。并計(jì)算a260/a280的比值，用來檢驗(yàn)所提rna的純度。若所提rna的a260/a280的比值在1.8～2.0區(qū)間范圍內(nèi)，那么可以認(rèn)為所提rna的純度較高，可以用來做后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。用a260吸光度值計(jì)算所提rna的樣品濃度，計(jì)算公式如下。

計(jì)算公式為：rna濃度(μg/μl)＝a260×稀釋倍數(shù)(50)×40×3.3/1000

用depc水調(diào)整將rna樣品濃度調(diào)整為0.5μg/μl方便后續(xù)轉(zhuǎn)錄，于-20℃冰箱保存或者反轉(zhuǎn)錄為cdna保存于4℃冰箱。

3、逆轉(zhuǎn)錄

按下列組份配制rt反應(yīng)液(反應(yīng)液配制請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行)

輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下:

得到的rt反應(yīng)液加入到下一步的realtimepcr反應(yīng)體系中，其加入量不要超過realtimepcr反應(yīng)體積的1/10(v/v)量。

4、realtimepcr

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到擴(kuò)增模板后，選擇premixextaqii進(jìn)行realtimepcr反應(yīng)的操作方法，以gapdh為內(nèi)參條計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，應(yīng)用appliedbiosystems7500pcrsystem進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)液的配制如下：

按下列組份配制pcr反應(yīng)液(反應(yīng)液配制請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行)。

引物終濃度為0.4μm可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時(shí)，可以在0.2-1.0μm范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。

兩步法pcr擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：

stage1：預(yù)變性一個(gè)循環(huán)95℃30秒

stage2：pcr反應(yīng)四十個(gè)循環(huán)95℃5秒60℃34秒

pcr反應(yīng)中的所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，并用滅菌ddh2o調(diào)整至10μm，于-20℃分裝保存，反復(fù)凍融影響引物的擴(kuò)增效果。引物的具體序列如下：

errαf:atctgctggtggttgaacctg

r:agaagcctgggatgctcttg

pcr反應(yīng)的退火溫度和循環(huán)數(shù)等應(yīng)根據(jù)模板dna、引物長(zhǎng)度、目的片段等具體情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，進(jìn)行條件的優(yōu)化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，errαmrna在人皮膚鱗狀癌細(xì)胞a431中表達(dá)，且表達(dá)量高于正常皮膚細(xì)胞hacat中(圖1a)；xct790或errαshrna顯著下調(diào)了a431中errαmrna水平(圖2a及3a)。

實(shí)施例2

使用westernbloting測(cè)試xct790及errαshrna對(duì)a431(人源皮膚鱗狀癌細(xì)胞)中errα蛋白表達(dá)水平的影響。westernbloting細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域工作人員熟悉的技術(shù)。

1、提取a431細(xì)胞總蛋白

xct790或errαshrna干預(yù)相應(yīng)的時(shí)間之后，吸棄原細(xì)胞培養(yǎng)班中舊培養(yǎng)液，用預(yù)冷的pbs將細(xì)胞洗2-3遍，每個(gè)6孔板的孔中加入200μl細(xì)胞ripa裂解液(使用之前數(shù)分鐘之前加入pmsf終濃度為1μm)，用槍吹打數(shù)下，是裂解液和細(xì)胞充分接觸。1-2s之后，細(xì)胞被充分裂解。裂解充分之后，在冰上用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞。用移液槍將裂解液移入1.5ml離心管，吹打混勻，置于冰上30min。于4℃，12000rpm離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至新1.5ml離心管中。

2、a431細(xì)胞總蛋白濃度檢測(cè)及調(diào)整

采用bca蛋白濃度測(cè)定方法測(cè)定每個(gè)蛋白樣品濃度，并將蛋白樣品濃度調(diào)至3μg/μl。加入5×蛋白上樣緩沖液之后，于100℃水中煮沸5min使蛋白樣品變性，并于-80℃分裝凍存，避免蛋白樣品反復(fù)凍融。

3、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳(sds-page)

1)制備12％的sds-page膠

使用bio-rad配套的制膠工具，將兩塊玻璃板對(duì)齊后用夾子夾緊，固定在制膠架上，按以下配方和順序首先制備12％的分離膠：

用移液槍將混合液反復(fù)吹打混勻后，將混合液用移液槍緩慢注入上述的兩塊玻璃板中的夾層之中，注意避免加入分離膠混合液的過程中產(chǎn)生氣泡，每組玻璃板約加入3.5-4ml分離膠混合液，使分離膠混合膠液的液面距玻璃板頂端約2.5cm左右。然后在膠液上層緩慢地加入去離子水用于封膠，將夾了分離膠的玻璃板于室溫靜置30min使分離膠凝固。分離膠凝固之后，緩慢地倒去上層用于封膠的去離子水，并用濾紙吸干玻璃板之間的殘余去離子水。然后按以下配方和順序制備上層5％的濃縮膠：

用移液槍將濃縮膠混合液混勻后緩慢地加在上述的已凝固的分離膠上層，共約加入2ml濃縮膠，最終使膠液液面與玻璃板齊平，并迅速且輕柔地插入梳子，然后用濾紙吸去溢出的膠液，注意避免加入濃縮膠混合液和插入梳子的過程中產(chǎn)生氣泡。于室溫靜置30min使?jié)饪s膠凝固。待濃縮膠凝固后，輕輕拔出梳子，以免使加樣孔變形。

2)蛋白樣品上樣與電泳

將制好的12％的sds-page膠固定在bio-rad配套的電泳槽中，并向電泳槽內(nèi)倒入配置好的1×sds-page電泳緩沖液，加至相應(yīng)的刻度線。取已與5×蛋白上樣緩沖液混勻并煮沸變性的蛋白樣品10μl，冰上冷卻后，并上樣之前用移液槍將蛋白樣品輕柔吹打混勻，然后加至加樣孔中，每孔5μl的蛋白樣品。待全部加樣完畢后，將電泳槽置于鋪滿碎冰的臉盆中防止電泳液溫度過高影響電泳，接通電源后，開始電泳。電泳條件：電壓80v約30min，待樣品進(jìn)入分離膠后換為130v電壓約2h，電泳條件隨目標(biāo)蛋白大小作適當(dāng)調(diào)整。當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至達(dá)分離膠邊緣時(shí)，馬上切斷電源開關(guān)，停止電泳。

4、轉(zhuǎn)膜

按膠上的欲染marker條帶以確定目的蛋白在膠上的位置，然后用切膠板切下目的蛋白所需范圍的膠，將切下的膠輕柔緩慢地放到膜轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡。用尺子量好切下的膠的尺寸并按切下凝膠尺寸大小裁剪6層濾紙(三層+三層)和pvdf膜，應(yīng)該使膜的尺寸比凝膠略大一些，而濾紙尺寸應(yīng)小于或者等于膠的尺寸，這樣可以防止夾在凝膠最外層的兩層濾紙接觸造成短路。剪好pvdf膜之后，將剪好的pvdf膜放入甲醇中使甲醇剛好沒過pvdf膜，浸泡5-10s，泡到膜全透明。然后再將pvdf膜與六層濾紙一同放入轉(zhuǎn)膜液中再浸泡約2～3min。用平頭鑷制作轉(zhuǎn)膜的“三明治”結(jié)構(gòu)，即從上至下分別為：3層濾紙→膠→pvdf膜→3層濾紙，每加上一層濾紙或者pvdf膜時(shí)都要用轉(zhuǎn)膜液充分潤濕并用玻璃棒搟走層與層之間的氣泡以避免影響轉(zhuǎn)膜效率?！叭髦巍鞭D(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)做好后，先在半干轉(zhuǎn)膜儀的陽極板上滴加少許轉(zhuǎn)膜液，再將“三明治”結(jié)構(gòu)平放于半干轉(zhuǎn)膜儀的陽極板上，再在“三明治”結(jié)構(gòu)周圍滴加少許轉(zhuǎn)膜液，然后按照順序蓋上陰極金屬板與外蓋并接通電源。以100ma恒流轉(zhuǎn)膜30min。待轉(zhuǎn)膜完畢后，將pvdf膜取出，在pvdf膜正面左上角剪去一個(gè)角，作為區(qū)分正反面的標(biāo)記。

5、封閉

將已轉(zhuǎn)膜完畢的pvdf膜用tbst洗去殘余在膜上的轉(zhuǎn)膜液，置于孵育盒中，然后加入現(xiàn)配的含5％脫脂奶粉的封閉液封閉pvdf膜，封閉液沒過膜為最佳。于室溫下?lián)u床封閉2h或者4℃冰箱過夜。

6、目的蛋白一抗、二抗的孵育

將pvdf膜封閉完畢后，吸棄封閉液。用現(xiàn)配5％脫脂奶粉的封閉液稀釋目的蛋白一抗，然后加入孵育盒中孵育pvdf膜，使上述一抗稀釋液沒過pvdf膜，用保鮮膜密封抗體孵育盒，防止揮發(fā)，于4℃冰箱中靜置孵育過夜。

目的蛋白一抗稀釋比如下：

目的蛋白一抗孵育完畢后，回收一抗稀釋液，可重復(fù)利用，用tbst洗pvdf膜，重復(fù)5次，每次10min。用tbst稀釋二抗，然后加入到含有pvdf膜孵育盒中，使稀釋的二抗沒過pvdf膜，用保鮮膜密封孵育盒防止揮發(fā)，并于室溫?fù)u床孵育1h。

二抗稀釋比如下：

二抗孵育完畢后，回收二抗稀釋液，pvdf膜再用tbst洗5次，每次10min。

7、發(fā)光、曝光與顯影

按用于顯影的a液和b液以體積比1:1的比例配制顯影發(fā)光液，用于滴加于已處理的pvdf膜上顯影，以1cm×6cm的膜需要發(fā)光液100μl左右計(jì)算添加pvdf膜上的顯影發(fā)光液的體積。待顯影發(fā)光液與pvdf膜反應(yīng)1-2min后，用平頭鑷將pvdf膜轉(zhuǎn)移至發(fā)光暗盒的透明薄膜袋中，并在暗房中用x光顯影盒壓片曝光。然后將膠片放于顯影液中浸泡30s，清水中沖洗后，置于定影液中再浸泡30s，清水中沖洗后，觀察條帶深淺，如果條帶太不清晰，則延長(zhǎng)曝光時(shí)間，如果條帶太粗，則縮短曝光時(shí)間，重新壓片，如此可以得到最佳的曝光效果。具體曝光時(shí)間的長(zhǎng)短取決于條帶的亮度，首次曝光30s為佳以觀察條帶亮度，普通樣品的曝光時(shí)間1-3min之間調(diào)整。

8、條帶圖像處理

用gelimageanalysis圖像處理系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行光密度掃描，以目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶的光密度比值作為各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值作圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，errα蛋白在人皮膚鱗狀癌細(xì)胞a431中表達(dá)，且表達(dá)量高于正常皮膚細(xì)胞hacat中(圖1b)；xct790或errαshrna顯著下調(diào)了a431中errα蛋白表達(dá)水平(圖2b及圖3b)。

實(shí)施例3

使用cck-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定xct790及errαshrna對(duì)a431(人源皮膚鱗狀癌細(xì)胞)的增殖抑制效應(yīng)。

本實(shí)施例闡明了本發(fā)明涉及的errα被特異性反向激動(dòng)劑xct790或shrna下調(diào)后，可以有效地抑制人皮膚鱗狀癌細(xì)胞株a431的增殖，說明本發(fā)明所涉及的errα在人皮膚鱗狀癌細(xì)胞株的體外增殖中顯示了極其重要的關(guān)鍵效應(yīng)。cck-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域工作人員熟悉的技術(shù)。

1、a431細(xì)胞培養(yǎng)及鋪種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：

取出狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的a431，觀察細(xì)胞形態(tài)之后，如細(xì)胞已經(jīng)80％融合之后，開始傳代。洗棄培養(yǎng)皿內(nèi)的舊培養(yǎng)液，用無菌1mlpbs洗3-5遍之后，加入溫浴好的胰酶1ml，水平搖晃培養(yǎng)皿使胰酶分布均勻，消化充分。將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱1-2min，取出細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞間隙變大且細(xì)胞細(xì)胞收回突起變圓，立即加入10％fbs培養(yǎng)液的終止消化，用移液槍輕柔地吹打細(xì)胞，反復(fù)輕柔吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，形成均勻的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度。以細(xì)胞數(shù)5×10³個(gè)/孔將細(xì)胞懸液接種至96孔板中，每孔200μl，放入37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，吸棄原10％fbs培養(yǎng)液，并用無菌pbs洗3-5遍之后，換為0.1％fbs培養(yǎng)液，再饑餓培養(yǎng)24h，使細(xì)胞在g0/g1期處于均一化狀態(tài)。

2、檢測(cè)

化合物xct790或errαshrna干預(yù)a431細(xì)胞48h后，吸棄96孔板中的舊培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液，并在每孔加入10μlcck-8試劑，置于37℃5％co2培養(yǎng)箱中孵育2h。采用9602酶標(biāo)分析儀，在單波長(zhǎng)450nm處檢測(cè)吸光度值(a450)。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率計(jì)算公式：抑制率(％)＝(od化合物-odbasic)/(odcontrol-odbasic)×100。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，xct790或errαshrna可以有效地抑制人皮膚鱗狀癌細(xì)胞株a431的增殖(圖2c，圖2d及圖3c)，說明本發(fā)明所涉及的errα在人皮膚鱗狀癌細(xì)胞株的增殖中顯示了極其重要的關(guān)鍵效應(yīng)。

實(shí)施例4

使用transwell腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)測(cè)定化合物對(duì)xct790及errαshrna對(duì)a431(人源皮膚鱗狀癌細(xì)胞)的遷移功能的影響。

本實(shí)施例闡明了xct790及errαshrna可以有效地抑制人源皮膚鱗狀癌細(xì)胞a431的遷移，說明errα在皮膚鱗狀癌細(xì)胞遷移中發(fā)揮至關(guān)重要的效應(yīng)。transwell腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域工作人員熟悉的技術(shù)。

1、制備transwell小室：

用matrigel1:8(50mg/l)稀釋液包被transwell小室底部膜的上室面用來包被基底膜，并于4℃風(fēng)干。待風(fēng)干之后，水化基底膜，吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/l的bsa無血清dmem培養(yǎng)液，并在37℃培養(yǎng)箱中，孵育30min。

2、制備細(xì)胞懸液：

1)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，待細(xì)胞傳代貼壁后，換成1％fbs的dmem細(xì)胞培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12-24h，去除血清對(duì)細(xì)胞遷移的影響。

2)消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用pbs洗1-2遍，用1％fbs的dmem細(xì)胞培養(yǎng)液重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1-10×10⁵，并盡量保證對(duì)照組和處理組細(xì)胞密度一致。

3、接種細(xì)胞：

1)取細(xì)胞懸液200μl加入transwell小室，并在transwell上室內(nèi)加入1、5、10、20μm的xct790

2)24孔板下室加入500μl含10ng/mlvegf的培養(yǎng)基(在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板)

3)將24孔板37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6，12，24h。

4、染色：

1)棄去孔中培液，用90％酒精常溫固定30min。

2)染色：采用0.1％結(jié)晶紫染色。首先配制用0.1％結(jié)晶紫染色，然后0.1％結(jié)晶紫常溫染色10min，清水漂凈，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞。

5、細(xì)胞計(jì)數(shù)：

使用leicadc300f正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照(100×)，把transwell小室反過來底朝上則可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。抑制率計(jì)算公式為：抑制率(％)＝(對(duì)照組細(xì)胞計(jì)數(shù)-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞計(jì)數(shù))/對(duì)照組細(xì)胞計(jì)數(shù)×100％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，xct790及errαshrna顯著抑制a431(人源皮膚鱗狀癌細(xì)胞)的遷移(圖4a及圖4b)，表明下調(diào)errα可以抑制皮鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

實(shí)施例5

使用免疫組織化學(xué)檢測(cè)errα在人皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織及正常皮膚組織中的表達(dá)。免疫組織化學(xué)是本領(lǐng)域工作人員熟悉的技術(shù)。

免疫組織化學(xué)染色步驟如下：

1、脫蠟和水化：

將腦組織石蠟切片置于二甲苯i中30min，二甲苯ii中20min，二甲苯iii中10min，在無水乙醇中浸泡5min，95％乙醇中浸泡5min，80％乙醇中浸泡5mins，60％乙醇中浸泡5min，單蒸水中浸泡5min。

2、抗原修復(fù)：

取一定量的cb緩沖液于一耐高溫容器里，放進(jìn)微波爐中，power10×2min，使之沸騰。然后把切片小心放入其中，再緩緩放入微波爐中加熱，power3×5min。最后，放在室溫自然冷卻30-40min。

3、染色：

取出切片，tbs沖洗4-5次，甩干擦凈。加入30ulh2o2，于室溫濕盒中封閉30min，甩干擦凈。滴加errα一抗(1:200)40ul，4℃過夜，tbst沖洗4-5次，滴加生物素化二抗20ul，室溫孵育1h，tbs沖洗4-5次，滴加酶標(biāo)親和素20ul，室溫孵育30min，tbs沖洗4-5次，滴加30ul底物著色后迅速?zèng)_洗干凈，滴加1滴蘇木精，5-10min，脫水，封片，鏡檢。

本實(shí)施例闡明了errα在人皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織高表達(dá)，而在正常皮膚組織表達(dá)極為微弱(圖5)，說明errα能夠成為人皮膚鱗狀細(xì)胞癌的診斷標(biāo)志物。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。