本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及單克隆抗體的體外表達(dá)技術(shù)，具體涉及一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的定義，呼吸道合胞病毒感染是一種傳染性病毒疾病，為嬰兒及幼兒所患嚴(yán)重呼吸道疾病中最重要的一種病因。該病癥的主要表現(xiàn)為支氣管炎、肺部小氣道炎癥或病毒性肺炎。
在發(fā)達(dá)國(guó)家，呼吸道合胞病毒已成為導(dǎo)致嬰兒住院的首要病因，但至今尚未有能夠預(yù)防該病的疫苗。目前只有兩種藥物(帕利珠單抗和利巴韋林)可供患者選擇，而這兩種藥也存在著極大的缺陷。
呼吸道合胞病毒藥物未能滿(mǎn)足臨床需求，為全球各國(guó)的衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來(lái)了極大的負(fù)擔(dān)。許多兒童在出生后的第二年即感染呼吸道合胞病毒，在早產(chǎn)兒、幼齡兒童、老年人身上，感染的癥狀更加嚴(yán)重，這些癥狀包括噴嚏、咳嗽、發(fā)燒和喘鳴。嬰幼兒感染該病毒可能會(huì)引發(fā)肺炎以及嚴(yán)重的呼吸問(wèn)題，在少數(shù)病例中可能具有致命性。
WHO數(shù)據(jù)顯示，全球每年的呼吸道合胞病毒感染者約有6400萬(wàn)例，16萬(wàn)例死亡。呼吸道合胞病毒所面臨的種種挑戰(zhàn)主要緣自該領(lǐng)域的研究工作基礎(chǔ)薄弱。不過(guò)，隨著阿斯利康醫(yī)學(xué)免疫公司和美國(guó)生物制藥公司諾瓦瓦克斯的疫苗候選物的研發(fā)，該領(lǐng)域的前景似乎也并不昏暗。此外，盡管抗病毒藥物的研發(fā)正處于早期階段，但具有良好的潛力。
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬副黏病毒科肺炎屬，1956年Morris從一只有感冒癥狀的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物黑猩猩的鼻咽分泌物中分離出第一株RSV。1957年Chanock先后從Baltimore市2例分別患肺炎和有喘息癥狀患兒的咽拭子中分離到。因其在組織培養(yǎng)中能形成特殊的細(xì)胞融合病變而得名。呼吸道合胞病毒是嬰幼兒呼吸道感染最常見(jiàn)的病原體，特別是2～6個(gè)月小嬰兒RSV感染后常發(fā)生嚴(yán)重毛細(xì)支氣管炎和肺炎。通常在冬、春季節(jié)流行。在世界不同地區(qū)每年因RSV感染而需住院治療的患兒為1‰～5‰，住院病人病死率為1‰～3‰。有這種感染的嬰兒或兒童，可能有一個(gè)或多個(gè)下列癥狀：1，咳嗽；2，流鼻涕；3，發(fā)燒；4，喘息。長(zhǎng)期以來(lái)，抗感染一直是治療呼吸道合胞病毒疾病的不二選擇，但如今疫苗的開(kāi)發(fā)也在加速。相關(guān)疫苗可快速提供給嬰兒，并解決呼吸道合胞病毒疾病導(dǎo)致的醫(yī)療衛(wèi)生負(fù)擔(dān)問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體體外表達(dá)方法的技術(shù)問(wèn)題。
本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是在獲得了整合有呼吸道合胞病毒單克隆抗體表達(dá)基因的重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，質(zhì)粒在表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率較低。
為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，包括以下步驟：
1)從呼吸道合胞病毒感染后又康復(fù)者的血清中提取記憶性B細(xì)胞，活化培養(yǎng)后通過(guò)酶聯(lián)免疫方法篩選RSV抗體陽(yáng)性細(xì)胞；
2)提取RSV抗體陽(yáng)性細(xì)胞的RNA，分別用一步法RT-PCR方法擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因Vκ或Vλ；
3)將VH基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgH連接得到重鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒，將Vκ基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgκ連接或?qū)λ基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgλ連接得到輕鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒；
4)擴(kuò)增步驟3)所得的重組質(zhì)粒，而后篩選表達(dá)抗體重鏈和輕鏈的陽(yáng)性質(zhì)粒；
5)制備減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株的感受態(tài)細(xì)胞，取步驟4)所得的陽(yáng)性質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入其中，篩選陽(yáng)性克隆，得到重組細(xì)菌；
6)取HEK293-T細(xì)胞與步驟5)所得的重組細(xì)菌，以二者的細(xì)胞量為1:20～1:200的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合，培養(yǎng)4～16h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h。
作為優(yōu)選，步驟1)中記憶性B細(xì)胞是通過(guò)以下方法提取的：將20ml新鮮EDTA抗凝全血樣本按照5ml/管加入淋巴細(xì)胞分離管中，2200r/min離心15min，吸取白色淋巴細(xì)胞層，即為人外周血單個(gè)核細(xì)胞，而后用人記憶性B細(xì)胞磁珠分選試劑盒從中分選出記憶性B細(xì)胞。
作為優(yōu)選，步驟1)所述活化培養(yǎng)包括以下步驟：將記憶性B細(xì)胞以200細(xì)胞/孔的密度接種96孔U型底培養(yǎng)板，培養(yǎng)液含2.5μg/ml的CpG2006、10ng/ml的IL-2和10ng/ml的IL-10，以25％的B958細(xì)胞培養(yǎng)上清和5000cGy照射滅活的同種異源的外周血單個(gè)核細(xì)胞50000/孔為飼養(yǎng)細(xì)胞，于37℃、5％CO2條件培養(yǎng)兩周。
作為優(yōu)選，步驟4)中對(duì)重組質(zhì)粒的擴(kuò)增是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)12-16h，而后取菌落置于5ml含氨芐抗生素100μg/ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，180r/min左右振搖培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌液小提質(zhì)粒。
作為優(yōu)選，步驟6)中HEK293-T細(xì)胞的加入量為8000～12000個(gè)/孔。
作為優(yōu)選，步驟6)所述混合后，細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中液體總量為450～550μL。
作為優(yōu)選，步驟6)所述針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。
作為優(yōu)選，步驟5)所述的電轉(zhuǎn)法包括以下步驟：取陽(yáng)性質(zhì)粒與步驟1)所述感受態(tài)細(xì)胞在電轉(zhuǎn)杯中混合，而后以電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms。
作為優(yōu)選，步驟5)中減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株的感受態(tài)細(xì)胞是通過(guò)以下方法制備的：
A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；
B)挑取單菌落接種于3～7ml LB液體培養(yǎng)基中，35～39℃振蕩培養(yǎng)10～14h；
C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:80～1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值不小于0.4；
D)冰浴15～25min后，離心取沉淀用1/8～1/12體積預(yù)冷的無(wú)菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。
作為優(yōu)選，步驟6)完成后繼續(xù)執(zhí)行以下步驟7)：取步驟6)所得的培養(yǎng)液上清1500r/min離心4min棄沉淀，而后用0.45μm濾器過(guò)濾，收集濾液并以1～2滴/秒的速度流過(guò)蛋白A純化柱，使IgG結(jié)合至蛋白A上；用PBS以5000g離心1min洗滌純化柱2～3次，棄液，加入400ul IgG洗脫液輕輕混合，將柱子放進(jìn)已加入40μl PH7.5～9的Tris-鹽酸中和液的1.5ml離心管中，5000g離心1min，所得液體即為純化的單克隆抗體。
本發(fā)明提供了一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，該技術(shù)方案是從近期感染呼吸道合胞病毒但又康復(fù)者的外周血分離記憶性B細(xì)胞，進(jìn)一步確定表達(dá)抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，利用鼠傷寒感受態(tài)細(xì)胞VNP20009直接轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并使其在體外大量表達(dá)呼吸道合胞病毒抗體，經(jīng)鑒定后評(píng)價(jià)其對(duì)呼吸道合胞病毒的中和能力和殺傷能力，從而篩選出高效的可以產(chǎn)業(yè)化的呼吸道合胞病毒單克隆抗體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：直接以鼠傷寒感受態(tài)細(xì)胞VNP2009轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，與傳統(tǒng)方法相比較不僅節(jié)省了很多的時(shí)間而且還可以避免使用大量的轉(zhuǎn)染試劑就可以使單克隆抗體在體外表達(dá)。由于把外源性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)表達(dá)細(xì)胞是單克隆抗體體外表達(dá)的關(guān)鍵步驟，本發(fā)明可以用于呼吸道合胞病毒單克隆抗體的體外表達(dá)。
具體實(shí)施方式
以下將對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過(guò)多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。
以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1
A、鼠傷寒VNP20009細(xì)菌的活化：從-80℃冰箱取出于1.5mlEP管凍存的傷寒VNP20009細(xì)菌，融化后吸取100μl接種于盛有5mlLB培養(yǎng)液的滅菌離心管中，在恒溫培養(yǎng)箱匯中220r/min,37℃培養(yǎng)12～14h；
B、鼠傷寒VNP20009細(xì)菌感受態(tài)的制備：
1、將-80℃保存的LB5000和SL3261甘油菌劃線接種于無(wú)抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)18h；
2、挑取單個(gè)菌落于2ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)12h；
3、按1：100比例接種于50ml LB中振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌OD600約為0.4左右；
4、倒入50ml無(wú)菌離心管中冰浴20min，4℃，3000rpm,離心10min；
5、棄上清，加入預(yù)冷的無(wú)菌去離子水充分重懸菌體，4℃，3000rpm，離心10min，棄上清；重復(fù)該步驟2次，以充分洗滌菌體；
6、用冰浴的10％甘油充分懸浮菌體，4℃，3000rpm，離心10min，棄上清；
7、將細(xì)菌重懸于2ml預(yù)冷的10％的甘油中，分裝于預(yù)冷的滅菌EP管(150μL/管)，現(xiàn)用或-80℃?zhèn)溆茫?/p>
C、血樣PBMC的分離和記憶性B細(xì)胞的分選：將20ml新鮮EDTA抗凝全血樣本按照5ml/管加入淋巴細(xì)胞分離管中，2200r/min離心15min，吸取白色淋巴細(xì)胞層，即為人外周血單個(gè)核細(xì)胞。然后用人記憶性B細(xì)胞磁珠分選試劑盒分選出記憶性B細(xì)胞；
D、記憶性B細(xì)胞的活化培養(yǎng)：將分選所得的記憶性B細(xì)胞按照200細(xì)胞/孔的密度接種96孔U型底培養(yǎng)板，培養(yǎng)液中含2.5μg/ml的CpG2006、10ng/ml的IL-2和10ng/ml的IL-10,25％的B958細(xì)胞培養(yǎng)上清和5000cGy照射滅活的同種異源的外周血單個(gè)核細(xì)胞50000/孔作為飼養(yǎng)細(xì)胞，在37℃,5％CO2條件下培養(yǎng)兩周，讓記憶性B細(xì)胞活化成為抗體分泌細(xì)胞，收集上清用于下一步檢測(cè)
E、RSV陽(yáng)性孔的篩選和抗體輕鏈類(lèi)型的確定:
1、RSV陽(yáng)性孔的篩選：
使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測(cè)B細(xì)胞上清特異性；
2、抗體輕鏈類(lèi)型的確定：
(1)用100ng/孔的D7324和100ng/孔gp41包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。洗板機(jī)洗板5遍；
(2)加入5％脫脂奶200μl/孔，37℃封閉2h，洗板5遍；
(3)加入適當(dāng)稀釋的含gp120和FLSC的細(xì)胞上清，50μl/孔，37℃放置1h。洗板5遍；
(4)加入適當(dāng)稀釋的待測(cè)抗體，37℃放置1h，洗板5遍；
(5)其中2孔加入HRP標(biāo)記的κ抗體、另外2孔加入HRP標(biāo)記的λ抗體，50μl/孔，37℃放置45min，洗板5遍；
(6)加入TMB顯色液100μl/孔，室溫避光顯色30min；
(7)加入2mol/L硫酸50μl/孔終止顯色反應(yīng)，檢測(cè)OD450nm，參考波長(zhǎng)為630nm。
F、抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增、篩選和分析：
1、陽(yáng)性孔B細(xì)胞RNA的提?。河肣IAGEN RNeasy Mini Kit試劑盒提取陽(yáng)性B細(xì)胞的RNA；
2、抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增：
(1)用一步法RT-PCR方法擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)VH和輕鏈基因可變區(qū)Vκ或Vλ；
(2)PCR產(chǎn)物取3μl用1.2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，目的基因條帶在300bp-500bp位置，切膠回收目的條帶，具體操作參照試劑盒QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit(250)(QIAGEN Cat.NO.28606)說(shuō)明書(shū)；
G、陽(yáng)性孔細(xì)胞抗體基因重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)迷你文庫(kù)的構(gòu)建：
1、酶切回收之后的可變區(qū)基因片段；
2、用切膠回收試劑盒回收這些酶切之后的目的基因片段，具體操作見(jiàn)試劑盒QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit(250)(QIAGEN Cat.NO.28606)說(shuō)明書(shū)；
3、同時(shí)酶切恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgH(p19EH-AS6for VH)、pIgκ(p14B7K-SN1for Vκ)或pIgλ(pA32L-SN5for Vλ)，首先使用BioTek全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀和Take3session軟件測(cè)定質(zhì)粒濃度：先用溶質(zhì)或純水調(diào)零，然后取2μl樣品滴到孔上，直接讀出濃度；然后換算成1.0μg所需要的體積，在50μl酶切體系中加入載體質(zhì)粒1.0μg；
4、酶切之后回收載體基因片段，具體操作見(jiàn)試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit(250)(QIAGEN Cat.NO.28706)說(shuō)明書(shū)；
5、將酶切之后的目的基因片段與相應(yīng)酶切之后的恒定區(qū)載體pIgH(p19EH-AS6for VH)、pIgκ(p14B7K-SN1for Vκ)或pIgλ(pA32L-SN5for Vλ)連接；
6、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，放置于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)12-16h。觀察菌落生長(zhǎng)狀況；
7、將培養(yǎng)碟中的全部菌落用棉簽輕刮下來(lái)，置于5ml含氨芐抗生素100ug/ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，180r/min左右振搖培養(yǎng)過(guò)夜。收集菌液3ml，小提質(zhì)粒，具體操作見(jiàn)試劑盒QIAGEN Plasmid Mini Kit(250)(QIAGEN Cat.NO.27106)說(shuō)明書(shū)。用BioTek全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀和Take3session軟件測(cè)定質(zhì)粒濃度；
H、抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因的篩選：
1、將mVH和mVL共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，ELISA鑒定抗體特異性。對(duì)不同的單抗與RSV抗原結(jié)合活性的檢測(cè)使用不同的ELISA方法，檢測(cè)針對(duì)gp120和FLSC的抗體使用捕獲ELISA方法；檢測(cè)針對(duì)gp140或gp41的抗體使用間接ELISA方法；
2、若轉(zhuǎn)染上清中的RSV特異性抗體為陽(yáng)性，則轉(zhuǎn)化攜帶mVH基因的質(zhì)粒提取攜帶單個(gè)重鏈基因的質(zhì)粒；
3、再用重鏈單個(gè)基因VHn和輕鏈基因的文庫(kù)mVL共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞篩選單個(gè)的陽(yáng)性抗體重鏈基因。同樣轉(zhuǎn)化攜帶mVL基因的質(zhì)粒，挑取單克隆12個(gè)，用96孔板提取質(zhì)粒試劑盒提取攜帶單個(gè)輕鏈基因的質(zhì)粒，并用輕鏈單個(gè)基因VLn和重鏈基因的文庫(kù)mVH共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞篩選單個(gè)的陽(yáng)性抗體輕鏈基因。若所挑取的單克隆數(shù)最后轉(zhuǎn)染均為陰性，則重新挑取12個(gè)單克隆，重復(fù)轉(zhuǎn)染和ELISA檢測(cè)步驟。最后將陽(yáng)性VHn和VLn共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲上清，ELISA檢測(cè)抗體特性；
I、抗體的大量表達(dá)和純化以及活性鑒定：
1、單克隆抗體的大量表達(dá)：
將表達(dá)陽(yáng)性抗體重鏈和輕鏈基因的質(zhì)粒在鼠傷寒感受態(tài)VNP2009中大量擴(kuò)增，培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞12～14h；挑取一個(gè)單克隆于5ml含氨芐抗生素100μg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，180r/min左右振搖培養(yǎng)10～12h，再按照1:100接種于200ml含氨芐抗生素100μg/ml的LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，200r/min左右振搖培養(yǎng)10～14h，提取質(zhì)粒，具體操作參照質(zhì)粒大提試劑盒HiSpeed Plasmid Purification Kit(QIAGEN Cat.NO.12663)說(shuō)明書(shū)；用BioTek全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定質(zhì)粒濃度
2、單克隆抗體的制備和純化：
(1)消化293T細(xì)胞，將9μg的重鏈基因和9μg輕鏈基因質(zhì)?；旌?，加入到500μl無(wú)抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)基中，室溫放置5min，加入轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD 72μl，室溫放置20min。然后將混合液加入到提前一天鋪好細(xì)胞的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃,5％CO2條件下培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后48～72h在轉(zhuǎn)染細(xì)胞瓶中補(bǔ)加含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液至50ml，繼續(xù)培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)染后1周收集細(xì)胞上清；
(2)將上一步中收集的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清1500r/min離心4min去沉淀，然后用0.45μm濾器過(guò)濾，收集濾液并以1～2滴/秒的速度流過(guò)蛋白A純化柱，使IgG結(jié)合至蛋白A上。用PBS以5000g離心1min洗滌純化柱2～3次，棄液，加入400ul IgG洗脫液輕輕混合，將柱子放進(jìn)已加入40μl PH7.5～9的Tris-鹽酸中和液的1.5ml離心管中，5000g離心1min，所得液體即為純化的單克隆抗體，可反復(fù)洗滌2～3次，分別收集洗脫液。
實(shí)施例2
一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，包括以下步驟：
1)從呼吸道合胞病毒感染后又康復(fù)者的血清中提取記憶性B細(xì)胞，活化培養(yǎng)后通過(guò)酶聯(lián)免疫方法篩選RSV抗體陽(yáng)性細(xì)胞；
2)提取RSV抗體陽(yáng)性細(xì)胞的RNA，分別用一步法RT-PCR方法擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因Vκ或Vλ；
3)將VH基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgH連接得到重鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒，將Vκ基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgκ連接或?qū)λ基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgλ連接得到輕鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒；
4)擴(kuò)增步驟3)所得的重組質(zhì)粒，而后篩選表達(dá)抗體重鏈和輕鏈的陽(yáng)性質(zhì)粒；
5)制備減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株的感受態(tài)細(xì)胞，取步驟4)所得的陽(yáng)性質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入其中，篩選陽(yáng)性克隆，得到重組細(xì)菌；
6)取HEK293-T細(xì)胞與步驟5)所得的重組細(xì)菌，以二者的細(xì)胞量為1:20的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合，培養(yǎng)4h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40h。
在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿(mǎn)足以下條件：
步驟1)中記憶性B細(xì)胞是通過(guò)以下方法提取的：將20ml新鮮EDTA抗凝全血樣本按照5ml/管加入淋巴細(xì)胞分離管中，2200r/min離心15min，吸取白色淋巴細(xì)胞層，即為人外周血單個(gè)核細(xì)胞，而后用人記憶性B細(xì)胞磁珠分選試劑盒從中分選出記憶性B細(xì)胞。
步驟1)所述活化培養(yǎng)包括以下步驟：將記憶性B細(xì)胞以200細(xì)胞/孔的密度接種96孔U型底培養(yǎng)板，培養(yǎng)液含2.5μg/ml的CpG2006、10ng/ml的IL-2和10ng/ml的IL-10，以25％的B958細(xì)胞培養(yǎng)上清和5000cGy照射滅活的同種異源的外周血單個(gè)核細(xì)胞50000/孔為飼養(yǎng)細(xì)胞，于37℃、5％CO2條件培養(yǎng)兩周。
步驟4)中對(duì)重組質(zhì)粒的擴(kuò)增是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)12h，而后取菌落置于5ml含氨芐抗生素100μg/ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，180r/min左右振搖培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌液小提質(zhì)粒。
步驟6)中HEK293-T細(xì)胞的加入量為8000個(gè)/孔。
步驟6)所述混合后，細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中液體總量為450μL。
步驟6)所述針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。
步驟5)所述的電轉(zhuǎn)法包括以下步驟：取陽(yáng)性質(zhì)粒與步驟1)所述感受態(tài)細(xì)胞在電轉(zhuǎn)杯中混合，而后以電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms。
步驟5)中減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株的感受態(tài)細(xì)胞是通過(guò)以下方法制備的：
A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；
B)挑取單菌落接種于7ml LB液體培養(yǎng)基中，39℃振蕩培養(yǎng)14h；
C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為0.4；
D)冰浴15min后，離心取沉淀用1/8體積預(yù)冷的無(wú)菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80體積預(yù)冷的、8％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80體積預(yù)冷的、8％(mL/mL)的甘油中。
步驟6)完成后繼續(xù)執(zhí)行以下步驟7)：取步驟6)所得的培養(yǎng)液上清1500r/min離心4min棄沉淀，而后用0.45μm濾器過(guò)濾，收集濾液并以1～2滴/秒的速度流過(guò)蛋白A純化柱，使IgG結(jié)合至蛋白A上；用PBS以5000g離心1min洗滌純化柱2次，棄液，加入400ul IgG洗脫液輕輕混合，將柱子放進(jìn)已加入40μl PH7.5 的Tris-鹽酸中和液的1.5ml離心管中，5000g離心1min，所得液體即為純化的單克隆抗體。
實(shí)施例3
一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，包括以下步驟：
1)從呼吸道合胞病毒感染后又康復(fù)者的血清中提取記憶性B細(xì)胞，活化培養(yǎng)后通過(guò)酶聯(lián)免疫方法篩選RSV抗體陽(yáng)性細(xì)胞；
2)提取RSV抗體陽(yáng)性細(xì)胞的RNA，分別用一步法RT-PCR方法擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因Vκ或Vλ；
3)將VH基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgH連接得到重鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒，將Vκ基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgκ連接或?qū)λ基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgλ連接得到輕鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒；
4)擴(kuò)增步驟3)所得的重組質(zhì)粒，而后篩選表達(dá)抗體重鏈和輕鏈的陽(yáng)性質(zhì)粒；
5)制備減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株的感受態(tài)細(xì)胞，取步驟4)所得的陽(yáng)性質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入其中，篩選陽(yáng)性克隆，得到重組細(xì)菌；
6)取HEK293-T細(xì)胞與步驟5)所得的重組細(xì)菌，以二者的細(xì)胞量為1:200的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合，培養(yǎng)16h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)56h。
在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿(mǎn)足以下條件：
步驟4)中對(duì)重組質(zhì)粒的擴(kuò)增是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)16h，而后取菌落置于5ml含氨芐抗生素100μg/ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，180r/min左右振搖培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌液小提質(zhì)粒。
步驟6)中HEK293-T細(xì)胞的加入量為12000個(gè)/孔。
步驟6)所述混合后，細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中液體總量為550μL。
步驟5)中減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株的感受態(tài)細(xì)胞是通過(guò)以下方法制備的：
A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；
B)挑取單菌落接種于7ml LB液體培養(yǎng)基中，39℃振蕩培養(yǎng)14h；
C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為0.6；
D)冰浴25min后，離心取沉淀用1/12體積預(yù)冷的無(wú)菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/120體積預(yù)冷的、12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/120體積預(yù)冷的、12％(mL/mL)的甘油中。
步驟6)完成后繼續(xù)執(zhí)行以下步驟7)：取步驟6)所得的培養(yǎng)液上清1500r/min離心4min棄沉淀，而后用0.45μm濾器過(guò)濾，收集濾液并以1～2滴/秒的速度流過(guò)蛋白A純化柱，使IgG結(jié)合至蛋白A上；用PBS以5000g離心1min洗滌純化柱3次，棄液，加入400ul IgG洗脫液輕輕混合，將柱子放進(jìn)已加入40μl PH9的Tris-鹽酸中和液的1.5ml離心管中，5000g離心1min，所得液體即為純化的單克隆抗體。
實(shí)施例4
一種呼吸道合胞病毒單克隆抗體制備方法，包括以下步驟：
1)從呼吸道合胞病毒感染后又康復(fù)者的血清中提取記憶性B細(xì)胞，活化培養(yǎng)后通過(guò)酶聯(lián)免疫方法篩選RSV抗體陽(yáng)性細(xì)胞；
2)提取RSV抗體陽(yáng)性細(xì)胞的RNA，分別用一步法RT-PCR方法擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因Vκ或Vλ；
3)將VH基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgH連接得到重鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒，將Vκ基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgκ連接或?qū)λ基因通過(guò)酶切法與恒定區(qū)載體質(zhì)粒pIgλ連接得到輕鏈可變區(qū)基因重組質(zhì)粒；
4)擴(kuò)增步驟3)所得的重組質(zhì)粒，而后篩選表達(dá)抗體重鏈和輕鏈的陽(yáng)性質(zhì)粒；
5)制備減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株的感受態(tài)細(xì)胞，取步驟4)所得的陽(yáng)性質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入其中，篩選陽(yáng)性克隆，得到重組細(xì)菌；
6)取HEK293-T細(xì)胞與步驟5)所得的重組細(xì)菌，以二者的細(xì)胞量為1:100的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合，培養(yǎng)10h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。
以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。