本發(fā)明屬于糖苷生物堿制備方法及藥物用途技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種螺旋甾堿烷型糖苷生物堿及其制備方法與用途。

背景技術(shù)：

糖苷生物堿主要分布在茄科及百合科的植物體內(nèi)，由疏水性的苷元和親水性的寡糖鏈構(gòu)成，其苷元包括螺旋甾堿烷、茄次堿烷和其他甾體衍生物三種，寡糖鏈由3～4個(gè)單糖組成，是一種甾體皂苷。植物合成糖苷生物堿主要是為了防御微生物、動(dòng)物及昆蟲的侵襲，因此，糖苷生物堿具有一定的毒性，但與此同時(shí)，它還具有降低膽固醇和高血壓、消炎、活血鎮(zhèn)痛、抗過敏、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗病原微生物等多種生理活性，具有潛在的藥用價(jià)值。茄科和百合科的植物在自然界中廣泛存在，如白英、馬鈴薯和番茄等植物，具有很強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，中藥白英始載于《神農(nóng)百草經(jīng)》，其味甘，性寒，具有清熱、解毒、祛風(fēng)、化瘀等功效，研究表明白英的主要化學(xué)成分為糖苷生物堿，因此，研究從中藥白英中提取新型的糖苷生物堿具有重要意義。

鑒于糖苷生物堿的上述藥物功效，醫(yī)藥界對其非常重視，中國專利文獻(xiàn)cn101450144a公開了一種白英總皂苷提取物及其制備方法和用途，該提取物為蜀羊泉苷b、蜀羊泉苷c、δ-苦茄堿和薯蕷皂苷(結(jié)構(gòu)式如下)中的一種或多種，上述白英總皂苷提取物可用于治療胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃癌和銀屑病等疾病，且具有很好的治療效果。眾所周知，白英總皂苷提取物是一種混合物，其包括了多種結(jié)構(gòu)的化合物，但并不能確定每種化合物均具有相同或相應(yīng)的功效，即并不能完全確認(rèn)上述文獻(xiàn)中公開的白英總皂苷提取物中包括的化合物對治療胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃癌和銀屑病等疾病均能起到良好的協(xié)同作用，這也是中藥提取物具有不可預(yù)見的副作用的原因，因此，對藥用植物提取物進(jìn)行進(jìn)一步的精制和研究，將多種復(fù)雜的化合物進(jìn)行分離和提取，并對其功效進(jìn)行確認(rèn)具有重要的意義，為此，如何對藥用植物提取物進(jìn)行有效的分離并得到具有潛在藥用價(jià)值的化合物是所有醫(yī)藥工作者所必須面對的課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中藥用植物提取物成分復(fù)雜，其所有成分的功效及相互影響不能完全確認(rèn)的缺陷，從而提供一種單一組分的化合物螺旋甾堿烷型糖苷生物堿，進(jìn)而提供其制備方法與其在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物中的用途。

為此，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供一種螺旋甾堿烷型糖苷生物堿，具有式(i)所示結(jié)構(gòu)，

本發(fā)明還提供一種上述螺旋甾堿烷型糖苷生物堿的制備方法，包括如下步驟：

(1)取白英藥材加入醇溶液中進(jìn)行醇提，將獲得的醇提取液進(jìn)行精制，即得白英總堿樣品，備用；

(2)將步驟(1)制備得到的白英總堿樣品加入醇溶液中加熱溶解，以薄層層析硅膠拌樣，然后上樣于硅膠層析柱中進(jìn)行層析分離，以體積比為(2～3):1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脫劑進(jìn)行洗脫，所述乙醇水溶液的體積濃度為93％～97％，，以鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液為顯色劑，以薄層色譜進(jìn)行檢測，合并相同流份，得到極性不同的兩種組分；

(3)將步驟(2)得到的兩種組分中極性小的組分用二甲基酰胺溶解，0.45um濾膜過濾，然后采用高效液相色譜法分離純化，色譜條件如下：c18液相色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相a，1％tfa水溶液為流動(dòng)相b，按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：0～10min，流動(dòng)相a：流動(dòng)相b的體積比為24％～26％：76％～74％→29％～31％：71％～69％；控制流動(dòng)相流速為25～35ml/min；控制柱溫為20～30℃；控制進(jìn)樣體積為0.5～1.5ml；通過質(zhì)譜檢測器檢測成分，收集相對分子質(zhì)量為899的成分，得到如式(i)所示結(jié)構(gòu)的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿。

在所述步驟(1)中，制備白英總堿樣品的具體方法為：將白英干燥全草用體積濃度為70％的乙醇水溶液回流提取，過濾，將濾液濃縮至50℃相對密度為1.05的浸膏，加入蒸餾水分散，過濾，取濾液加至d151大孔吸附樹脂柱，依次用2～4倍柱體積的蒸餾水和2～4倍柱體積的體積濃度為95％乙醇水溶液洗脫，棄去洗脫液，然后用3～5倍柱體積的體積濃度為6‰的鹽酸乙醇水溶液洗脫，所述鹽酸乙醇水溶液中乙醇的體積濃度為95％，收集鹽酸乙醇洗脫液，用氨水中和至中性，過濾，將濾液濃縮至干，用蒸餾水分散，將分散后的藥液加至ab-8大孔吸附樹脂，用6～10倍柱體積的蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，然后用3～5倍柱體積的體積濃度為95％乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得白英總堿。

在所述步驟(2)中，稱取白英總堿樣品30～40重量份，加入300-1000體積份的體積濃度為93～97％的乙醇水溶液中在溫度為80～100℃下溶解，然后加入10～20重量份的薄層層析硅膠混合均勻，上樣于加入780～820重量份的薄層層析硅膠的硅膠層析柱中進(jìn)行層析分離；

所述重量份與體積份的關(guān)系為g/ml。

在所述步驟(2)中，以體積比為2.5:1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脫劑進(jìn)行洗脫，所述乙醇水溶液的體積濃度為95％。

在所述步驟(2)中，所述鹽酸水溶液改良碘化鉍鉀試液的制備方法為：

稱取堿式硝酸鉍0.8～0.9重量份，依次加入9～11體積份的冰醋酸、39～41體積份的水和19～21體積份的碘化鉀溶液，混合均勻即得碘化鉍鉀試液；

向所述碘化鉍鉀試液中加入質(zhì)量濃度為0.6mol/l的鹽酸水溶液，所述碘化鉍鉀試液與所述鹽酸水溶液的體積比為1:2，即得所述鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液；

所述重量份與體積份的關(guān)系為g/ml。

在所述步驟(3)中，流動(dòng)相a：流動(dòng)相b的體積比為25％：75％→30％：70％。

本發(fā)明還提供包括上述螺旋甾堿烷型糖苷生物堿的制劑，或者包括上述制備方法制備得到的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿的制劑，以所述螺旋甾堿烷型糖苷生物堿為有效成分，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝制成臨床上可接受的制劑。

所述制劑包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、散劑、丸劑、酊劑、酒劑、煎膏劑、錠劑或合劑。

本發(fā)明還提供上述螺旋甾堿烷型糖苷生物堿、上述制備方法制備得到的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿、上述螺旋甾堿烷型糖苷生物堿的制劑在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物中的用途。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的上述技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明所述的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿，其為一種單一組分即化學(xué)命名為(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷，其對人肺腺癌細(xì)胞a549，人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞h460和人肺鱗癌細(xì)胞sk-mes-1均具有抑制作用，且本發(fā)明制備得到的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿對a549細(xì)胞的半抑制濃度為61.53μg/ml，對h460細(xì)胞的半抑制濃度為159.11μg/ml，對sk-mes-1細(xì)胞的半抑制濃度為81.64μg/ml，可見本發(fā)明所述的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿組分單一，功能確切，且可用于治療非小細(xì)胞肺癌。

2、本發(fā)明所述的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿的制備方法，由于糖苷生物堿含有極性較大的糖鏈結(jié)構(gòu)和極性較小的甾體單元，使得糖苷生物堿不溶于水、丙酮和乙酸乙酯等大多數(shù)有機(jī)溶劑，只能溶于甲醇、乙醇等少數(shù)有機(jī)溶劑，糖苷生物堿結(jié)構(gòu)中含有氮原子，表現(xiàn)出一定的弱堿性，因此可在酸性溶液中成鹽溶解，在堿性條件下沉淀析出，因此本發(fā)明采用鹽酸乙醇-氨水沉淀法精制白英總堿，然后應(yīng)用柱層析，以薄層色譜進(jìn)行檢測，合并相同流份，得到極性不同的兩種組分；將兩種組分中極性小的組分用二甲基酰胺溶解后通過制備色譜純化，通過質(zhì)譜檢測器檢測成分，收集相對分子質(zhì)量為899的成分，得到本發(fā)明所述的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷，所述制備方法操作簡單，科學(xué)合理。

3、本發(fā)明所述的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿的制備方法，在柱層析分離過程中以鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液為顯色劑，該顯色劑的制備方法為：向堿式硝酸鉍中依次加入冰醋酸、水和碘化鉀溶液，再向混合均勻后的試液中加入0.6mol/l的鹽酸水溶液，所述碘化鉍鉀試液與所述鹽酸水溶液的體積比為1:2，即制得所述鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液，該制備方法制備得到的顯色劑使得以薄層色譜進(jìn)行檢測時(shí)，極性組分相對背景色而言顯色清楚，容易判斷。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的結(jié)構(gòu)式；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的¹hnmr譜圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的¹³cnmr譜圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的h-hcosy譜圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的hmqc譜圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的hmbc譜圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的tocsy譜圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的noesy譜圖；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷對a549、h460和sk-mes-1細(xì)胞的抑制效果圖。

具體實(shí)施方式

下面將對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。此外，下面所描述的本發(fā)明不同實(shí)施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互結(jié)合。

本發(fā)明以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例中，

1、試劑與耗材：

細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國falcon353014)；

penicillin/streptomycinsolution(中國江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司kgy002)；

0.25％tripsin-edta(中國江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司kgy001)；

mtt(美國amresco0793)；

dmso(美國sigmad2650)；

pbs(中國江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司kgb500)；

rpmi-1640(美國gibco31800-105)；

dmem(美國gibco12800-082)；

fbs(美國excellbiologyfbs500)；

96wellcellcultureplate(美國corningincorporated3599)；

2、儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)(中國蘇州凈化sw-cj-1fd)；

co2培養(yǎng)箱(日本sanyoxd-101)；

生物倒置顯微鏡(日本olympusix51)；

臺(tái)式低速離心機(jī)(中國上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠80-2)；

2.5ul、10ul、200ul、1000ul移液器(德國eppendorf)；

立式壓力鍋(中國上海博訊，yxq-ls-50)；

電熱鼓風(fēng)干燥箱(中國上海圣欣，101as-3)；

酶標(biāo)儀(美國biotekelx800)；

振蕩器(中國上海滬西分析儀器廠wh-2)；

waters2767/qda制備液相質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀：masslynx4.1色譜工作站，waters2767樣品管理器，waters2489紫外可見光檢測器，waters2545二元高壓色譜泵，qda質(zhì)譜檢測器，色譜柱為waterssunfireprepc18obd(10μm，19×250mm)column。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的制備方法包括以下步驟：

(1)取10kg白英干燥全草，加入80l體積濃度為70％的乙醇水溶液，回流提取3次，每次提取2h，過濾，合并濾液；將上述濾液濃縮至在50℃相對密度為1.05的浸膏，加入10倍浸膏質(zhì)量的蒸餾水分散，過濾，取濾液加至d151大孔吸附樹脂柱，依次用3倍柱體積的蒸餾水和3倍柱體積的體積濃度為95％的乙醇水溶液洗脫，棄去洗脫液，然后用4倍柱體積的含有體積分?jǐn)?shù)為6‰鹽酸的乙醇水溶液洗脫，所述鹽酸乙醇水溶液中乙醇的體積濃度為95％，收集鹽酸乙醇洗脫液，用氨水中和至中性，過濾，將濾液濃縮至干，用蒸餾水分散，將分散后的藥液加至ab-8大孔吸附樹脂，用8倍柱體積的蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，然后用4倍柱體積的體積濃度為95％的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得35g白英總堿，得率為3.5‰；

(2)取35g白英總堿樣品加入650ml體積濃度為95％乙醇水溶液中在溫度為90℃下溶解，然后加入15g薄層層析硅膠混合均勻，上樣于加入800g的薄層層析硅膠的硅膠層析柱中進(jìn)行層析分離；以體積比為2.5∶1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脫劑進(jìn)行洗脫，所述乙醇水溶液的體積濃度為95％，以鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液為顯色劑，以薄層色譜進(jìn)行檢測，合并相同流份，得到極性不同的兩種組分；

所述鹽酸水溶液改良碘化鉍鉀試液的具體方法為：稱取堿式硝酸鉍0.85g，依次加入10ml冰醋酸、40ml水和20ml碘化鉀溶液，混合均勻即得碘化鉍鉀試液；取1ml配置好的碘化鉍鉀試液，加入2ml質(zhì)量濃度為0.6mol/l的鹽酸水溶液，即得所述鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液。

(3)將步驟(2)得到的兩種組分中極性小的組分用二甲基酰胺溶解，0.45um濾膜過濾，然后采用高效液相色譜法分離純化，色譜條件如下：c18液相色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相a，1％tfa水溶液為流動(dòng)相b，按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：0～10min，流動(dòng)相a：流動(dòng)相b的體積比為25％：75％→30％～70％；控制流動(dòng)相流速為30ml/min；控制柱溫為25℃；控制進(jìn)樣體積為1ml；通過質(zhì)譜檢測器檢測成分，收集相對分子質(zhì)量為899的成分，得到如式(i)所示結(jié)構(gòu)的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿。

本實(shí)施例制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的¹hnmr譜圖、¹³cnmr譜圖、h-hcosy譜圖、hmqc譜圖、hmbc譜圖、tocsy譜圖和noesy譜圖分別見圖2-8。

本實(shí)施例制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示，其中碳原子編號1-27已經(jīng)在圖1所示的結(jié)構(gòu)式中標(biāo)出。表1為圖2-8的解析結(jié)果。

表1圖2-8的解析結(jié)果

其中，表1中的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)為在¹h-nmr(600mhz)和¹³c-nmr(150mhz)，溶劑為氘代甲醇的條件下得到。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的制備方法包括以下步驟：

(1)精制白英總堿：取10kg白英干燥全草，加入60l體積濃度為70％乙醇水溶液，回流提取4次，每次提取2h，過濾，合并濾液；將上述濾液濃縮至在50℃相對密度為1.05的浸膏，加入8倍浸膏質(zhì)量的蒸餾水分散，過濾，取濾液加至d151大孔吸附樹脂柱，依次用2倍柱體積的蒸餾水和4倍柱體積的體積濃度為95％乙醇水溶液洗脫，棄去洗脫液，然后用3倍柱體積的含有體積濃度為6‰鹽酸的乙醇水溶液洗脫，所述鹽酸乙醇水溶液中乙醇的體積濃度為95％，收集鹽酸乙醇洗脫液，用氨水中和至中性，過濾，將濾液濃縮至干，用蒸餾水分散，將分散后的藥液加至ab-8大孔吸附樹脂，用6倍柱體積的蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，然后用5倍柱體積的體積濃度為95％乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得35g白英總堿，得率為3.5‰；

(2)取30g白英總堿樣品加入1000ml體積濃度為93％乙醇水溶液中在溫度為100℃下溶解，然后加入10g薄層層析硅膠混合均勻，上樣于加入820g的薄層層析硅膠的硅膠層析柱中進(jìn)行層析分離；以體積比為3∶1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脫劑進(jìn)行洗脫，所述乙醇水溶液的體積濃度為93％，以鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液為顯色劑，以薄層色譜進(jìn)行檢測，合并相同流份，得到極性不同的兩種組分；

所述鹽酸水溶液改良碘化鉍鉀試液的具體方法為：稱取堿式硝酸鉍0.8g，依次加入11ml冰醋酸、39ml水和21ml碘化鉀溶液，混合均勻即得碘化鉍鉀試液；取1ml配置好的碘化鉍鉀試液，加入2ml質(zhì)量濃度為0.6mol/l的鹽酸水溶液，即得所述鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液。

(3)將步驟(2)得到的兩種組分中極性小的組分用二甲基酰胺溶解，0.45um濾膜過濾，然后采用高效液相色譜法分離純化，色譜條件如下：c18液相色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相a，1％tfa水溶液為流動(dòng)相b，按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：0～10min，流動(dòng)相a：流動(dòng)相b的體積比為24％：76％→31％～69％；控制流動(dòng)相流速為25ml/min；控制柱溫為30℃；控制進(jìn)樣體積為0.5ml；通過質(zhì)譜檢測器檢測成分，收集相對分子質(zhì)量為899的成分，得到如式(i)所示結(jié)構(gòu)的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿。

本實(shí)施例制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝制成片劑。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的制備方法包括以下步驟：

(1)精制白英總堿：取10kg白英干燥全草，加入100l體積濃度為70％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2h，過濾，合并濾液；將上述濾液濃縮至在50℃相對密度為1.05的浸膏，加入12倍浸膏質(zhì)量的蒸餾水分散，過濾，取濾液加至d151大孔吸附樹脂柱，依次用4倍柱體積的蒸餾水和2倍柱體積的體積濃度為95％乙醇水溶液洗脫，棄去洗脫液，然后用5倍柱體積的含有體積分?jǐn)?shù)為6‰鹽酸的乙醇水溶液洗脫，鹽酸乙醇水溶液中乙醇的體積濃度為95％，收集鹽酸乙醇洗脫液，用氨水中和至中性，過濾，將濾液濃縮至干，用蒸餾水分散，將分散后的藥液加至ab-8大孔吸附樹脂，用10倍柱體積的蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，然后用3倍柱體積的體積濃度為95％乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得35g白英總堿，得率為3.5‰；

(2)取40g白英總堿樣品加入300ml體積濃度為97％乙醇水溶液中在溫度為80℃下溶解，然后加入20g薄層層析硅膠混合均勻，上樣于加入780g的薄層層析硅膠的硅膠層析柱中進(jìn)行層析分離；以體積比為2:1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脫劑進(jìn)行洗脫，所述乙醇水溶液的體積濃度為97％，以鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液為顯色劑，以薄層色譜進(jìn)行檢測，合并相同流份，得到極性不同的兩種組分；

所述鹽酸水溶液改良碘化鉍鉀試液的具體方法為：稱取堿式硝酸鉍0.9g，依次加入9ml冰醋酸、41ml水和19ml碘化鉀溶液，混合均勻即得碘化鉍鉀試液；取1ml配置好的碘化鉍鉀試液，加入2ml質(zhì)量濃度為0.6mol/l的鹽酸水溶液，即得所述鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液。

(3)將步驟(2)得到的兩種組分中極性小的組分用二甲基酰胺溶解，0.45um濾膜過濾，然后采用高效液相色譜法分離純化，色譜條件如下：c18液相色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相a，1％tfa水溶液為流動(dòng)相b，按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：0～10min，流動(dòng)相a：流動(dòng)相b的體積比為26％：74％→29％～71％；控制流動(dòng)相流速為35ml/min；控制柱溫為20℃；控制進(jìn)樣體積為1.5ml；通過質(zhì)譜檢測器檢測成分，收集相對分子質(zhì)量為899的成分，得到如式(i)所示結(jié)構(gòu)的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿。

本實(shí)施例制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝制成膠囊劑。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的制備方法包括以下步驟：

(1)精制白英總堿：取10kg白英干燥全草，加入100l體積濃度為70％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2h，過濾，合并濾液；將上述濾液濃縮至在50℃相對密度為1.05的浸膏，加入12倍浸膏質(zhì)量的蒸餾水分散，過濾，取濾液加至d151大孔吸附樹脂柱，依次用3倍柱體積的蒸餾水和2倍柱體積的體積濃度為95％乙醇水溶液洗脫，棄去洗脫液，然后用4倍柱體積的含有體積分?jǐn)?shù)為6‰鹽酸的乙醇水溶液洗脫，所述鹽酸乙醇水溶液中乙醇的體積濃度為95％，收集鹽酸乙醇洗脫液，用氨水中和至中性，過濾，將濾液濃縮至干，用蒸餾水分散，將分散后的藥液加至ab-8大孔吸附樹脂，用10倍柱體積的蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，然后用4倍柱體積的體積濃度為95％乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得35g白英總堿，得率為3.5‰；

(2)取38g白英總堿樣品加入300ml體積濃度為94％乙醇水溶液中在溫度為80℃下溶解，然后加入16g薄層層析硅膠混合均勻，上樣于加入780g的薄層層析硅膠的硅膠層析柱中進(jìn)行層析分離；以體積比為2.6:1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脫劑進(jìn)行洗脫，所述乙醇水溶液的體積濃度為94％，以鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液為顯色劑，以薄層色譜進(jìn)行檢測，合并相同流份，得到極性不同的兩種組分；

所述鹽酸水溶液改良碘化鉍鉀試液的具體方法為：稱取堿式硝酸鉍0.88g，依次加入10.5ml冰醋酸、40.5ml水和19ml碘化鉀溶液，混合均勻即得碘化鉍鉀試液；取1ml配置好的碘化鉍鉀試液，加入2ml質(zhì)量濃度為0.6mol/l的鹽酸水溶液，即得所述鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液。

(3)將步驟(2)得到的兩種組分中極性小的組分用二甲基酰胺溶解，0.45um濾膜過濾，然后采用高效液相色譜法分離純化，色譜條件如下：c18液相色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相a，1％tfa水溶液為流動(dòng)相b，按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：0～10min，流動(dòng)相a：流動(dòng)相b的體積比為26％：74％→29％～71％；控制流動(dòng)相流速為35ml/min；控制柱溫為20℃；控制進(jìn)樣體積為1.5ml；通過質(zhì)譜檢測器檢測成分，收集相對分子質(zhì)量為899的成分，得到如式(i)所示結(jié)構(gòu)的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿。

本實(shí)施例制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝制成糖漿劑。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷的制備方法包括以下步驟：

(1)精制白英總堿：取10kg白英干燥全草，加入100l體積濃度為70％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2h，過濾，合并濾液；將上述濾液濃縮至在50℃相對密度為1.05的浸膏，加入12倍浸膏質(zhì)量的蒸餾水分散，過濾，取濾液加至d151大孔吸附樹脂柱，依次用2倍柱體積的蒸餾水和3倍柱體積的體積濃度為95％乙醇水溶液洗脫，棄去洗脫液，然后用4倍柱體積的含有體積分?jǐn)?shù)為6‰鹽酸的乙醇水溶液洗脫，所述鹽酸乙醇水溶液中乙醇的體積濃度為95％，收集鹽酸乙醇洗脫液，用氨水中和至中性，過濾，將濾液濃縮至干，用蒸餾水分散，將分散后的藥液加至ab-8大孔吸附樹脂，用8倍柱體積的蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，然后用5倍柱體積的體積濃度為95％乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得35g白英總堿，得率為3.5‰；

(2)取32g白英總堿樣品加入1000ml體積濃度為96％乙醇水溶液中在溫度為80℃下溶解，然后加入20g薄層層析硅膠混合均勻，上樣于加入810g的薄層層析硅膠的硅膠層析柱中進(jìn)行層析分離；以體積比為2.8:1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脫劑進(jìn)行洗脫，所述乙醇水溶液的體積濃度為96％，以鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液為顯色劑，以薄層色譜進(jìn)行檢測，合并相同流份，得到極性不同的兩種組分；

所述鹽酸水溶液改良碘化鉍鉀試液的具體方法為：稱取堿式硝酸鉍0.81g，依次加入9.6ml冰醋酸、40ml水和19.5ml碘化鉀溶液，混合均勻即得碘化鉍鉀試液；取1ml配置好的碘化鉍鉀試液，加入2ml質(zhì)量濃度為0.6mol/l的鹽酸水溶液，即得所述鹽酸水溶液改良的碘化鉍鉀試液。

(3)將步驟(2)得到的兩種組分中極性小的組分用二甲基酰胺溶解，0.45um濾膜過濾，然后采用高效液相色譜法分離純化，色譜條件如下：c18液相色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相a，1％tfa水溶液為流動(dòng)相b，按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：0～10min，流動(dòng)相a：流動(dòng)相b的體積比為26％：74％→29％～71％；控制流動(dòng)相流速為35ml/min；控制柱溫為20℃；控制進(jìn)樣體積為1.5ml；通過質(zhì)譜檢測器檢測成分，收集相對分子質(zhì)量為899的成分，得到如式(i)所示結(jié)構(gòu)的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿。

本實(shí)施例制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝制成酊劑。

實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制效果

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

研究本發(fā)明制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制效果。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞信息

三種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株：人肺腺癌細(xì)胞a549，人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞h460，人肺鱗癌細(xì)胞sk-mes-1，細(xì)胞均由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供；a549/h460完全培養(yǎng)基為90％rpmi640+10％fbs；sk-mes-1完全培養(yǎng)基為90％dmem+10％fbs；于37℃、5％co2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)

(1)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80％～90％時(shí)，把原有培養(yǎng)基吸掉；

(2)加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌?0.25％)，消化1～2min；

(3)細(xì)胞都變圓后加入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化；

(4)用移液槍吹打細(xì)胞，把細(xì)胞都懸浮起來，然后將細(xì)胞吸到15ml的離心管中，1000rpm離心5min；

(5)倒掉上清液，加1～2ml培養(yǎng)基，將細(xì)胞重新懸浮轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3mtt法檢測細(xì)胞增殖：

(1)分別取對數(shù)生長期a549、h460、sk-mes-1細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為5×10⁴個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μl細(xì)胞懸液；

(2)將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

(3)用完全培養(yǎng)基稀釋本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿至表2中所需藥物濃度，每孔加入100μl相應(yīng)的上述含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立空白對照組(加入同體積空白培養(yǎng)液)；

(4)將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h；

(5)將96孔板進(jìn)行mtt染色，λ＝490nm，測定od值；

a每孔加入20μlmtt(5mg/ml)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h；

b棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μldmso溶解，搖床10min輕輕混勻；

cλ＝490nm，酶標(biāo)儀讀出每孔的吸光度od值，計(jì)算抑制率；

(6)計(jì)數(shù)各組別抑制率及藥物半抑制濃度(ic50)

抑制率(％)＝(a空白對照組-a藥物組)/a空白對照組×100％，

式中，a為吸光度。

應(yīng)用spss(staffsticalpackageforthesocialscience)17.0通過機(jī)率單位加權(quán)回歸法(bliss法)計(jì)算ic50。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本發(fā)明制備得到的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿對人肺腺癌細(xì)胞a549，人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞h460和人肺鱗癌細(xì)胞sk-mes-1的抑制效果如表2和圖9所示。

表2本發(fā)明制備得到的螺旋甾堿烷型糖苷生物堿對a549、h460、sk-mes-1細(xì)胞的抑制率(n＝6)

由表2和圖9可知，隨著(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷濃度的增加，其對細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷對a549細(xì)胞的半抑制濃度為61.53μg/ml，對h460細(xì)胞的半抑制濃度為159.11μg/ml，對sk-mes-1細(xì)胞的半抑制濃度為81.64μg/ml。

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本發(fā)明制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷對人肺腺癌細(xì)胞a549、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞h460和人肺鱗癌細(xì)胞sk-mes-1具有較好的抑制效果，且對人肺腺癌細(xì)胞a549的抑制效果比其他兩種癌細(xì)胞效果好，由此表明，本發(fā)明制備得到的(3β,22α,25r)-螺旋甾堿烷-5-烯基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-d-吡喃半乳糖苷可用于治療非小細(xì)胞肺癌。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。