本發(fā)明涉及水稻分子遺傳育種領(lǐng)域，特別是涉及一種與水稻柱頭外露率qtl連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻是全球過億人口的重要糧食作物。最早開發(fā)于二十世紀(jì)七十年代中國的雜交水稻制種技術(shù)，近年來在水稻生產(chǎn)上已取得長足進步。為應(yīng)對全球人口快速增長帶來的糧食緊缺，培育高產(chǎn)雜交稻被認(rèn)為是解決這一國際性問題的有效策略。通過廣泛觀察水稻不同品種內(nèi)以及在不同品種間柱頭外露的表現(xiàn)變化，virmani和athwal(virmaniss,athwalds.1973.geneticvariabilityinfloralcharacteristicsinfluencingout-crossinginoryzasatival.cropscience,13,66–67.)提出了柱頭外露受多基因控制的假說，鑒于該性狀非常復(fù)雜以及易受環(huán)境因素影響，傳統(tǒng)通過在田間直接觀測柱頭外露率來選種顯得效率十分低下。近年來dna標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展以及連鎖圖譜的建立使得控制復(fù)雜遺傳性狀(例如，柱頭外露等)數(shù)量性狀位點(qtl)的檢測變得切實可行，并在實際育種工作中得到應(yīng)用。利用不同的分離群體，可進行柱頭外露率的qtl分析。雜交水稻在過去30年已為水稻產(chǎn)量的提升立下汗馬功勞，然而至今一個仍未解決的問題是如何提高雜交稻的制種產(chǎn)量，而柱頭外露率則是雜交稻制種生產(chǎn)中的一個關(guān)鍵決定因素。

具有高柱頭外露率的水稻可以捕獲更多花粉并通過提高結(jié)實率來有效提升雜交稻制種產(chǎn)量。露出的柱頭大約可以保持4天并可持續(xù)授粉。近年來在dna標(biāo)記技術(shù)上的突破和進步為我們提高了柱頭外露的遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究并將其應(yīng)用于實際育種工作中。例如，在由秈稻ir24和粳稻asominori組配而成的重組自交系群體中檢測到9個控制柱頭外露的qtl。在另一個由秈稻pei-kuh和野生稻w1944(普通野生稻)衍生而來的重組自交系群體中則檢測到了2個控制柱頭外露的qtl。但目前為止，這些qtl在雜交稻保持系中是否作為有遺傳背景的有效候選基因而發(fā)揮效能仍未可知。

婁等(louj,yuegh,yangwq,meihw,luolj,luhj.2014.mappingqtlsinfluencingstigmaexertioninrice.bulgarianjournalofagriculturalscience,20,1450-1456.)利用兩個秈稻細胞質(zhì)雄性不育保持系(huhan1b和k17b)衍生而來的f2群體定位控制水稻柱頭外露率的qtl。用一張包含了92個ssr標(biāo)記的連鎖圖檢測了影響單柱頭外露率(sse)、雙柱頭外露率(dse)以及總柱頭外露率的qtl。結(jié)果在第5、6和第7染色體上分別檢測到1個、3個和1個qtl分別控制sse、dse以及tse。嚴(yán)等(yan,w.g.,li,y.,agrama,h.a.,luo,d.,gao,f.,lu,x.,ren,g.(2009).associationmappingofstigmaandspikeletcharacteristicsinrice(oryzasatival.).molecularbreeding.24,277-292.)利用109個dna標(biāo)記在90個不同品種芯片中的表現(xiàn)，做了相關(guān)性作圖實驗，結(jié)果表明，簡單重復(fù)序列(ssr)標(biāo)記rm5與單柱頭外露以及雙柱頭外露具有極顯著相關(guān)性，并且發(fā)揮主要作用。應(yīng)用來源于秈稻guangluai-4和野生稻w1943的兩個分離群體，李等(lip,fengf,zhangq,chaoy,gaog,hey.2014.geneticmappingandvalidationofquantitativetraitlociforstigmaexertionrateinrice.molecularbreeding,34,2131-2138.)報道柱頭外露率是個復(fù)雜數(shù)量性狀并受多基因控制。他們進一步完成了遺傳作圖并驗證了控制水稻柱頭外露率的qtl。為進一步解析柱頭外露的遺傳基礎(chǔ)，由兩個優(yōu)異水稻品種(中國香稻和川香29b)培育而來的重組自交系用于檢測qtl，結(jié)果2年中共檢測到11個qtl，其中第1染色體和第6染色體上分別檢測到2個qtl和4個qtl，形成兩個qtl簇，分別為qse1和qse6。

由上可知，控制水稻柱頭外露率的qtl研究將對雜交稻的制種產(chǎn)量起到重要作用，因此，需要進一步挖掘相關(guān)qtl。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與水稻柱頭外露率qtl連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種與水稻柱頭外露率qtl連鎖的分子標(biāo)記，所述水稻柱頭外露率qtl包括水稻單柱頭外露率qsse11和水稻總柱頭外露率qtse11；所述分子標(biāo)記為ssr分子標(biāo)記rm286，所述分子標(biāo)記rm286的上游引物為ctggcctctagctacaaccttgc(seqidno.1所示)，下游引物為aaactctcgctggattcgatagg(seqidno.2所示)。

進一步地，所述水稻柱頭外露率qtl還包括水稻單柱頭外露率qsse10，水稻雙柱頭外露率qdse10、qdse11，及水稻總柱頭外露率qtse10；所述分子標(biāo)記rm286與所述的qdse11連鎖，所述的分子標(biāo)記還包括與qsse10、qdse10、qtse10連鎖的分子標(biāo)記ind133，所述分子標(biāo)記ind133的上游引物為aattcttatggacggatacgc(seqidno.3所示)，下游引物為tcagcatctcgtaagcaaaaa(seqidno.4所示)。

進一步地，所述水稻柱頭外露率qtl還包括水稻總柱頭外露率qtse6；所述的分子標(biāo)記還包括與qtse6連鎖的分子標(biāo)記ind94，所述分子標(biāo)記ind94的上游引物為ggcattgtagccaatccaga(seqidno.5所示)，下游引物為aaacacactcccccatgaga(seqidno.6所示)。

進一步地，所述水稻柱頭外露率qtl還包括水稻單柱頭外露率qsse5、水稻總柱頭外露率qtse5；所述的分子標(biāo)記還包括與qsse5、qtse5連鎖的分子標(biāo)記rm3638，所述分子標(biāo)記rm3638的上游引物為cagatccatccaagcgagagtacg(seqidno.7所示)，下游引物為atagcgaggaggaagaggaggagagg(seqidno.8所示)。

本發(fā)明還提供了一種檢測水稻柱頭外露率的試劑盒，其含有上述的與水稻柱頭外露率qtl連鎖的分子標(biāo)記。

本發(fā)明還提供了上述與水稻柱頭外露率qtl連鎖的分子標(biāo)記在輔助篩選水稻高柱頭外露率中的應(yīng)用。

本發(fā)明以具有高柱頭外露率的協(xié)青早b作為供體，低柱頭外露率的中恢9308為受體，建立75株系的染色體片段代換系(cssl)，并用以qtl定位。在浙江、海南兩個環(huán)境中分別對cssl群體檢測3個和開花習(xí)性相關(guān)的性狀，包括單柱頭外露率(sse)、雙柱頭外露率(dse)以及總柱頭外露率(tse)。并且，檢測到了控制柱頭外露的qtl。本發(fā)明通過上述qtl的定位，找到與各qtl連鎖的分子標(biāo)記，可通過分子標(biāo)記輔助育種(mas)，選擇高柱頭外露率的雜交稻制種品種，通過提高制種品種的柱頭外露率將有助于提高水稻異交結(jié)實率，進而可以提高雜交稻的制種產(chǎn)量；本發(fā)明還為今后精細定位及基因克隆提供了研究基礎(chǔ)。

附圖說明

上述僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，以下結(jié)合附圖與具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明。

圖1是75株系協(xié)青早bx中恢9308cssl群體構(gòu)建過程及步驟；

圖2是水稻形態(tài)及柱頭外露表型圖；其中，(a)中恢9308植物形態(tài)(左)和協(xié)青早b植物形態(tài)(右)，(b)中恢9308柱頭外露表型(左，柱頭是棕色的顏色，所以不可見)和協(xié)青早b柱頭外露表型(右)；(c)小穗中的柱頭外露表型圖；

圖3是海南和浙江環(huán)境中cssl群體sse、dse以及tse的頻率分布圖；其中，單向箭頭和雙向箭頭分別顯示中恢9308和協(xié)青早b的平均值；

圖4是構(gòu)建于協(xié)青早b和中恢9308的cssl群體中單柱頭外露率(sse)、雙柱頭外露率(dse)以及總柱頭外露率(tse)的qtl染色體定位圖；其中三角形、正方形和圓形分別代表sse、dse和tse的qtl定位。

具體實施方式

1材料與方法

1.1植株材料

如圖1所示，利用協(xié)青早b和中恢9308分別作為父母本，再通過一系列的自交和回交構(gòu)建75株系的染色體片段代換系(cssl),其中協(xié)青早b具有高柱頭外露率，而中恢9308具有低柱頭外露率。

1.2田間試驗

75株系的cssl及父母本分別種植于海南島陵水和浙江富陽中國水稻研究所基地，2014年12月20日播種于陵水，2015年6月15日播種于富陽。每株系6行8株種植，30cm*20cm行間距。標(biāo)準(zhǔn)田間管理。

1.3性狀檢測

柱頭外露可分為3個性狀：單柱頭外露率(sse)、雙柱頭外露率(dse)及總柱頭外露率(tse)。開花5-7天后分別從父母本及各株系植株上取樣，各取5個穗子，在最底部小花開花后才開始觀察。柱頭外露率的計算公式采用以下公式：

sse(％)＝[sse/(sse+dse+無柱頭外露)]×100

dse(％)＝[dse/(sse+dse+無柱頭外露)]×100

tse(％)＝sse(％)+dse(％)

其中，圖2所示為水稻形態(tài)及柱頭外露表型圖；其中，(a)中恢9308植物形態(tài)(左)和協(xié)青早b植物形態(tài)(右)，(b)中恢9308柱頭外露表型(左，柱頭是棕色的顏色，所以不可見)和協(xié)青早b柱頭外露表型(右)；(c)小穗中的柱頭外露表型圖。

1.4遺傳圖譜構(gòu)建及qtl分析

分析87個ssr標(biāo)記和33個indel標(biāo)記，在父母本間表現(xiàn)多態(tài)的標(biāo)記應(yīng)用于cssl群體中。用復(fù)和區(qū)間作圖法(cim),使用軟件qtlcimapping4.0軟件(王2009)檢測qtl,當(dāng)lod值≥2.50且p≤0.05，假定檢測到一個qtl。貢獻率(h²)估計方差的比例在總表型變異上分為上位性效應(yīng)和加性效應(yīng)。qtl名稱根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)命名(mccouch2008)。

2結(jié)果

2.1cssl群體及其兩親本的柱頭外露率

表型數(shù)據(jù)分析顯示,親本協(xié)青早b(xqzb)和中恢9308(zh9308)種植于浙江的植株其sse、dse和tse均大于種植于海南的植株；并且僅在xqzb親本中其雙柱頭外露率顯示統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異(表1)。cssl群體中，浙江植株的sse、dse和tse數(shù)值均大于海南植株的數(shù)值，并且sse和tse顯著差異。然而dse在兩地環(huán)境中并未顯示顯著差異。cssl群體中sse、dse和tse的最高數(shù)值分別：海南32.71,5.36,38.07；浙江29.73,5.14和34.87。配合圖3所示，其中sse(圖3a)和tse(圖3c)表現(xiàn)連續(xù)變異并在兩個環(huán)境中均顯示正態(tài)分布。另外，所有性狀均觀測到了偏分離。

表1cssl群體及親本柱頭外露率表現(xiàn)

^*，顯著性在0.05水平；sse,單柱頭外露率；dse,雙柱頭外露率；tse,總柱頭外露率；±se,標(biāo)準(zhǔn)誤。

在各自環(huán)境中，sse、dse和tse均表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。海南環(huán)境下最高表型相關(guān)性產(chǎn)生于hsse和htse之間(r＝0.997^**)，緊接著是hdse和htse之間(r＝0.890^**)，再次為hsse和hdse之間(r＝0.852^**)；而浙江環(huán)境下最高相關(guān)性則出現(xiàn)于zjsse和zjtse之間(r＝0.996^**)，緊接著是zjdse和zjtse之間(r＝0.889^**)，再次為zjsse和zjdse之間(r＝0.844^**)，詳見于表2。以上結(jié)果顯示sse具有更大數(shù)值的植株更有可能通過提升dse數(shù)值進而最終提高tse數(shù)值。

表2海南和浙江兩地環(huán)境中協(xié)青早b和中恢9308衍生的75株系cssl群體相關(guān)系數(shù)(皮爾森指數(shù))

^**顯著性相關(guān)在0.01水平上；hsse,海南單柱頭外露率；hdse,海南雙柱頭外露率；htse,海南總柱頭外露率；zjsse，浙江單柱頭外露率；zjdse,浙江雙柱頭外露率；zjtse,浙江總柱頭外露率。

2.2方差分析與環(huán)境波動

基于固定效應(yīng)模型的方差分析(anova)顯示cssl群體在兩個環(huán)境之間(海南和浙江)具有極顯著差異。浙江環(huán)境中所有性狀均有所提高(表3)。顯然，浙江環(huán)境有利于提高柱頭外露率。

表3兩環(huán)境中75個cssl群體基于固定效應(yīng)模型的anova結(jié)果

^***，在0.001水平上極顯著；行，cssl群體；環(huán)境，海南和浙江；ms，均方。

分別收集2015年在海南和浙江3、4、5月和8、9、10月的溫度信息。海南和浙江所記錄的信息顯示3-8月、4-9月以及5-10月具有顯著差異(表4)。

表4兩環(huán)境(浙江和海南)月溫度的比較研究

**,在0.01水平上極顯著；***,在0.001水平上極顯著；±se,標(biāo)準(zhǔn)誤。

2.3柱頭外露率的qtl分析

兩個環(huán)境中共檢測到9個qtl，分別分布于染色體5、6、10和11，lod值在2.74和6.33之間(表5)。每個qtl可解釋表型變異在12.26％到25.44％之間。例如，在染色體5、10、11上分別檢測到單柱頭外露率sse的qtlqsse5、qsse10以及qsse11。qtlqsse5在浙江環(huán)境下可解釋13.03％的表型變異，等位基因來自zh9308，具2.32的負向加性效應(yīng)。qsse10以及qsse11在兩個環(huán)境下均被檢測到，在海南環(huán)境下可解釋21.03和13.99％的表型變異，而在浙江環(huán)境下則可解釋20.01和18.79％的表型變異，等位基因均來自于qxzb，在海南和浙江環(huán)境下分別具有12.04和3.29，以及5.62和3.19的加性效應(yīng)。對于雙柱頭外露率而言，染色體10和11上分別檢測到qdse10以及qdse11，且在海南和浙江兩地環(huán)境中均檢測到。海南環(huán)境下分別解釋25.44％和22.04％的表型變異，而在浙江環(huán)境下則解釋21.53％和12.26％的表型變異。兩qtl作用位點均來自于qxzb并在海南和浙江環(huán)境下分別具有2.21和1.20以及1.95和0.86的加性效應(yīng)。在染色體5、6、10以及11上共檢測到4個qtl控制總柱頭外露率。其中qtse5在浙江環(huán)境下可解釋13.04％表型變異率，等位基因來自于zh9308，具有4.63的負向加性效應(yīng)。qtse6在海南環(huán)境下被檢測到，解釋17.60％表型變異，作用位點來自于xqzb，具有14.44的正向加性效應(yīng)。qtse10和qtse11在兩地環(huán)境中均被檢測到，在海南環(huán)境下解釋22.45和13.99％表型變異，在浙江環(huán)境下解釋20.01和18.80％的表型變異，等位基因均來自于xqzb,分別具有14.25和6.59以及11.24和6.37的加性效應(yīng)。有趣的是，大部分qtl均集中于染色體5、10和11上的3個區(qū)域內(nèi)，僅有tse的qtl發(fā)現(xiàn)于染色體6上(圖4)。因此，這3個區(qū)域可作為xqzb和zh9308控制柱頭外露率的候選遺傳片段。

表5在海南和浙江兩地檢測到的構(gòu)建于xqzb和zh9308的cssl群體中檢測到的qtl

a,qtl的加性效應(yīng)；pve,每個qtl解釋的表型變異；lod,對數(shù)倍率值；qsse,單柱頭外露率的qtl；qdse,雙柱頭外露率的qtl；qtse,總柱頭外露率的qtl。

2.4上位性與環(huán)境互作

本發(fā)明共檢測到4個位點的相互作用(表6)。3個發(fā)生于顯著主效應(yīng)之間，一個發(fā)生于非主效應(yīng)之間。

表6利用icimapping軟件雙位點互作分析檢測到上位性效應(yīng)以及環(huán)境互作效應(yīng)，lod值為5.0.

lod,對數(shù)倍率值；pve,單個qtl解釋表型變異；add，單個qtl加性效應(yīng)；m(qq),qq的qtl基因型平均值(xqzb基因型標(biāo)記為2)；m(qq)，qq的qtl基因型平均值(zh9308基因型標(biāo)記為0)。

3討論

本發(fā)明公開了兩個不同環(huán)境中柱頭外露率的qtl。開花期間的外露柱頭非常脆弱并且能被環(huán)境條件輕易損毀(例如，風(fēng)、水壓、或機械損傷)。本發(fā)明中，我們針對以往研究方法，提出了幾個新的檢測手段及方法，在以往研究中，開花期收集穗子以免損毀外露的柱頭并確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，而在其他研究中則于開花7-10天后收集穗子。盡管一些柱頭非常脆弱，但我們注意到，仍有不少雌蕊在灌漿期仍然開花。本發(fā)明中，當(dāng)?shù)撞啃∷腴_花5-7天后，分別收集父母本的5個主穗以及cssl每株系的5個主穗。海南和浙江兩個環(huán)境中，開花期的溫度具有顯著差異(表4)。兩個環(huán)境中的cssl群體在基于固定效應(yīng)模型的anova分析中顯示高度顯著差異(表3)。與海南相比，浙江環(huán)境下所有性狀均有所增加(表1)。以上數(shù)據(jù)表明，浙江的環(huán)境因子更有利于提高柱頭外露率。已檢測的qtl中，在兩個環(huán)境下有6個qtl是穩(wěn)定的，而有3個是不穩(wěn)定的，由于受到環(huán)境條件影響，例如溫度、風(fēng)、水壓以及機械性損傷。

本發(fā)明共定位了控制柱頭外露率的4個標(biāo)記，分別為：5號染色體的rm3638(seqidno.7、8所示)與qsse5、qtse5連鎖；6號染色體的ind94(seqidno.5、6所示)與qtse6連鎖；10號染色體的ind133(seqidno.3、4所示)與qsse10、qdse10、qtse10連鎖；以及11染色體的rm286(seqidno.1、2所示)與qsse11、qdse11、qtse11連鎖。

表6顯示此研究中共檢測到4個上位性互作，3個位于主效基因之間，1個位于微效基因之間。具有大效應(yīng)值的qtl已被確定為數(shù)量性狀遺傳改良的重要資源。本發(fā)明中，第11染色體上與rm286連鎖的眾多qtl(例如qsse11,qdse11,和qtse11等)形成連鎖簇；第10染色體上的標(biāo)記ind133與眾多qtl(例如qsse10,qdse10,和qtse10)連鎖，形成qtl連鎖簇。sse、dse和tse之間具有強烈正相關(guān)作用。

4結(jié)論

在染色體5、6、10、11上我們共檢測到了9個qtl,其中qses5,qsse10,qsse11,qdse10,qdse11,qtse5,qtse6,qtse10andqtse11分別控制單柱頭外露率(sse)雙柱頭外露率(dse)及總柱頭外露率(tse)。6個qtl在海南和浙江兩地環(huán)境中均檢測到(qsse10,qsse11,qdse10,qdse11,qtse10andqtse11)，1個僅發(fā)現(xiàn)于海南(qtse6)，2個發(fā)現(xiàn)于浙江(qsse5andqtse5)。sse,dse和tse以一種環(huán)境依賴性方式強烈互作。qsse10,qsse11,qdse10,qdse11,qtse6,qtse10andqtse11等位基因來自于協(xié)青早b,表現(xiàn)正向加性效應(yīng)，而qsse5和qtse5等位基因來自于中恢9308,表現(xiàn)負向加性效應(yīng)。柱頭外露對于異花自交的水稻作用而言，宜將單、雙及總柱頭外露分開考慮，用以進一步探討如何在今后遺傳改良中實現(xiàn)雜交稻種子的增產(chǎn)作用。

綜上所述，本發(fā)明的定位結(jié)果及得到的分子標(biāo)記結(jié)果將有助于將高柱頭外露的細胞質(zhì)雄性不育系應(yīng)用于雜交稻制種生產(chǎn)中。

序列表

<110>中國水稻研究所

<120>一種與水稻柱頭外露率qtl連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用

<160>8

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列（rm286上游引物）

<400>1

ctggcctctagctacaaccttgc23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列（rm286下游引物）

<400>2

aaactctcgctggattcgatagg23

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列（ind133上游引物）

<400>3

aattcttatggacggatacgc21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列（ind133下游引物）

<400>4

tcagcatctcgtaagcaaaaa21

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（ind94上游引物）

<400>5

ggcattgtagccaatccaga20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（ind94下游引物）

<400>6

aaacacactcccccatgaga20

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（rm3638上游引物）

<400>7

cagatccatccaagcgagagtacg24

<210>8

<211>26

<212>dna

<213>人工序列（rm3638下游引物）

<400>8

atagcgaggaggaagaggaggagagg26