技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及液體深層發(fā)酵靈芝有效成份提取技術(shù)，具體地說(shuō)是一種從從液體深層發(fā)酵靈芝（含靈芝發(fā)酵液和靈芝菌絲體）中提取靈芝肽的方法。

背景技術(shù)：

靈芝被我國(guó)歷代醫(yī)藥學(xué)家譽(yù)為扶正固本的“瑞草”，對(duì)靈芝的藥理作用已有大量研究，研究表明靈芝具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤作用、免疫調(diào)節(jié)作用、抗放射與抗化療作用、鎮(zhèn)靜安神作用、強(qiáng)心及抗心肌缺血作用、調(diào)節(jié)血脂作用、降血糖作用、平喘作用、保肝作用、抗缺氧和抗衰老作用等。隨著現(xiàn)代科學(xué)對(duì)靈芝研究的深入，至目前為止，總共分離到350余種化學(xué)成分，主要是多糖類、肽類、氨基酸類、萜類、生物堿類、甾醇類、維生素類等。

人體很多活性物質(zhì)都是以肽的形式存在的。肽涉及人體的激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和生殖各領(lǐng)域，其重要性在于調(diào)節(jié)體內(nèi)各個(gè)系統(tǒng)和細(xì)胞的生理功能，激活體內(nèi)有關(guān)酶系，促進(jìn)中間代謝膜的通透性，或通過(guò)控制DNA轉(zhuǎn)錄或影響特異的蛋白合成，最終產(chǎn)生特定的生理效應(yīng)。肽是涉及人體內(nèi)多種細(xì)胞功能的重要物質(zhì)。肽可以合成細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能活動(dòng)。肽在人體作為神經(jīng)遞質(zhì)，傳遞信息。肽可在人體作為運(yùn)輸工具，將人體所食的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與各種維生素、生物素、鈣及對(duì)人體有益的微量元素輸送到人體各細(xì)胞、器官和組織。肽是人體重要的生理調(diào)節(jié)物，它可全面調(diào)節(jié)人體生理功能，增強(qiáng)和發(fā)揮人體生理活性，它具有重要的生物學(xué)功能。肽對(duì)人的細(xì)胞活性、功能活動(dòng)、生命存在太重要了。

其中運(yùn)用液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的靈芝菌絲中含有非常豐富的活性多肽，其含量是栽培靈芝子實(shí)體和靈芝孢子粉的5~10倍。從液體深層發(fā)酵靈芝中提取靈芝肽，具有非?？捎^的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，現(xiàn)有技術(shù)中還不存在該提取的技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種通過(guò)多種復(fù)合酶解處理，經(jīng)膜過(guò)濾、干燥獲得高純度靈芝肽粉的液體深層發(fā)酵靈芝后提取靈芝肽的方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的液體深層發(fā)酵靈芝后提取靈芝肽的方法，包括以下步驟：

A:芝深層發(fā)酵培養(yǎng)

a、靈芝菌種培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度為25～26℃，

取靈芝菌種在菌種培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～30天；

b、搖床種：保持溫度在25～26℃，在30L攪拌罐中裝入所述步驟1)中培養(yǎng)有靈芝菌種的菌種培養(yǎng)基，用水稀釋，然后置于振蕩器上，攪拌3～4天，控制攪拌速度為100～120轉(zhuǎn)/min；

c、一級(jí)放大：保持溫度在25～26℃，將所述步驟b中稀釋攪拌后的培養(yǎng)基負(fù)壓吸入300L種子罐中，培養(yǎng)2～3天；

d、二級(jí)放大：保持溫度在25～26℃，將所述步驟c中攪拌后的培養(yǎng)基負(fù)壓吸入1.5噸的種子罐中，培養(yǎng)2～3天；

e、發(fā)酵培養(yǎng)：保持溫度在25～26℃，將所述步驟d中培養(yǎng)后的培養(yǎng)基負(fù)壓吸入7噸的發(fā)酵罐中，并加入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵;

待達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，發(fā)酵結(jié)束：

a)、待靈芝菌絲上無(wú)明顯芽頭和鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象，且菌絲變細(xì)，菌絲原生質(zhì)凝集，菌絲有自溶現(xiàn)象發(fā)生時(shí)；

b)、菌絲濕重達(dá)到15～20％；

c)、發(fā)酵原液的pH值為3.0～3.5；

B、將7噸發(fā)酵罐中的靈芝發(fā)酵原液升溫至45~55℃，加入20000u/g的酸性纖維素酶，加入量為發(fā)酵罐實(shí)際裝量的0.0001~0.0004%，攪拌酶解3~4小時(shí)，得到靈芝酶解液；

C、將上述靈芝酶解液降至40~45℃，并加入質(zhì)量濃度為10%的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0~9.0，加入發(fā)酵罐實(shí)際裝量的0.006~0.012%的復(fù)合蛋白酶，攪拌酶解3~5小時(shí)，升溫至85~95℃，滅酶活10~30分鐘；

D、板框壓濾：將所述步驟C酶解靈芝混合液取出，用50～60kg的壓力壓濾，除去固體物，得到靈芝酶解原液；

E、采用孔徑1~8nm的膜過(guò)濾步驟D的靈芝酶解原液，收集透過(guò)液，向截留液中加水稀釋后再過(guò)濾，重復(fù)4~6次，合并收集的透過(guò)液，將所述的透過(guò)液進(jìn)行電滲析至液體電導(dǎo)率小于30μs/㎝^２、活性炭精制、脫炭，得到精制液。

F、將步驟E得到的精制液，蒸發(fā)濃縮至固含量為35~55%真空干澡或噴霧干燥得到靈芝肽粉。

按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成為：玉米粉1～3％、蔗糖2～4％、磷酸二氫鉀0.01～0.02％、硫酸銨0.2～0.3％、酵母粉0.2～0.4％、豆油0.05～0.1％、余量為水；

所述得復(fù)合蛋白酶的質(zhì)量組成為：

10萬(wàn)u/g的中性蛋白酶35%

20萬(wàn)u/g的堿性蛋白酶 35%

10萬(wàn)u/g胰蛋白酶 10%

10萬(wàn)u/g的木瓜蛋白酶15%

10萬(wàn)u/g的糖肽酶 5%

所述步驟E中，電滲析的操作條件為：電壓75V，進(jìn)所述透過(guò)液流速為1.2噸/小時(shí)，濃水流速為1.25噸/小時(shí)，電極冷卻水流速為1噸/小時(shí)。

所述菌種培養(yǎng)基的配方組成為：馬鈴薯200～250g、葡萄糖20～25g、磷酸二氫鉀3～4g、七水硫酸鎂1.5～2g、維生素B110～20mg、瓊脂18～20g、水1000ml。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明采用20000u/g的酸性纖維素酶對(duì)靈芝發(fā)酵混合液進(jìn)行酶解，將靈芝菌絲的細(xì)胞壁酶解破碎，有利于進(jìn)一步提取靈芝多肽。

2、本發(fā)明采用的復(fù)合蛋白酶可有效的將蛋白質(zhì)酶解成小分子肽，對(duì)靈芝酶解收率達(dá)90%以上，分子量小于2000Da的小分子肽含量占95%以上。

3、本發(fā)明采用膜分離獲得的透過(guò)液，采用電滲析法除去透過(guò)液中的殘留的無(wú)機(jī)離子，保留了小分子肽。

4、本發(fā)明在深層發(fā)酵靈芝后處理工藝簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)合理，加工靈活。酶解提取的靈芝肽分子量小，可以做為新一代低聚肽原料，實(shí)現(xiàn)了深層發(fā)酵靈芝高值化利用。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)例是本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例一、

一種從液體深層發(fā)酵靈芝中提取靈芝肽的方法，包括如下步聚：

1)、靈芝菌種培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度為25～26℃，

取靈芝菌種在菌種培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～30天，所述菌種培養(yǎng)基的配方組成為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀3g、七水硫酸鎂1.5g、維生素B110mg、瓊脂18g、水1000ml；

2)、搖床種：保持溫度在25～26℃，在30L攪拌罐中裝入所述步驟1)中培養(yǎng)有靈芝菌種的菌種培養(yǎng)基，用水稀釋，然后置于振蕩器上，攪拌3～4天，控制攪拌速度為100～120轉(zhuǎn)/min；

3)、一級(jí)放大：保持溫度在25～26℃，將所述步驟2)中稀釋攪拌后的培 養(yǎng)基負(fù)壓吸入一300L種子罐中，培養(yǎng)2～3天；

4)、二級(jí)放大：保持溫度在25～26℃，將所述步驟3)中攪拌后的培養(yǎng)基負(fù)壓吸入一1.5噸的種子罐中，培養(yǎng)2～3天；

5)、發(fā)酵培養(yǎng)：保持溫度在25～26℃，將所述步驟4)中培養(yǎng)后的培養(yǎng)基負(fù)壓吸入一7噸的發(fā)酵罐中，并加入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，

按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成為：玉米粉1％、蔗糖2％、磷酸二氫鉀0.01％、硫酸銨0.2％、酵母粉0.2％、豆油0.05％、余量為水；

待達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，發(fā)酵結(jié)束：

a)、待靈芝菌絲上無(wú)明顯芽頭和鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象，且菌絲變細(xì)，菌絲原生質(zhì)凝集，菌絲有自溶現(xiàn)象發(fā)生時(shí)；

b)、菌絲濕重達(dá)到15％；

c)、培養(yǎng)基的pH值為3.0～3.5；

2、將7噸發(fā)酵罐中的靈芝發(fā)酵原液升溫至55℃，加入10g的20000u/g的酸性纖維素酶，攪拌酶解4小時(shí)，得到靈芝酶解液；

3、將上述靈芝酶解液降至45℃，并加入質(zhì)量濃度為10%的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至7.6，加入發(fā)酵罐實(shí)際裝量的500g的復(fù)合蛋白酶（10萬(wàn)u/g的中性蛋白酶175g；20萬(wàn)u/g的堿性蛋白酶175g；10萬(wàn)u/g的胰蛋白酶50g；20萬(wàn)u/g的木瓜蛋白酶75g；10萬(wàn)u/g的糖肽酶25g），攪拌酶解3.5小時(shí)，升溫至90℃，滅酶30分鐘；

4、板框壓濾：將所述步驟3酶解靈芝混合液取出，用55kg的壓力壓濾，除去固體物，得到靈芝酶解原液；

5、采用孔徑4nm的膜過(guò)濾步驟4的靈芝酶解原液，收集透過(guò)液，向截留液中加純水稀釋后再過(guò)濾，重復(fù)3次，合并收集的透過(guò)液，將所述的透過(guò)液進(jìn)行電滲析至液體電導(dǎo)率小于30μs/㎝^２、（電滲析的操作條件為：電壓75V，進(jìn)所述透過(guò)液流速為1.2噸/小時(shí)，濃水流速為1.25噸/小時(shí)，電極冷卻水流速為1噸/小時(shí)）活性炭精制、脫炭，得到精制液。蒸發(fā)濃縮至固含量為55%真空干澡得13.5kg靈芝肽粉，測(cè)得多肽含量為85%，其中分子量小于2000Da的小分子肽占多肽含量的90.6%。

實(shí)施例二、

一種從液體深層發(fā)酵靈芝中提取靈芝肽的方法，包括如下步聚：

1)、靈芝菌種培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度為25～26℃，

取靈芝菌種在菌種培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～30天，所述菌種培養(yǎng)基的配方組成為：馬鈴薯250g、葡萄糖25g、磷酸二氫鉀4g、七水硫酸鎂2g、維生素B120mg、瓊脂20g、水1000ml；

步驟2)～步驟4)如同實(shí)施例1；

5)、發(fā)酵培養(yǎng)：保持溫度在25～26℃，將所述步驟4)中培養(yǎng)后的培養(yǎng)基負(fù)壓吸入一7噸的發(fā)酵罐中，并加入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，

按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成為：玉米粉3％、蔗糖4％、磷酸二氫鉀0.02％、硫酸銨0.3％、酵母粉0.4％、豆油0.1％、余量為水；

待達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，發(fā)酵結(jié)束：

a)、待靈芝菌絲上無(wú)明顯芽頭和鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象，且菌絲變細(xì)，菌絲原生質(zhì)凝集，茵絲有自溶現(xiàn)象發(fā)生時(shí)；

b)、菌絲濕重達(dá)到20％；

c)、培養(yǎng)基的pH值為3.0～3.5；

2、將7噸發(fā)酵罐中的靈芝發(fā)酵原液升溫至60℃，加入15g的20000u/g的酸性纖維素酶，攪拌酶解3.5小時(shí)，得到靈芝酶解液；

3、將上述靈芝酶解液降至45℃，并加入質(zhì)量濃度為10%的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入發(fā)酵罐實(shí)際裝量的600g的復(fù)合蛋白酶（10萬(wàn)u/g的中性蛋白酶210g；20萬(wàn)u/g的堿性蛋白酶210g；10萬(wàn)u/g的胰蛋白酶60g；20萬(wàn)u/g的木瓜蛋白酶90g；10萬(wàn)u/g的糖肽酶30g），攪拌酶解4小時(shí)，升溫至90℃，滅酶30分鐘；

4、板框壓濾：將所述步驟3酶解靈芝混合液取出，用60kg的壓力壓濾，除去固體物，得到靈芝酶解原液；

5、采用孔徑2nm的膜過(guò)濾步驟4的靈芝酶解原液，收集透過(guò)液，向截留液中加純水稀釋后再過(guò)濾，重復(fù)4次，合并收集的透過(guò)液，將所述的透過(guò)液進(jìn)行電滲析至液體電導(dǎo)率小于30μs/㎝^２、（電滲析的操作條件為：電壓75V，進(jìn)所述透過(guò)液流速為1.2噸/小時(shí)，濃水流速為1.25噸/小時(shí)，電極冷卻水流速為1噸/小時(shí)）活性炭精制、脫炭，得到精制液。蒸發(fā)濃縮至固含量為50%真空干澡得11.8kg靈芝肽粉，測(cè)得多肽含量為89.4%，其中分子量小于2000Da的小分子肽占多肽含量的91.3%。

實(shí)施例三、

一種從液體深層發(fā)酵靈芝中提取靈芝肽的方法，包括如下步聚：

1)、靈芝菌種培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度為25～26℃，

取靈芝菌種在菌種培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～30天，所述菌種培養(yǎng)基的配方組成為：馬鈴薯225g、葡萄糖22.5g、磷酸二氫鉀3.5g、七水硫酸鎂1.7g、維生素B115mg、瓊脂19g、水1000ml；

步驟2)～步驟4)如同實(shí)施例1；

5)、發(fā)酵培養(yǎng)：保持溫度在25～26℃，將所述步驟4)中培養(yǎng)后的培養(yǎng)基負(fù)壓吸入一7噸的發(fā)酵罐中，并加入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，

按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成為：玉米粉2％、蔗糖3％、磷酸二氫鉀0.015％、硫酸銨0.25％、酵母粉0.3％、豆油0.07％、余量為水；

待達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，發(fā)酵結(jié)束：

a)、待靈芝菌絲上無(wú)明顯芽頭和鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象，且茵絲變細(xì)，茵絲原生質(zhì)凝集，菌絲有自溶現(xiàn)象發(fā)生時(shí)；

b)、茵絲濕重達(dá)到17％；

c)、培養(yǎng)基的pH值為3.0～3.5；

2、將7噸發(fā)酵罐中的靈芝發(fā)酵原液升溫至50℃，加入12g的20000u/g的酸性纖維素酶，攪拌酶解3小時(shí)，得到靈芝酶解液；

3、將上述靈芝酶解液降至40℃，并加入質(zhì)量濃度為10%的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0，加入發(fā)酵罐實(shí)際裝量的550g的復(fù)合蛋白酶（10萬(wàn)u/g的中性蛋白酶192.5g；20萬(wàn)u/g的堿性蛋白酶192.5g；10萬(wàn)u/g的胰蛋白酶55g；20萬(wàn)u/g的木瓜蛋白酶82.5g；10萬(wàn)u/g的糖肽酶27.5g），攪拌酶解4小時(shí)，升溫至90℃，滅酶30分鐘；

4、板框壓濾：將所述步驟3酶解靈芝混合液取出，用60kg的壓力壓濾，除去固體物，得到靈芝酶解原液；

5、采用孔徑5nm的膜過(guò)濾步驟4的靈芝酶解原液，收集透過(guò)液，向截留液中加純水稀釋后再過(guò)濾，重復(fù)4次，合并收集的透過(guò)液，將所述的透過(guò)液進(jìn)行電滲析至液體電導(dǎo)率小于30μs/㎝^２、（電滲析的操作條件為：電壓75V，進(jìn)所述透過(guò)液流速為1.2噸/小時(shí)，濃水流速為1.25噸/小時(shí)，電極冷卻水流速為1噸/小時(shí)）活性炭精制、脫炭，得到精制液。蒸發(fā)濃縮至固含量為55%真空干澡得15.4kg靈芝肽粉，測(cè)得多肽含量為82.6%，其中分子量小于2000Da的小分子肽占多肽含量的89.8%。

本發(fā)明充分利用了液體深層發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)靈芝發(fā)酵原液經(jīng)處理后，通過(guò)多種復(fù)合酶解處理，經(jīng)膜過(guò)濾、干燥獲得高純度靈芝肽粉。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明而并非限制本發(fā)明所描述的技術(shù)方案；因此，盡管本說(shuō)明書(shū)參照上述的各個(gè)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明已進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，但是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，仍然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或等同替換；而一切不脫離本發(fā)明的精神和范圍的技術(shù)方案及其改進(jìn)，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。