本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及建立一種腦內(nèi)條件性過表達水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)蛋白生物模型的方法。

背景技術(shù)：

模型小鼠是研究疾病發(fā)病機制、治療策略必不可少的工具，目前建立模型小鼠的主要方法是轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組參與跨膜水轉(zhuǎn)運的四聚體結(jié)構(gòu)膜通道蛋白家族，目前已經(jīng)從哺乳動物組織中分離得到了13種AQPs(AQP0--AQPl2)。根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運功能的不同，將其分成3類：水特異性通道蛋白、水甘油通道蛋白以及超水通道蛋白。

AQP4屬于水特異性通道蛋白。aqp4基因定位于18q11.2和q12.I之間，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，外顯子分別編碼127，55，27，92位氨基酸序列。AQP4蛋白由4個相對分子質(zhì)量約30 000的單體組成，每個單體具有各自獨立的水通透性，其單體結(jié)構(gòu)包括6個跨膜區(qū)域和5個環(huán)(A、B、C、D、E環(huán))。其中B、D環(huán)及羧基、氨基末端均在胞內(nèi)，A、C、E環(huán)位于胞外。整個分子呈對稱鏡像結(jié)構(gòu)，且B、E環(huán)顯著疏水，參與調(diào)解水通道活性。在B、E環(huán)上各自擁有一個由天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸組成的序列，該序列為AQPs家族成員共有的特征性結(jié)構(gòu)。

AQP4是分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要水通道蛋白，特異性分布于星形膠質(zhì)細胞足突和室管膜，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運，是腦脊液的生成吸收、滲透壓的調(diào)節(jié)、腦水腫的形成及清除等病理生理過程的分子基礎(chǔ)。近來研究表明，AQP4調(diào)控星形膠質(zhì)細胞的系列生理功能，如介導(dǎo)水快速轉(zhuǎn)運、維持細胞外液離子平衡、影響神元活動和突觸重塑、參與成年的神經(jīng)發(fā)生等。此外AQP4還可能參與了腦中風、視神經(jīng)脊髓炎、阿爾茨海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理進程。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題：本發(fā)明的目的在于提供一種條件性過表達AQP4轉(zhuǎn)基因小鼠的模型制作方法，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立AQP4條件性過表達小鼠模型，以獲得一種可穩(wěn)定遺傳、對其中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)AQP4蛋白表達時間可控的小鼠模型。該模型將可用于研究該蛋白在體功能分析、疾病發(fā)病機制探討、藥物新靶點發(fā)現(xiàn)及臨床前藥效評價等研究，具有十分重要的科學意義和臨床價值。

技術(shù)方案：本發(fā)明的一種條件性過表達AQP4轉(zhuǎn)基因小鼠的模型制作方法，包括以下步驟：

第1步：hGFAP-mAQP4(hGFAP代表人源性的膠質(zhì)纖維酸性蛋白基因啟動子，mAQP4代表鼠源性的水通道蛋白4基因)轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建；

第2步：轉(zhuǎn)基因載體原核顯微注射；

第3步：品系基因鑒定，最終建立小鼠基因組中帶有外源AQP4基因的遺傳性小鼠突變模型。

第1步中所述的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法是:合成5'UTR-Aqp4CDS-3'untranslated and polyA sequence(5’非編碼區(qū)-Aqp4基因編碼區(qū)-3’非編碼區(qū)以及多聚腺嘌呤核糖核苷酸結(jié)尾序列)，連接到pTRE3G(四環(huán)素依賴誘導(dǎo)表達載體)，然后將以上序列片段酶切下來連接到pInsulator(絕緣子載體)，合成人源GFAP(膠質(zhì)纖維酸性蛋白)啟動子序列，與CMV(增強子)融合后連接到rtTA3G-polyA(四環(huán)素依賴誘導(dǎo)表達載體-多聚腺嘌呤核糖核苷酸結(jié)尾序列表達載體)上，再將片段酶切下來，連接到上一步構(gòu)建好的載體中，完成整個載體的構(gòu)建。

第2步所述的轉(zhuǎn)基因載體原核顯微注射是：將外源線性轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6(品系名稱)小鼠受精卵細胞核內(nèi)；外源性基因會隨機插入到小鼠基因組中，最終構(gòu)建的hGFAP-mAQP4轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在攝入強力霉素后過表達AQP4(水通道蛋白4)蛋白，便于進行后續(xù)的蛋白印跡實驗。

第3步所述的基因鑒定是：出生的首代hGFAP-mAQP4轉(zhuǎn)基因陽性的小鼠即為首建鼠；每只首建鼠都將被視為一個獨立的品系進行繁育，對每只首建鼠品系都進行剪尾基因鑒定。

有益效果：本發(fā)明提供可條件性誘導(dǎo)過表達AQP4蛋白的模型小鼠，實現(xiàn)了通過人為時間點調(diào)控，對不同月齡小鼠進行條件誘導(dǎo)增加其腦內(nèi)AQP4蛋白表達水平，觀察其小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)以及神經(jīng)精神疾病模型狀態(tài)下星形膠質(zhì)細胞生物學特性和功能產(chǎn)生何種影響。該模型的建立，有助于研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制、藥物新靶點發(fā)現(xiàn)及臨床前藥效評價等。

附圖說明

圖1.轉(zhuǎn)基因小鼠制作流程。

圖2.hGFAP-mAqp4轉(zhuǎn)基因小鼠載體構(gòu)建策略。其中pTRE3G是啟動子，Aqp4是待表達的序列，后跟3'UTR和polyA序列，CMV為增強子，gfap promoter為人膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子，rtTA3G是表達四環(huán)素作用位點序列，polyA為終止信號。前后兩個蛋白是獨立表達，但是方向相反。

圖3.載體構(gòu)建終載體圖譜。

圖4.hGFAP-mAqp4轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定結(jié)果：PCR電泳圖。

具體實施方式

本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因小鼠模型的具體構(gòu)建過程如下：

1.獲得目的基因：將pTRE3G(啟動子),mouse Aqp4CDS,3’-untranslated and poly-A Sequences,polyA,rtTA3G(啟動子),Kozak,Human Gfap promoter,CMV Enhancer片段通過SLIC反應(yīng)連接到pMD18-T上，再通過限制性內(nèi)切酶的作用將目的片段連接到pInsulator vector上，純化線性DNA片段。

2.制備顯微注射用的DNA溶液。

3.應(yīng)用顯微注射的方法將線性化的目的基因片段注入到小鼠受精卵的原核中，使其與小鼠基因組整合，隨著細胞不斷分裂，每個細胞將攜帶該片段。

4.將經(jīng)顯微注射后成活的受精卵植入假孕鼠的輸卵管的壺腹部，產(chǎn)生F0代轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠基因組中整合有外源性表達序列。

5.品系基因鑒定，最終建立小鼠基因組中帶有外源基因的小鼠模型，出生的首代hGFAP-mAQP4轉(zhuǎn)基因陽性的小鼠即為Founder小鼠；每個Founder都將被視為一個獨立的品系進行繁育，對每個founder品系都進行剪尾的PCR鑒定。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。

第1步：hGFAP-mAQP4轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建

一、高效克隆in-Fusion HD Cloning Kits簡介

和傳統(tǒng)的幾種克隆方式相比較，比如：TA克隆；限制性酶切克?。黄交┒丝寺　鹘y(tǒng)克隆，有如下缺點：連接效率低；耗時較長；需要特定限制性酶切位點。

in-Fusion HD Cloning Kits是一款簡便高效的克隆試劑盒，能夠?qū)蝹€或者多個DNA片段快速定向克隆到任意載體中。In-Fusion克隆技術(shù)的基礎(chǔ)是Clontech的In-Fusion專利酶，此酶通過識別DNA片段和線性化載體末端15bp同源序列將DNA片段和線性化載體高效精確地融合在一起。15bp同源序列是通過擴增目的片段所設(shè)計的引物來獲得的。升級后的In-Fusion HD Kits的克隆效率高于之前的In-Fusion Kits，尤其表現(xiàn)在長片段、短核苷酸片段和多重片段克隆上?？寺∪我馄蔚侥x擇的任意載體中的任意位置；可有效克隆的片段大小范圍非常寬泛；通過單次反應(yīng)將多重DNA片段克隆到任意載體中；無需進行限制性酶切處理、磷酸化處理或者連接反應(yīng)；最終的重組載體不附加任何冗余或者不需要的堿基序列。

二、hGFAP-mAQP4轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建

1.引物設(shè)計

使用infusion網(wǎng)站

(http://bioinfo.clontech.com/infusion/convertPcrPrimersInit.do)設(shè)計對應(yīng)的引物。所有的PCR擴增反應(yīng)都是用Q5(M0492S,NEB,USA)高保真酶擴增，確保沒有堿基突變。每一個PCR片段都測序，以保證沒有堿基突變。

2.克隆小鼠AQP4基因

在http://www.informatics.jax.org/查詢小鼠AQP4基因MGI(107387)，NCBI(NM_009700.3)。AQP4只有一個轉(zhuǎn)錄本MGI(ENSMUST00000079081.6)；NIBI(NP_033830.2)，該轉(zhuǎn)錄本有5個exon,4個intron,有323aa，片段大小是5082bp。以小鼠(C57/Bl6)基因組cDNA為模板，設(shè)計引物擴增，PCR法擴增AQP4片段。同時以小鼠基因組文庫為模板，PCR法擴增AQP4片段的5’UTR和3’UTR。PCR法擴增AQP4片段的3’UTR，并在長鏈引物后面添加polyA序列。

使用infusion試劑盒將上述三段5’UTR區(qū)域，小鼠(C57/Bl6)基因組cDNA，3’UTR-polyA區(qū)域先連接在pTRE載體上。并測序驗證，確保序列不存在堿基突變。此處使用到的infusion引物：

5’UTR-AQP4-F:acttcctaccctcgtaaagtcgacggaaggcatgagtga

AQP4-R:agtgctgtcctctagtcatacggaagacaatacctctcccg

AQP4-3’UTR-F:ctagaggacagcactgaaggcagaagagactccctagac

AQP4-3’UTR-R:gactagagcttgcggaacccttattaggttctgacagt

3.克隆pTRE3G的DNA序列

以pTRE3G常規(guī)質(zhì)粒為模板，PCR法擴增pTRE3G片段。

此處使用到的infusion引物：

pTRE3G-F:tctagcgagatcgatgcggccgcgagttt

pTRE3G-R:tcactcatgccttccgtcgactttacgagggtaggaa

4.克隆rtTA3G的DNA序列；human Gfap promoter的DNA序列；CMV Enhancer分別以rtTA3G，human Gfap promoter，CMV Enhancer常規(guī)質(zhì)粒骨架為模板，PCR法克隆每個片段，將三個片段連接在一起。

此處使用到的infusion引物：

CMV-Kozak-human Gfap promoter-F:ggtggcggccctgctctggctctgctcgctcctgggatg

human Gfap promoter-R:ctcccacctccctctctgtgctgggactcacagag

rtTA3G-F:tcagcgagctctagttacccggggagcat

rtTA3G-R:agcagggccgccaccatgtctagactggacaagagcaaagtc

5.連接pIns-mAqp4-rtTA3G-hGFAP-CMVe TG final

將(第3步驟)pTRE3G，(第2步驟)AQP4基因，(第4步驟)rtTA3G的DNA序列；human Gfap promoter的DNA序列；CMV Enhancer序列組合連接在一起，構(gòu)建在pTRE載體上。

第2步：轉(zhuǎn)基因載體原核顯微注射

將外源線性hGFAP-mAQP4轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL6/j小鼠受精卵細胞核內(nèi)；外源的hGFAP-mAQP4基因會隨機插入到小鼠基因組中，最終構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)星型膠質(zhì)細胞上過表達AQP4蛋白，便于進行后續(xù)的蛋白印跡分析實驗。

第3步：品系基因鑒定

1.剪尾并抽取121只小鼠基因組DNA：幼仔出生16天左右進行編號剪腳趾；將所剪小鼠尾尖樣本加EB(裂解液)55μl(裂解液100:1加入蛋白酶K)，55℃裂解過夜；第二日將樣本取出，12000r/min，離心1min；將樣本取出，加入700μl酚/氯仿(1:1配制)，混勻；12000r/min，離心5min.取上清至1.5mlEP管，加2倍體積無水乙醇。輕輕混勻，會有絮狀沉淀出現(xiàn)；12000r/min，離心5min.棄上清；加700μl 70％冰乙醇，混勻，12000r/min，離心5min；棄上清，12000r/min，離心1min；超凈臺晾干，加入80μl EB緩沖液/ddH₂O，60℃溶解0.5h。

2.PCR鑒定：以小鼠基因組DNA為模板，進行PCR擴增鑒定。采用特定引物及體系擴增(如下表所示)，電泳跑膠，鑒定結(jié)果顯示#111、#122、#165為陽性鼠(說明書附圖4)。至此，hGFAP-mAQP4轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建成功。

3.該小鼠鑒定的PCR反應(yīng)體系以及所用引物信息如下：

PCR反應(yīng)體系

PCR引物信息

PCR反應(yīng)條件

構(gòu)建載體序列表