關(guān)于序列表的聲明

與本申請(qǐng)相關(guān)的序列表是以代替紙件形式的純文本格式提供的，并通過引用并入本說明書。含有所述序列表的該文本文件的名稱是FATE_094_00WO_ST25.txt。該文本文件的大小為4KB，其創(chuàng)建于2011年12月15日，并經(jīng)由EFS-Web提交。

引用的相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)根據(jù)35 U.S.C.§119(e)要求2010年12月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/429,369號(hào)，及2011年6月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/496,991號(hào)的權(quán)益，在此通過引用將每一臨時(shí)申請(qǐng)全文并入。

發(fā)明背景

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明通常涉及用于培養(yǎng)干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基和培養(yǎng)平臺(tái)，包括用于再生和培養(yǎng)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)的無飼養(yǎng)層條件。

相關(guān)領(lǐng)域描述

多能干細(xì)胞生物學(xué)的應(yīng)用為再生醫(yī)學(xué)打開了新的大門。通過在生長(zhǎng)因子的混合物中培養(yǎng)胚胎植入前囊胚，人胚胎干細(xì)胞(hESC)的衍生導(dǎo)致了許多有前途的細(xì)胞治療方法，其中擴(kuò)大的自我更新的細(xì)胞群可以在體外或在體內(nèi)分化為與治療有關(guān)的細(xì)胞系。在另一ESC生物學(xué)應(yīng)用并且通過使用胚胎植入前基因分析，可能從幾個(gè)遺傳性疾病背景衍生ESC系從而在組織培養(yǎng)皿中模擬這些疾病。然而ESC技術(shù)存在一些局限性：自其中可以衍生ESC的遺傳背景的范圍受技術(shù)性與政治性限制，ESC的遺傳背景并不總是已知的而且ESC衍生的細(xì)胞治療本質(zhì)上為同種異體移植物，冒著與傳統(tǒng)的組織/器官移植相同的排斥風(fēng)險(xiǎn)。

在一大進(jìn)步中，多能細(xì)胞群產(chǎn)生于成年人的終末分化細(xì)胞：此類衍生的細(xì)胞被稱作誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)。iPSC技術(shù)允許來自任何供體的細(xì)胞重新編程為多能的自我更新的狀態(tài)并且從而允許來自任何遺傳背景的同種的細(xì)胞群擴(kuò)增。iPSC克服了與ESC有關(guān)的倫理考量并且可以用于衍生任何遺傳性人疾病的模型以用于高通量藥物篩選或肝細(xì)胞與心肌細(xì)胞異型生物質(zhì)的藥物毒性篩選。另外，iPSC可最終導(dǎo)致自體移植中產(chǎn)生于患者自體細(xì)胞的防止移植排斥的細(xì)胞治療。表達(dá)與差異分析顯示iPSC與ESC在分子水平上非常接近，與多個(gè)ESC系相比時(shí)，所見到這些相似量級(jí)的克隆的iPSC培養(yǎng)物間差異。

通常通過幾個(gè)關(guān)鍵基因的異位表達(dá)產(chǎn)生iPSC，該關(guān)鍵基因?yàn)槿恐匦戮幊趟枰模碠ct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28以及Nanog的組合。最初使用整合病毒系統(tǒng)以表達(dá)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生iPSC。已成功地將包括多順反子與誘導(dǎo)系統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒與慢病毒系統(tǒng)應(yīng)用于iPSC產(chǎn)生。然而，由于插入突變而產(chǎn)生的永久性基因組變化與iPSC分化后外源基因再激活的潛在性可能為隨后的藥物篩選與這些方法所產(chǎn)生的細(xì)胞的治療應(yīng)用帶來潛在的問題。確實(shí)已報(bào)道了使用相同的病毒系統(tǒng)所產(chǎn)生的iPSC克隆間顯著的差異，在嚙齒動(dòng)物中作為分化神經(jīng)球移植時(shí)有很大比例的形成腫瘤的克隆。研究表明使用相同的病毒方法所產(chǎn)生的iPSC一旦分化可有不同的表現(xiàn)。異位基因整合位點(diǎn)的差異可導(dǎo)致不同的插入突變與轉(zhuǎn)基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控。對(duì)包括整合系統(tǒng)的iPSC產(chǎn)生方法而言，需要衍生及篩選許多克隆以鑒定在多能的與分化的狀態(tài)中都穩(wěn)定的那些。因此，將來自給定的供體細(xì)胞源的克隆的iPSC的快速衍生的方法為有利的。盡管效率較低，已經(jīng)證明了諸如腺病毒或附加型瞬時(shí)表達(dá)的用于iPSC產(chǎn)生的非整合系統(tǒng)的使用。這些系統(tǒng)可克服iPSC產(chǎn)生中的安全性與穩(wěn)定性問題，然而當(dāng)使用任何基于DNA的重新編程方法時(shí)存在基因組整合的潛在性并且這需要在它們用于研發(fā)iPSC衍生的細(xì)胞治療之前進(jìn)行評(píng)估。

可切除的病毒系統(tǒng)與全基因組表達(dá)譜顯示具有整合的表達(dá)組件的iPSC比相同的具有切除的病毒因子的克隆更不像ESC。而且，已證明了其中最常用的轉(zhuǎn)錄因子以具有細(xì)胞穿透肽的融合蛋白的形式表達(dá)于大腸桿菌(E.coli)中的只有蛋白重新編程。多劑量的純化蛋白應(yīng)用于小鼠成纖維細(xì)胞中導(dǎo)致iPSC產(chǎn)生。使用只有蛋白系統(tǒng)的重新編程的效率是很低的。這可歸因于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率、蛋白的特異活性和/或蛋白的穩(wěn)定性。

分化細(xì)胞通過多能性基因的異位表達(dá)重新編程的過程或它們經(jīng)由蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)或mRNA的引入需要幾個(gè)月與熟練的干細(xì)胞生物學(xué)家的知識(shí)。最初通過眼睛進(jìn)行重新編程的細(xì)胞的鑒定：ESC樣集落形態(tài)的篩選。此類集落必須用手挑選，通常機(jī)械地傳代及擴(kuò)增。多能性因子的引入也產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞集落以及不完全重新編程的細(xì)胞。研究者能夠從轉(zhuǎn)化細(xì)胞的背景中鑒定出真正的iPSC集落，但這不是個(gè)高效的過程。然后需要進(jìn)一步的特征與確認(rèn)為真正的多能群體并且通常包括用于多能性標(biāo)志物的免疫組織化學(xué)染色、基因表達(dá)與表觀遺傳分析以及多能群體分化為三個(gè)胚層(外胚層、中胚層與內(nèi)胚層)的能力。一旦鑒定并且選擇了多能細(xì)胞，通常此類細(xì)胞就會(huì)生長(zhǎng)為集落并且需要在重新涂板之前通過挑選和機(jī)械地解離細(xì)胞來手工傳代以長(zhǎng)期保持細(xì)胞。

來源于各種植入期之前與植入期之后的胚胎干細(xì)胞顯示了不同的多能性狀態(tài)。例如，衍生于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞被認(rèn)為是更“原初的”并且具有完全不同于植入后衍生細(xì)胞的主要特性，該植入后衍生細(xì)胞被認(rèn)為是更“成熟的”，具有較高的隨機(jī)分化傾向性。原初細(xì)胞顯得更“基態(tài)”并且不需要外在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以保持它們的未分化狀態(tài)。在另一方面，激活細(xì)胞需要包括TGFβ、激活素以及bFGF的關(guān)鍵細(xì)胞因子的外在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并且非常依賴于ERK/MAPK細(xì)胞通路以保持它們的未分化狀態(tài)。

iPSC產(chǎn)生過程的改善可顯著地降低技術(shù)壁壘，加速過程并且能夠使隨后的細(xì)胞按比例增加與分化以用于技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用諸如藥物篩選與細(xì)胞治療。需要用于更有效的不使用外源性物質(zhì)iPSC生產(chǎn)以及更有效的重新編程細(xì)胞的鑒定與篩選的方法。促進(jìn)人多能干細(xì)胞原初狀態(tài)的產(chǎn)生iPSC的方法將極大地有利于將來在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，諸如疾病校正、定向分化以及制造業(yè)規(guī)模擴(kuò)張。而且，需要在使單細(xì)胞能夠傳代的特定的培養(yǎng)狀態(tài)中更有效的產(chǎn)生iPSC的方法與可擴(kuò)展性。

發(fā)明概述

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了無飼養(yǎng)層環(huán)境中培養(yǎng)多能細(xì)胞的方法，其包括：在無飼養(yǎng)層環(huán)境中，在包含至少一種保持細(xì)胞多能性的制劑的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)不是小鼠胚胎干細(xì)胞的多能細(xì)胞同時(shí)在培養(yǎng)期間保持細(xì)胞的多能性，其中所述制劑選自：i)TFGβ抑制劑；ii)GSK3抑制劑；iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑，。

在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含足夠量的制劑以允許至少一次細(xì)胞分裂同時(shí)保持細(xì)胞的多能性。在具體實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含至少三種或四種保持細(xì)胞多能性的制劑。

仍在另一實(shí)施方案中，保持細(xì)胞多能性的制劑包含Rock抑制劑。在具體實(shí)施方案中，Rock抑制劑為thiazovivin或Y27632。

在一實(shí)施方案中，保持細(xì)胞多能性的制劑包含TFGβ抑制劑，并且在具體實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為A-83-01或SB431542。

在另一實(shí)施方案中，保持細(xì)胞多能性的制劑包含GSK3抑制劑，并且在具體實(shí)施方案中，GSK3抑制劑為CHIR99021或BIO。

在一實(shí)施方案中，保持細(xì)胞多能性的制劑包含MEK抑制劑。在具體實(shí)施方案中，MEK抑制劑為PD98059或PD032901。

在具體實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑。在本發(fā)明更具體的實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，保持細(xì)胞的多能性至少五次細(xì)胞分裂。在其他的實(shí)施方案中，保持細(xì)胞的多能性至少十次細(xì)胞分裂。

在一些實(shí)施方案中，在缺乏生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子，任選地存在可溶性纖連蛋白的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，在缺乏Matrigel^TM。的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，并且仍在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基基本上不含bFGF。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，多能細(xì)胞為人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了包括在缺乏生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子的情況下培養(yǎng)不是小鼠胚胎干細(xì)胞的多能細(xì)胞的培養(yǎng)多能細(xì)胞的方法。

在某些實(shí)施方案中，方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含至少一種保持細(xì)胞多能性的制劑以允許至少一次細(xì)胞分裂同時(shí)保持細(xì)胞的多能性，其中制劑選自：i)TFGβ抑制劑；ii)GSK3抑制劑；iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑。

在一實(shí)施方案中，多能細(xì)胞為人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。

在另外的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含至少兩種、至少三種或四種選自的制劑：i)TFGβ抑制劑；ii)GSK3抑制劑；iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑；在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑；在其他具體的實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案還提供了獲得解離的人多能細(xì)胞的方法，包括解離人多能細(xì)胞以獲得解離的細(xì)胞并且使解離的細(xì)胞接觸培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含至少一種增強(qiáng)解離的細(xì)胞活力的制劑，其中制劑選自：i)TFGβ抑制劑；ii)GSK3抑制劑；iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑，借此增強(qiáng)了解離的細(xì)胞的活力。在具體的實(shí)施方案中，解離的細(xì)胞的活力增強(qiáng)了至少10％、至少50％、至少100％、至少200％、或至少500％。

在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)解離的細(xì)胞至少一次、至少兩次、至少五次、或至少十次傳代，同時(shí)保持解離的細(xì)胞的多能性。

在某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)后解離的細(xì)胞的核型基本上與解離前細(xì)胞群的核型相似。

在一些實(shí)施方案中，方法包括在制劑存在的情況下解離。仍在其他的實(shí)施方案中，方法包括在解離前將多能細(xì)胞與制劑接觸。在具體的實(shí)施方案中，將解離的細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸包括將解離的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中。

在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在無飼養(yǎng)層環(huán)境中增加細(xì)胞潛能的方法，包括在無飼養(yǎng)層環(huán)境中將細(xì)胞與包含至少一種小分子制劑的培養(yǎng)基接觸以獲得具有與接觸培養(yǎng)基前的細(xì)胞相比潛能增加的細(xì)胞，其中小分子制劑選自：i)TFGβ抑制劑；ii)GSK3抑制劑；iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑；在某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在一實(shí)施方案中，接觸包括在足以增加細(xì)胞潛能的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞選自：胚胎干細(xì)胞、多能細(xì)胞、專能細(xì)胞、非多能細(xì)胞以及體細(xì)胞。

在具體的實(shí)施方案中，細(xì)胞不是小鼠胚胎干細(xì)胞。在其他的具體實(shí)施方案中，細(xì)胞為人細(xì)胞，并且在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，方法還包括將細(xì)胞與至少一種多能性因子接觸。在一些實(shí)施方案中，多能性因子包含多核苷酸、多肽或小分子。在一些實(shí)施方案中，多能性因子為外源性轉(zhuǎn)錄因子。在具體的實(shí)施方案中，外源性轉(zhuǎn)錄因子包含Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog多肽或編碼Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog的多核苷酸。在其他的實(shí)施方案中，多肽包含允許運(yùn)輸穿過細(xì)胞膜的氨基酸序列。在其他具體的實(shí)施方案中，外源性轉(zhuǎn)錄因子包含Oct4、Sox2以及Klf4多核苷酸。

仍在其他的實(shí)施方案中，具有潛能增加的細(xì)胞通過下列的一種或多種進(jìn)行表征：選自O(shè)ct4、Nanog、KLF4、SSEA4以及TRA 1-81組成的至少一種多能干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)；多能干細(xì)胞形態(tài)學(xué)；引起種系傳遞的能力；畸胎瘤的形成；分化或轉(zhuǎn)分化為與起始譜系不同的譜系的能力，以及體外三系分化。在一些實(shí)施方案中，具有增加的潛能的細(xì)胞表達(dá)，與接觸培養(yǎng)基前的細(xì)胞相比，至少高兩倍的Oct4水平。仍在其他的實(shí)施方案中，具有增加的潛能的細(xì)胞具有與常規(guī)培養(yǎng)的iPSC相比至少低兩倍的Xist活性。在另外的實(shí)施方案中，具有增加的潛能的細(xì)胞具有緊密的、半球形的集落形態(tài)。

在一些實(shí)施方案中，在缺乏TFGβ、激活素以及MEK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的外源性刺激，并且任選地缺乏bFGF通路的外源性刺激的情況下具有增加的潛能的細(xì)胞復(fù)制并且保持多能性。

在其他的實(shí)施方案中，方法還包括在無飼養(yǎng)層環(huán)境中，在i)TFGβ抑制劑；ii)GSK3抑制劑；iii)MEK抑制劑或iv)Rock抑制劑中的至少一種存在的情況下，培養(yǎng)具有增加的潛能的細(xì)胞以允許至少一次細(xì)胞分裂同時(shí)保持細(xì)胞多能性。在具體的實(shí)施方案中，在TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑存在的情況下，培養(yǎng)細(xì)胞；在某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

本發(fā)明也提供了通過任何以上的實(shí)施方案所產(chǎn)生的具有增加的潛能的細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了在無飼養(yǎng)層環(huán)境中提高細(xì)胞群的重新編程的效率的方法，包括在足以誘導(dǎo)重新編程的條件下，將無飼養(yǎng)層環(huán)境中的細(xì)胞群與選自i)TFGβ抑制劑；ii)GSK3抑制劑；iii)MEK抑制劑，以及iv)Rock抑制劑組成的至少一種小分子制劑接觸，借此，與沒有接觸小分子制劑的細(xì)胞群的重新編程的效率相比，重新編程的效率提高了至少10％、至少50％、至少100％、至少300％、或至少500％。

在具體的實(shí)施方案中，細(xì)胞與TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑接觸；在某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在一些實(shí)施方案中，重新編程之前細(xì)胞群包含非多能細(xì)胞。在其他的實(shí)施方案中，通過重新編程所需要的時(shí)間或重新編程的細(xì)胞數(shù)測(cè)量重新編程的效率。

仍在其他的實(shí)施方案中，足以誘導(dǎo)重新編程的條件包括將細(xì)胞群與選自O(shè)ct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog多肽或編碼Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog的多核苷酸的至少一種外源性轉(zhuǎn)錄因子接觸。在具體的實(shí)施方案中，條件包括將細(xì)胞群與Oct4、Sox2及Klf4多肽或編碼Oct4、Sox2及Klf4的多核苷酸接觸。

本發(fā)明的其他實(shí)施方案還提供了在無飼養(yǎng)層環(huán)境中分選細(xì)胞群以獲得富含多能細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，包括在無飼養(yǎng)層環(huán)境中獲得包含混合細(xì)胞群的解離的細(xì)胞的懸浮液，并且分選懸浮液中的細(xì)胞以獲得表達(dá)一種或多種多能性標(biāo)志物的細(xì)胞，因此獲得富含多能細(xì)胞的富集的細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，懸浮液包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑或Rock抑制劑中的至少一種。在另外的實(shí)施方案中，分選為通過磁珠或流式細(xì)胞術(shù)。在具體的實(shí)施方案中，分選為通過磁珠。在其他的實(shí)施方案中，分選為通過流式細(xì)胞術(shù)。

在一些實(shí)施方案中，方法還包括在包含i)TFGβ抑制劑；ii)GSK3抑制劑；iii)MEK抑制劑或iv)Rock抑制劑中的至少一種，任選地聯(lián)合可溶性纖連蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)富集的細(xì)胞群。

在具體的實(shí)施方案中，懸浮液中的混合細(xì)胞群在分選前與i)TFGβ抑制劑；ii)GSK3抑制劑；iii)MEK抑制劑或iv)Rock抑制劑中的至少一種接觸。在某些實(shí)施方案中，混合的細(xì)胞群與TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑接觸；在其他某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在具體的實(shí)施方案中，混合的細(xì)胞群包含表達(dá)一種或多種多能性標(biāo)志物的細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，一種或多種多能性標(biāo)志物包含SSEA4、TRA160、TRA181、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD30、CD50、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、Nanog或Sox2。在具體的實(shí)施方案中，多能性標(biāo)志物選自SSEA4、TRA181、TRA160以及CD30。

在具體的實(shí)施方案中，方法包括將混合的細(xì)胞群與一種或多種多能性因子接觸以誘導(dǎo)重新編程。在一些實(shí)施方案中，接觸包括將一種或多種多能性因子引入至混合的細(xì)胞群中的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，多能性因子包含Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog多肽或編碼Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog的多核苷酸。在其他具體的實(shí)施方案中，多能性因子包含Oct4、Sox2及Klf4多肽或編碼Oct4、Sox2及Klf4多肽的多核苷酸。

在某些具體的實(shí)施方案中，多能細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，就表達(dá)一種或多種多能性標(biāo)志物而言，富集的細(xì)胞群豐富了至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、或至少500％。

在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法，包括處理細(xì)胞群以誘導(dǎo)重新編程；制備包含細(xì)胞群的解離的細(xì)胞的懸浮液；分選懸浮液中的細(xì)胞以獲得表達(dá)一種或多種多能性標(biāo)志物的分選細(xì)胞；培養(yǎng)表達(dá)一種或多種多能性標(biāo)志物的分選細(xì)胞，其中獲得iPSC。在具體的實(shí)施方案中，在缺乏細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子，任選地在無飼養(yǎng)層環(huán)境中，并且任選地在可溶性纖連蛋白存在的情況下，培養(yǎng)分選細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群與i)TFGβ抑制劑、ii)GSK3抑制劑、iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑中的至少一種接觸。在具體的實(shí)施方案中，細(xì)胞群與TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑接觸；在某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在其他的實(shí)施方案中，處理細(xì)胞群以誘導(dǎo)重新編程，包括將細(xì)胞群與一種或多種多能性因子接觸。在具體的實(shí)施方案中，多能性因子包含Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog多肽或編碼Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，多能性因子包含Oct4、Sox2及Klf4多肽或編碼Oct4、Sox2及Klf4多肽的多核苷酸。

在其他的實(shí)施方案中，處理細(xì)胞群以誘導(dǎo)重新編程還包括將細(xì)胞群與i)TFGβ抑制劑、ii)GSK3抑制劑、iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑中的至少一種接觸。在具體的實(shí)施方案中，細(xì)胞群與TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑接觸；在某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在其他的實(shí)施方案中，懸浮液包含i)TFGβ抑制劑、ii)GSK3抑制劑、iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑中的至少一種。在具體的實(shí)施方案中，懸浮液包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑；在某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在一些實(shí)施方案中，分選通過流式細(xì)胞術(shù)或磁珠。在具體的實(shí)施方案中，分選細(xì)胞以獲得表達(dá)至少一種、兩種、三種、四種、或多種多能性標(biāo)志物的細(xì)胞。在其他具體的實(shí)施方案中，一種或多種多能性標(biāo)志物包含SSEA4、TRA160、TRA181、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD30、CD50、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、Nanog或Sox2。在其他具體的實(shí)施方案中，一種或多種多能性標(biāo)志物選自SSEA4、TRA160、TRA181以及CD30。在一些實(shí)施方案中，一種或多種多能性標(biāo)志物為SSEA4、CD30以及TRA160或TRA181。在另外的實(shí)施方案中，使用特異的標(biāo)志物分選細(xì)胞以從重新編程的群體中除去非重新編程的細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)包括在包含選自i)TFGβ抑制劑、ii)GSK3抑制劑、iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑的至少一種小分子制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑；在某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在具體的實(shí)施方案中，在無飼養(yǎng)層環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，在無飼養(yǎng)層環(huán)境中處理、懸浮、分選以及培養(yǎng)細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，在約2天-22天中獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，在約4天-約18天中獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。

在其他的實(shí)施方案中，在處理細(xì)胞群以誘導(dǎo)重新編程后約4天-約22天內(nèi)獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，在處理細(xì)胞群以誘導(dǎo)重新編程后約6天-約18天內(nèi)獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，并且在其他某些實(shí)施方案中，在處理細(xì)胞群以誘導(dǎo)重新編程后約10天-約16天內(nèi)獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。

本發(fā)明也提供了在其他的實(shí)施方案中通過任何以上的方法獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了從細(xì)胞群消耗多能細(xì)胞的方法，包括獲得包含具有多能細(xì)胞的混合細(xì)胞群的解離的細(xì)胞的懸浮液，并且分選懸浮液中的細(xì)胞以去除表達(dá)一種或多種多能性標(biāo)志物的細(xì)胞，因此從細(xì)胞群中消耗多能細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，混合的細(xì)胞群包含專能細(xì)胞或(成熟的)體細(xì)胞。

在其他的實(shí)施方案中，獲得懸浮液之前，在包含選自i)TFGβ抑制劑、ii)GSK3抑制劑、iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑的至少一種小分子制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)懸浮液中的混合細(xì)胞群。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑；在某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，懸浮液包含選自i)TFGβ抑制劑、ii)GSK3抑制劑、iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑的至少一種小分子制劑。在具體的實(shí)施方案中，懸浮液包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑；在某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在一些實(shí)施方案中，分選通過流式細(xì)胞術(shù)。在其他的實(shí)施方案中，分選通過抗體包被的磁珠富集。

本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供了獲得具有基因組穩(wěn)定性的多能細(xì)胞的方法，包括在無飼養(yǎng)層環(huán)境中，在缺乏c-myc的情況下，在足以獲得具有基因組穩(wěn)定性的多能細(xì)胞的條件下，將細(xì)胞與選自i)TFGβ抑制劑、ii)GSK3抑制劑、iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑的至少一種小分子制劑接觸。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞、多能細(xì)胞、專能細(xì)胞、非多能細(xì)胞以及體細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方案中，細(xì)胞包含非多能細(xì)胞。

在某些實(shí)施方案中，條件包括細(xì)胞與至少一種多能性因子接觸。在一些實(shí)施方案中，多能性因子為選自O(shè)ct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog多肽或編碼Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog的多核苷酸的外源性轉(zhuǎn)錄因子。在具體的實(shí)施方案中，多能性因子包含Oct4、Sox2以及Klf4多核苷酸。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，小分子制劑包含Rock抑制劑。在具體的實(shí)施方案中，Rock抑制劑為thiazovivin或Y27632，并且在更具體的實(shí)施方案中，Rock抑制劑為thiazovivin。

在其他的實(shí)施方案中，小分子制劑包含TFGβ抑制劑。在一些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為A-83-01或SB431542。

在一些實(shí)施方案中，小分子制劑包含GSK3抑制劑，并且在具體的實(shí)施方案中，GSK3抑制劑為CHIR99021或BIO。

在本發(fā)明其他的實(shí)施方案中，小分子制劑包含MEK抑制劑。在一些具體的實(shí)施方案中，MEK抑制劑為PD98059或PD032901。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，小分子制劑包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑。在具體的實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

本發(fā)明額外地包含培養(yǎng)多能細(xì)胞以保持細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的方法，包括無飼養(yǎng)層環(huán)境中在包含至少一種保持多能細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性的制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能細(xì)胞，同時(shí)保持培養(yǎng)期間多能細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性，其中制劑選自i)TFGβ抑制劑、ii)GSK3抑制劑、iii)MEK抑制劑以及iv)Rock抑制劑。

在某些實(shí)施方案中，條件包括細(xì)胞與至少一種多能性因子接觸。在一些實(shí)施方案中，多能性因子為選自O(shè)ct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog多肽或編碼Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28或Nanog的多核苷酸的外源性轉(zhuǎn)錄因子。在具體的實(shí)施方案中，多能性因子包含Oct4、Sox2以及Klf4多核苷酸。

在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含至少兩種、至少三種、或四種制劑。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，制劑包含Rock抑制劑。在具體的實(shí)施方案中，Rock抑制劑為thiazovivin或Y27632，并且在更具體的實(shí)施方案中，Rock抑制劑為thiazovivin。

在本發(fā)明其他的實(shí)施方案中，制劑包含TFGβ抑制劑。在一些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為A-83-01或SB431542。

在一些實(shí)施方案中，制劑包含GSK3抑制劑，并且在具體的實(shí)施方案中，GSK3抑制劑為CHIR99021或BIO。

在本發(fā)明其他的實(shí)施方案中，制劑包含MEK抑制劑。在一些具體的實(shí)施方案中，MEK抑制劑為PD98059或PD032901。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，制劑包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑。在具體的實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能細(xì)胞至少一次、至少兩次、至少五次、至少十次、或至少15次傳代，同時(shí)保持多能細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性。

附圖簡(jiǎn)要說明

圖1.各種小分子混合物對(duì)無飼養(yǎng)層基質(zhì)上人多能干細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)的影響。A.當(dāng)在無飼養(yǎng)層環(huán)境中用小分子的各種組合處理單細(xì)胞解離的人多能干細(xì)胞時(shí)，不同的形態(tài)是明顯的。包含ROCKi/MEKi/TGFβi/GSKi組合的培養(yǎng)基給予了人多能干細(xì)胞的強(qiáng)健的生長(zhǎng)與活力。B.雖然一些小分子，即MEKi/TGFβi/GSKi支持多能干細(xì)胞的保持，并且其他的即Rocki促進(jìn)多能干細(xì)胞的單細(xì)胞解離，這些小分子的獨(dú)特組合，即ROCKi/MEKi/TGFβi/GSKi，卻支持單細(xì)胞解離同時(shí)保持未分化的狀態(tài)，如對(duì)多能性標(biāo)志物Tra181反應(yīng)陽(yáng)性的高度增生的集落所示。Tra181，紅色；DAPI，藍(lán)色。C.當(dāng)hiPSC以1×10⁵個(gè)細(xì)胞接種于人工基底膜時(shí)，MEKi/TFGβi/GSKi/ROCKi的組合最佳地支持活力與增生并且4天后為活細(xì)胞數(shù)與臺(tái)盼藍(lán)所測(cè)量的活力百分比打分。D.當(dāng)與MEKi/TFGβi/GSKi組合時(shí)，相對(duì)于MEKi/TFGβi/GSKi與Y27632所支持的培養(yǎng)，用Thiazovivin培養(yǎng)的集落在形態(tài)上顯得更緊密。E.Y27632或Thiazovivin與MEKi/TFGβi/GSKi組合中所培養(yǎng)的hiPSC的SSEA4與Tra181的表面表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與具有Y27632的組合相比，Thiazovivin更好地支持細(xì)胞保持在未分化的狀態(tài)。

圖2.人多能干細(xì)胞適應(yīng)于無飼養(yǎng)層與單細(xì)胞培養(yǎng)。A.飼養(yǎng)層細(xì)胞上所產(chǎn)生的iPSC易于適應(yīng)利用SMC4培養(yǎng)基的無飼養(yǎng)層與單細(xì)胞培養(yǎng)條件。然而，在常規(guī)培養(yǎng)條件下單細(xì)胞解離與培養(yǎng)可見擾亂細(xì)胞生存以及有限的細(xì)胞粘附與生長(zhǎng)。B.一旦適應(yīng)無飼養(yǎng)層環(huán)境，iPSC就作為單細(xì)胞在無飼養(yǎng)層表面進(jìn)行常規(guī)地培養(yǎng)，同時(shí)持續(xù)保持在SMC4培養(yǎng)基中。

圖3.單細(xì)胞的長(zhǎng)期保持與無飼養(yǎng)層人多能干細(xì)胞培養(yǎng)。A.單細(xì)胞解離的人多能干細(xì)胞保持在無飼養(yǎng)層SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)10次傳代，通過免疫熒光分析表達(dá)多能性標(biāo)志物Nanog與Tra181。B.圖3B顯示了人多能干細(xì)胞被解離為單細(xì)胞并且置于常規(guī)地培養(yǎng)基或SMC4培養(yǎng)基中后4小時(shí)，7氨基放線菌素D(7AAD)染色細(xì)胞的百分比。當(dāng)培養(yǎng)于SMC4培養(yǎng)基而不是常規(guī)的培養(yǎng)基中時(shí)，單細(xì)胞解離的人多能干細(xì)胞顯示了顯著增加的活力，如通過7AAD染色與流式細(xì)胞術(shù)分析所見到的。C.通過流式細(xì)胞術(shù)的定量群體分析揭示幾乎所有的細(xì)胞解離為單細(xì)胞并且保持在SMC4培養(yǎng)基中表達(dá)多種未分化的狀態(tài)的標(biāo)志物。D.總體表達(dá)分析揭示作為單細(xì)胞傳代并且保持在無飼養(yǎng)層細(xì)胞的SMC4培養(yǎng)基中的iPSC，與培養(yǎng)在飼養(yǎng)層細(xì)胞上的并且傳代期間保持為細(xì)胞團(tuán)塊的人ESC，包括H1細(xì)胞，高度相關(guān)。E.使用SMC4培養(yǎng)基培養(yǎng)于無飼養(yǎng)層細(xì)胞系統(tǒng)中并且作為單細(xì)胞傳代的iPSC，而不是它們的原始來源成纖維細(xì)胞，表達(dá)多能性標(biāo)志物陣列，與人ESC相似，包括H1與HuES9。F.保持在無飼養(yǎng)層環(huán)境中的iPSC重新編程因子的外源性表達(dá)被有效地抑制，不同于外源性因子陽(yáng)性對(duì)照(慢病毒感染4天后表達(dá)重新編程因子的成纖維細(xì)胞)。重新編程因子在無飼養(yǎng)層iPSC中的內(nèi)源性表達(dá)與ESC相似，包括H1與HuES9。G.在無飼養(yǎng)層環(huán)境中作為單細(xì)胞11次傳代后，人多能干細(xì)胞保持正常的核型。H.用常規(guī)分化的培養(yǎng)基替換SMC4培養(yǎng)基14天后，保持在無飼養(yǎng)層環(huán)境中的細(xì)胞顯示了指示除了胚外的標(biāo)志物之外，外胚層、內(nèi)胚層以及中胚層胚層的基因表達(dá)，其通常只由原初的與全能干細(xì)胞表達(dá)。I.免疫熒光分析：使用SMC4培養(yǎng)基培養(yǎng)于無飼養(yǎng)層細(xì)胞系統(tǒng)中并且作為單細(xì)胞傳代的iPSC，一旦轉(zhuǎn)移到常規(guī)的分化培養(yǎng)基上，易于發(fā)育成為所有三種體細(xì)胞類型。中胚層，α平滑肌肌動(dòng)蛋白(αSMA)；外胚層，β微管蛋白III(βTUBIII)；內(nèi)胚層，Sox17。J.畸胎瘤形成分析證明SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞產(chǎn)生代表三種胚層的細(xì)胞類型，并且因此保持它們的多能潛力。

圖4.增強(qiáng)的單細(xì)胞分選與人多能干細(xì)胞隨后的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)?；诙嗄苄詷?biāo)志物表達(dá)的人多能干細(xì)胞的分選的演示以及隨后在添加了優(yōu)化SMC4培養(yǎng)基或SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)中保持分選細(xì)胞。A.分選前，人多能干細(xì)胞解離成為單細(xì)胞并且用抗體標(biāo)志物標(biāo)注至SSEA4與Tra-181。使用FACs技術(shù)，基于多能性標(biāo)志物的表面標(biāo)志物表達(dá)，SSEA4與Tra-181分選細(xì)胞。分選后最初將細(xì)胞接種于SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基，24-72小時(shí)后變換為SMC4培養(yǎng)基。分選后第1天，將分選的細(xì)胞分開并且到第5天，出現(xiàn)由數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的大的集落。B.分選的細(xì)胞保留它們的多能性標(biāo)志物Tra160的表達(dá)。Tra160，紅色；DAPI，藍(lán)色。C.5次傳代后，分選前，培養(yǎng)中大約1個(gè)月，基于SSEA4與Tra181染色，定量流式細(xì)胞術(shù)分析揭示大多數(shù)分選的細(xì)胞仍保留它們的多能狀態(tài)。D.來源于SSEA4+與Tra181+人多能干細(xì)胞的各種密度在添加了SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基的無飼養(yǎng)層表面涂板，包括6孔平板每孔500個(gè)事件的集落密度，大約52個(gè)事件/cm²。分選后7天后，許多堿性磷酸酶陽(yáng)性集落出現(xiàn)在每個(gè)接種孔中。E.計(jì)分所產(chǎn)生的堿性磷酸酶陽(yáng)性集落。大約8-10％的接種事件產(chǎn)生每孔16000個(gè)事件的集落，產(chǎn)生了幾乎融合的孔。由于融合阻止了精確的計(jì)數(shù)不計(jì)算N.C.。F.將SSEA4+與Tra181+人多能干細(xì)胞以各種密度直接分選至96孔平板，包括1個(gè)事件/孔，大約3個(gè)事件/cm²。分選后8天，用堿性磷酸酶將孔染色。G.在第8天計(jì)分每個(gè)孔堿性磷酸酶集落。

圖5.在SMC4培養(yǎng)基缺乏與存在的情況下的重新編程動(dòng)力學(xué)。A.通過Oct4、Sox2、Klf4以及cMyc異位表達(dá)重新編程啟動(dòng)后7天，或?qū)⒓?xì)胞保持在常規(guī)的培養(yǎng)基中或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)移至SMC4培養(yǎng)基。重新編程20天后，常規(guī)的培養(yǎng)基培養(yǎng)中很少有任何類似iPSC集落形成，然而轉(zhuǎn)移至SMC4培養(yǎng)基的細(xì)胞中出現(xiàn)了許多類似iPSC集落。B.SMC4培養(yǎng)基中許多類似iPSC集落表達(dá)堿性磷酸酶而常規(guī)培養(yǎng)中很少集落表達(dá)堿性磷酸酶。

圖6.在SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)提高了原初特征。A.人多能干細(xì)胞適應(yīng)SMC4培養(yǎng)基的示意圖以及它與常規(guī)保持的人多能干細(xì)胞的比較。B.基于Affymetrix總體基因表達(dá)的分級(jí)群聚與各自培養(yǎng)基中都培養(yǎng)了11次傳代，IMR90親代細(xì)胞衍生的hiPSC(常規(guī)衍生的hiPSC(Conv)與SMC4培養(yǎng)基適應(yīng)的hiPSC(SMC4培養(yǎng)基))間Pearson相關(guān)系數(shù)，都證明hiPSC彼此相似并且不同于它們的親代IMR90細(xì)胞。C.雖然常規(guī)格式中培養(yǎng)的hiPSC與它們的親代IMR90細(xì)胞系相比，Xist表達(dá)被中度抑制，而SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hiPSC中Xist表達(dá)被顯著地抑制，與雌性的hESC、HUES9水平相似。D.位于X染色體的基因在SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hiPSC中表達(dá)程度更高，與常規(guī)培養(yǎng)的hiPSC中表達(dá)相比。E.當(dāng)轉(zhuǎn)移回到飼養(yǎng)層細(xì)胞時(shí)，保持在SMC4培養(yǎng)基中的hiPSC顯示了更類似于小鼠ESC的形態(tài)，如通過與常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hiPSC相比可見到更多的三維形狀與更少的平面形態(tài)。

圖7.SMC4培養(yǎng)基中產(chǎn)生與保持改善了人多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)。A.FTi91與93克隆平行產(chǎn)生的示意圖，在SMC4培養(yǎng)基中產(chǎn)生并且保持在SMC4培養(yǎng)基FF培養(yǎng)中，以及FTi99克隆，在常規(guī)培養(yǎng)基中產(chǎn)生并且保持在飼養(yǎng)層細(xì)胞上。B.基于Affymetrix總體基因表達(dá)的分級(jí)群聚與Pearson相關(guān)系數(shù)描述了衍生的多能系間密切的關(guān)系以及與起始細(xì)胞系(FTC1)關(guān)系遙遠(yuǎn)。C.基于Hues9、H1、FTi99、FTi91以及FTi93間所有4倍差異表達(dá)的基因的分級(jí)群聚證明了常規(guī)系統(tǒng)中培養(yǎng)的多能系與SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)的那些多能系之間的分離。D.SMC4培養(yǎng)基組(FTi91與93)與常規(guī)培養(yǎng)組(H1、Hues9以及FTi99)相比，與原初與譜系分化有關(guān)的選擇基因的Affymetrix基因表達(dá)顯示增加了許多與多能性有關(guān)的基因表達(dá)并且顯著減少了SMC4培養(yǎng)基集中譜系特異的基因表達(dá)。E.各種獲得原初狀態(tài)的hiPSC方法的示意圖。紫色的圖層描述了原初狀態(tài)超越成熟狀態(tài)的優(yōu)勢(shì)。

圖8.重新編程過程期間產(chǎn)生的非iPSC集落。A.重新編程過程早期典型的細(xì)胞群：免疫染色顯示大多數(shù)快速生長(zhǎng)的細(xì)胞形成SSEA4陰性并且不可避免地非多能細(xì)胞的集落。這些細(xì)胞為轉(zhuǎn)化的，高度增生的，生長(zhǎng)迅速的并且在培養(yǎng)中占主導(dǎo)地位。集落1顯示SSEA4陽(yáng)性集落有變成iPSC集落的潛能而集落2顯示了具有高增生率但是多能性標(biāo)志物染色陰性的轉(zhuǎn)化群。B.許多非iPSC集落顯示了單一多能性標(biāo)志物的表達(dá)，而真正的iPSC集落顯示了多重多能性標(biāo)志物的表達(dá)。重新編程的后一階段，形成各種集落，一些集落SSEA4與Tra181雙陽(yáng)性，即集落1，而其他的集落只有標(biāo)志物的其中之一為陽(yáng)性或一點(diǎn)都沒有，例如集落4與5。

圖9.使用細(xì)胞分選多能細(xì)胞的選擇諸如iPSC。單細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)與用于從多能與非多能細(xì)胞的混合物中富集并且選擇的細(xì)胞分選方法的示意圖顯示。

圖10.多能性標(biāo)志物的鑒定。為研究對(duì)SSEA4⁺/Tra181⁺細(xì)胞特異的額外的標(biāo)志物，評(píng)估各種表面標(biāo)志物。Tra160表達(dá)的檢測(cè)用作陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)它與Tra181表達(dá)很好地關(guān)聯(lián)。CD200與CD90似乎沒有針對(duì)多能細(xì)胞特異，因?yàn)樗鼈兿嗨频厝旧玈SEA^-/Tra181^-與SSEA⁺/Tra181⁺群，而沒有見到CD9針對(duì)SSEA⁺/Tra181⁺群特異性、然而，CD50與CD30似乎越過SSEA^-/Tra181^-群優(yōu)選地鑒定SSEA4⁺/Tra181⁺群。

圖11.CD30對(duì)Nanog表達(dá)基因具有特異性。A.各種hiPSC系的SSEA4/Tra181表達(dá)的代表性流型證明所有衍生的克隆代表大多數(shù)表達(dá)SSEA4與Tra181的群。B.基于(A)中所見的門控，評(píng)估每一細(xì)胞系的CD30與CD9流型。只有克隆FTC8克隆1與FTi31似乎表達(dá)CD30而所有的克隆都表達(dá)CD9。C.也評(píng)估各譜系的相對(duì)Nanog表達(dá)。D.匯總表證明只有CD30表達(dá)與Nanog表達(dá)相關(guān)。

圖12.重新編程期間去除非重新編程的細(xì)胞使重新編程的細(xì)胞富集。重新編程過程期間，存在重新編程與非重新編程的細(xì)胞的混合群，只有較少的細(xì)胞群代表重新編程為完整多能性的細(xì)胞，如通過SSEA4與Tra181表達(dá)所示(通過黑色虛線箭頭所示)。然而，當(dāng)將非重新編程的細(xì)胞從混合群中移除或去除時(shí)，顯示了SSEA4與Tra181陽(yáng)性群的顯著富集。如灰色實(shí)線箭頭所示，CD13陰性細(xì)胞群代表SSEA4與Tra181陽(yáng)性細(xì)胞超過CD13低與高群體細(xì)胞的顯著富集。

圖13.通過單細(xì)胞分選增強(qiáng)細(xì)胞重新編程并且從包括IMR90與ASC的各種群中富集多能干細(xì)胞。A.通過SSEA4+細(xì)胞的單細(xì)胞分選富集重新編程過程早期的細(xì)胞群。細(xì)胞的起始群，包含重新編程的與非重新編程的細(xì)胞，被酶促解離成單細(xì)胞，獨(dú)特的多能性標(biāo)志物染色，以及基于表面標(biāo)志物表達(dá)通過免疫連接的磁珠分選以獲得對(duì)SSEA4陽(yáng)性的細(xì)胞群。這一SSEA4+細(xì)胞富集后，將10000個(gè)SSEA4+細(xì)胞接種于Matrigel^TM包被的皿并且在FF環(huán)境常規(guī)的培養(yǎng)基或SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分選后8天進(jìn)行AP染色。這些右邊角落中較小的插入圖層為代表性細(xì)胞形態(tài)的圖像。沒有在常規(guī)培養(yǎng)中檢測(cè)到堿性磷酸酶陽(yáng)性的集落而許多堿性磷酸酶陽(yáng)性的集落衍生于SMC4培養(yǎng)基。B.計(jì)分衍生于SMC4培養(yǎng)基存在或缺乏的情況下Matrigel^TM上細(xì)胞的重新編程的SSEA4⁺/Tra181⁺集落的量。C.無飼養(yǎng)層條件下衍生于IMR90成纖維細(xì)胞或脂肪干細(xì)胞的iPSC克隆與使用重新編程與SMC4培養(yǎng)基的單細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)多能性標(biāo)志物。D.使用單細(xì)胞分選方法衍生iPSC克隆的全群體流式細(xì)胞術(shù)分析揭示大多數(shù)細(xì)胞對(duì)關(guān)鍵的多能性標(biāo)志物為陽(yáng)性的。E.使用單細(xì)胞分選SSEA4與無飼養(yǎng)層培養(yǎng)而不是它們?cè)荚闯衫w維細(xì)胞或脂肪干細(xì)胞所產(chǎn)生的iPSC表達(dá)多能性標(biāo)志物的陣列，與人ESC相似，包括H1與HuES9。F.重新編程因子的外源性表達(dá)在使用單細(xì)胞分選與無飼養(yǎng)層培養(yǎng)所產(chǎn)生的iPSC中有效地沉默，不同于被慢病毒感染3天后表達(dá)重新編程因子的對(duì)照的成纖維細(xì)胞。G.使用基于SSEA4單細(xì)胞分選所產(chǎn)生的iPSC一旦分化易于發(fā)育為所有三種體細(xì)胞類型。內(nèi)胚層，F(xiàn)oxA2；中胚層，α平滑肌肌動(dòng)蛋白(αSMA)；外胚層，β微管蛋白III(βTUB III)。

圖14.用于獨(dú)特的多能干細(xì)胞群的選擇的單細(xì)胞分選。A.使用FACS分選，選擇重新編程過程早期為SSEA4⁺/Tra181⁺的獨(dú)特稀少的細(xì)胞群并且轉(zhuǎn)移到添加了SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基，24-72小時(shí)后變換為SMC4培養(yǎng)基的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)。培養(yǎng)另外6天后，SSEA4⁺/Tra181⁺衍生的iPSC集落似乎在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)中生長(zhǎng)。然而，當(dāng)SSEA4-/Tra181-集落被轉(zhuǎn)移并且保持在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)中時(shí)，培養(yǎng)14天后檢測(cè)不到表達(dá)堿性磷酸酶的集落。B.各種SSEA4⁺/Tra181⁺分選的細(xì)胞發(fā)育為集落同時(shí)保持它們的SSEA4與Tra181表達(dá)。

圖15.高通量產(chǎn)生方法與無飼養(yǎng)層條件下iPSC的主要特征。使用SMC4培養(yǎng)基(當(dāng)分選時(shí)使用SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基)，以兩步驟的方式分選三種因子(Oct、Sox、Klf)誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞以送遞有效的96孔平板平臺(tái)。標(biāo)記包含個(gè)體集落的孔并且擴(kuò)展到4×96孔平板。當(dāng)一組被設(shè)計(jì)為主平板并且擴(kuò)增時(shí)，處理其他三個(gè)平板以表征，包括用于包括SSEA4與Tra181的表面標(biāo)志物表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析，用于包括Nanog的關(guān)鍵標(biāo)志物表達(dá)的qRT PCR，轉(zhuǎn)基因沉默以及用于包括Oct4與Nanog多能性標(biāo)志物的免疫熒光?；谔卣髻Y料解析，擴(kuò)增堆積選擇的hiPSC克隆以用于進(jìn)一步的分析。數(shù)據(jù)圖層代表FTC5的hiPSC產(chǎn)生高通量平臺(tái)期間所研究的克隆的快照(通過96孔平板的31-40孔所標(biāo)記)。qPCR圖層中，將表達(dá)標(biāo)化為Gapdh。Nanog表達(dá)與H1hESC有關(guān)而轉(zhuǎn)基因表達(dá)與FTC5感染后第4天有關(guān)(第4天感染)?；谔卣髻Y料解析，擴(kuò)增堆積選擇的hiPSC克隆以用于進(jìn)一步的分析。在突出的實(shí)例中，基于它的多參數(shù)多能性分布圖鑒定37孔作為擴(kuò)增候選并且稱為FTC5克隆1。以5×放大率取得免疫熒光圖像。

圖16.SMC4存在的情況下，3-因子(多順反子性的-OKS)hiPSC的高通量平臺(tái)，克隆的以及FF衍生。A.染色衍生于以上策略的FTi91與FTi93用于多能性標(biāo)志物的表達(dá)。B.針對(duì)FTC1(包皮成纖維細(xì)胞),H1與Hues9(hESC系),FTi 91與93(FTCI衍生的hiPSC克隆)以及第4天P.I.(感染后第4天)的多能性標(biāo)志物的外源性表達(dá)的qRT-PCR。表達(dá)標(biāo)化為Gapdh以及每一基因組內(nèi)相關(guān)性。C.Oct4啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。開環(huán)代表未甲基化的CpG島而黑圈代表甲基化的CpG島。D.分化28天后FTi91與93克隆的EB形成與分化。內(nèi)胚層，F(xiàn)oxA2；中胚層，α平滑肌肌動(dòng)蛋白(αSMA)；外胚層，Tuj1。E.衍生于FF培養(yǎng)與SMC4中所產(chǎn)生并且保持的hiPSC克隆的畸胎瘤的組織切片。黑箭頭指向感興趣的區(qū)域：中胚層，白色脂肪組織；外胚層，神經(jīng)元；內(nèi)胚層，腺體。

圖17.重新編程中多能干細(xì)胞的產(chǎn)生與保持與SMC4培養(yǎng)基保持基因組完整性并且能夠富集多能細(xì)胞。A.如通過陣列比較基因組雜交所評(píng)估的拷貝數(shù)變異。底表為數(shù)據(jù)的解釋匯總，展示了SMC4培養(yǎng)基培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞與它們親代的細(xì)胞系間最小的拷貝數(shù)變異。B.G帶中期細(xì)胞的細(xì)胞遺傳學(xué)分析。底表為數(shù)據(jù)的解釋匯總，描述了SMC4培養(yǎng)基中長(zhǎng)期無飼養(yǎng)層培養(yǎng)后基因組的穩(wěn)定性。

圖18.FF與SMC4培養(yǎng)下FTC5與FTC7衍生的克隆的hiPSC的特征。為檢測(cè)高通量平臺(tái)的重復(fù)性，測(cè)試額外的患者同意的FTC5與FTC7以用于hiPSC產(chǎn)生。A.多能性標(biāo)志物Oct4、Tra181、Nanog以及Tra160代表的免疫熒光染色，其表達(dá)于OKS誘導(dǎo)的并且使用多重平臺(tái)所產(chǎn)生的個(gè)體的FTC5與FTC7衍生的hiPSC克隆。B.誘導(dǎo)分化后28天hiPSC衍生的FTC5與FTC7的代表的譜系特異的染色。內(nèi)胚層，F(xiàn)oxA2；中胚層，α平滑肌肌動(dòng)蛋白(αSMA)；外胚層，Tuj1。C.來源于各種傳代中長(zhǎng)期FF與單細(xì)胞培養(yǎng)后FTC5與FTC7衍生的hiPSC克隆的G帶中期細(xì)胞的細(xì)胞遺傳學(xué)分析。

圖19.使用細(xì)胞表面標(biāo)志物保持多能培養(yǎng)的方法。A.如通過無飼養(yǎng)層與SMC4平臺(tái)中Tra181富集所示的，培養(yǎng)期間進(jìn)一步富集多能干細(xì)胞群。B.多能細(xì)胞群培養(yǎng)期間，群內(nèi)一定比例的細(xì)胞可開始分化并且失去它們的多能性。使用用于多能性的選擇方法，即，Tra181富集，獲得未分化細(xì)胞的同種培養(yǎng)。

圖20.從非、部分以及完全多能的干細(xì)胞的異源群體分離分化的細(xì)胞。重新編程的人成纖維細(xì)胞群的FACS分選：當(dāng)分選對(duì)多能性標(biāo)志物SSEA4-/Tra181-雙陰性的細(xì)胞(藍(lán)色框；左下部框)時(shí)，沒有檢測(cè)到堿性磷酸酶(AP)陽(yáng)性的集落，表明培養(yǎng)一周后失去了多能性與潛在的致癌性，反之SSEA4+/Tra181+雙陽(yáng)性群體的分選(桔色框，右上部框)導(dǎo)致了多能細(xì)胞的選擇與富集，如通過AP+集落形成所證明的。

圖21.無飼養(yǎng)層培養(yǎng)上人多能干細(xì)胞的無細(xì)胞因子培養(yǎng)。A.當(dāng)在缺乏包括bFGF的任何細(xì)胞因子的情況下，培養(yǎng)于明膠包被的表面并且添加了SMC4培養(yǎng)基時(shí)，人多能干細(xì)胞保持它們的生長(zhǎng)與形態(tài)。B.放大的圖像描述了人多能干細(xì)胞集落內(nèi)個(gè)體的細(xì)胞。C.在傳代第3次SSEA4與Tra181的共表達(dá)進(jìn)一步地證明了無細(xì)胞因子培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞保持它們的未分化狀態(tài)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了強(qiáng)力的用于培養(yǎng)干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，包括用于產(chǎn)生及培養(yǎng)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)的無飼養(yǎng)層條件。具體地，本發(fā)明提供了培養(yǎng)平臺(tái)，其允許多能細(xì)胞在無飼養(yǎng)層環(huán)境中長(zhǎng)期培養(yǎng)；細(xì)胞在無飼養(yǎng)層環(huán)境中重新編程；多能細(xì)胞的單細(xì)胞解離；多能細(xì)胞的細(xì)胞分選；提高重新編程效率；原初多能細(xì)胞的產(chǎn)生；以及用于多能細(xì)胞鑒定與選擇的標(biāo)志物鑒定。本發(fā)明的培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法支持單細(xì)胞解離的人干細(xì)胞的活力與存活，并且保持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)以允許沒有分化的解離的單細(xì)胞培養(yǎng)與傳代。

定義

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“重新編程”或“去分化”或“增加細(xì)胞潛能”或“提高發(fā)育能力”指增加細(xì)胞潛能或使細(xì)胞去分化為分化程度較低狀態(tài)的方法。例如，具有增加的細(xì)胞潛能的細(xì)胞，與非重新編程的狀態(tài)中相同的細(xì)胞相比，具有更大的發(fā)育可塑性(即能夠分化為更多的細(xì)胞類型)。換句話說，重新編程的細(xì)胞為比非重新編程狀態(tài)中相同的細(xì)胞分化程度更低的細(xì)胞。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“潛能”指所有可得到細(xì)胞的發(fā)育選擇(即發(fā)育能力)的總數(shù)。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)理解細(xì)胞潛能為連續(xù)體，范圍自具有最大的發(fā)育能力的最可塑的細(xì)胞，全能干細(xì)胞至具有最小的發(fā)育能力的最不可塑的細(xì)胞，終末分化細(xì)胞。細(xì)胞潛能的連續(xù)體包括，但不限于，全能細(xì)胞、多能細(xì)胞、專能細(xì)胞、寡能細(xì)胞、單能細(xì)胞以及終末分化細(xì)胞。在嚴(yán)格意義上，干細(xì)胞為多能的；因此能夠產(chǎn)生任何成熟的細(xì)胞類型。然而，專能細(xì)胞、寡能細(xì)胞或單能的祖細(xì)胞有時(shí)候被稱為譜系限制性干細(xì)胞(例如間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪組織衍生的干細(xì)胞等)和/或祖細(xì)胞。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“多能的”指細(xì)胞形成所有機(jī)體或體細(xì)胞(即胚體)的譜系的能力。例如，胚胎干細(xì)胞為一種類型的多能干細(xì)胞，其能夠形成來源于三種胚層，外胚層、中胚層以及內(nèi)胚層的每一種的細(xì)胞。多能性為發(fā)育能力的連續(xù)體，范圍自不能產(chǎn)生完整的有機(jī)體的不完全地或部分地多能細(xì)胞(例如外胚層干細(xì)胞或EpiSC)至能夠產(chǎn)生完整的有機(jī)體的更原始的、更多能的細(xì)胞(例如胚胎干細(xì)胞)。通過評(píng)估細(xì)胞的多能性特征可以確定細(xì)胞多能性的水平。多能性特征包括，但不限于i)多能干細(xì)胞形態(tài)；ii)多能干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，其包括但不限于SSEA1(只有小鼠),SSEA3/4；TRA1-60/81；TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、Nanog和/或Sox2以及如本發(fā)明所述的CD30與CD50；iii)小鼠多能干細(xì)胞促進(jìn)小鼠嵌合體中種系傳遞的能力；iv)使用四倍體補(bǔ)償測(cè)定多能干細(xì)胞對(duì)胚體貢獻(xiàn)的能力；v)多能干細(xì)胞的畸胎瘤形成；vi)胚體的形成；以及vii)失活的X染色體重新激活。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“多能干細(xì)胞形態(tài)”指胚胎干細(xì)胞經(jīng)典的形態(tài)特征。通過形狀圓而小，高的核質(zhì)比，核仁的顯著存在，以及典型的細(xì)胞間間距表征正常的胚胎干細(xì)胞形態(tài)。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“專能的”指成體干細(xì)胞形成一個(gè)譜系多重細(xì)胞類型的能力。例如，造血干細(xì)胞能夠形成血細(xì)胞譜系的所有細(xì)胞，例如，淋巴細(xì)胞與骨髓細(xì)胞。

“粘附”指細(xì)胞依附于器皿，例如，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基存在的情況下，細(xì)胞依附于無菌塑料的(包被塑料的)細(xì)胞培養(yǎng)皿或燒瓶。某些細(xì)胞種類在培養(yǎng)中不能持續(xù)或不能生長(zhǎng)，除非它們粘附在細(xì)胞培養(yǎng)皿上。某些細(xì)胞種類(“非粘附細(xì)胞”)不需要粘附而在培養(yǎng)中保持和/或增殖。

“培養(yǎng)”或“細(xì)胞培養(yǎng)”指在體外環(huán)境中細(xì)胞的保持、生長(zhǎng)和/或分化?！凹?xì)胞培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)基”(在每種情況下單數(shù)的“培養(yǎng)基”)、“添加”以及“培養(yǎng)基添加”指培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)組分。

“培養(yǎng)”指組織以外或體外，例如在無菌塑料的(或包被塑料的)細(xì)胞培養(yǎng)皿或燒瓶中，細(xì)胞的保持、增殖(生長(zhǎng))和/或分化?！芭囵B(yǎng)法”可利用培養(yǎng)基作為營(yíng)養(yǎng)素、激素和/或其他有助于增殖和/或保持細(xì)胞的因子的來源。

如本文所用的，“解離的”細(xì)胞指從其他的細(xì)胞或從表面(例如培養(yǎng)皿表面)基本上分離或純化掉的細(xì)胞。例如，細(xì)胞能夠通過機(jī)械的或酶促的方法從動(dòng)物或組織分離?？蛇x地，在體外聚集的細(xì)胞能夠彼此分離，諸如通過酶促地或機(jī)械地解離成為群集、單細(xì)胞或單細(xì)胞與群集混合的懸浮液。仍然在其他可選的實(shí)施方案中，粘附細(xì)胞從培養(yǎng)皿或其他的表面分離。因此解離可以包括破壞細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)以及基質(zhì)(例如培養(yǎng)表面)的相互作用或破壞細(xì)胞間ECM。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“富集”與“使……富集”指增加組合物中特異組分的量，諸如細(xì)胞組分，并且當(dāng)用于描述細(xì)胞組合物諸如細(xì)胞群時(shí)，“富集的”指具有與富集前細(xì)胞群中此類組分的比例，特異組分的量成比例地增加的細(xì)胞群。例如，對(duì)靶細(xì)胞類型(即具有特異特征的細(xì)胞)而言，富集諸如細(xì)胞群的組合物，因此與富集前存在于細(xì)胞群中的靶細(xì)胞的比例相比，具有靶細(xì)胞類型的比例或百分比增加。可通過本領(lǐng)域中已知的細(xì)胞選擇與分選方法針對(duì)靶細(xì)胞類型進(jìn)行細(xì)胞群富集。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過本文實(shí)施例中所述的分選或選擇過程富集細(xì)胞群。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，針對(duì)靶細(xì)胞群富集的方法，對(duì)靶細(xì)胞群而言細(xì)胞群富集了至少大約20％，意指富集的細(xì)胞群包含比群體富集前群體中的靶細(xì)胞類型成比例地多大約20％的靶細(xì)胞類型。在一實(shí)施方案中，針對(duì)靶細(xì)胞群富集的方法，對(duì)靶細(xì)胞群而言，細(xì)胞群富集了至少大約30+％、40+％、50+％、60+％、70+％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％、或至少大約98％或在具體的實(shí)施方案中，大約99％。

在本發(fā)明的某些方面，對(duì)多能細(xì)胞的量或細(xì)胞展示的多能性特征而言，富集細(xì)胞群。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，針對(duì)具有諸如多能性標(biāo)志物表達(dá)的多能性特征的靶細(xì)胞，富集進(jìn)行重新編程的細(xì)胞群，多能性標(biāo)志物包括但不限于SSEA4、TRA 1-60、TRA-1-81、CD30或CD50。在本發(fā)明其他具體的實(shí)施方案中，使用對(duì)分化或非多能細(xì)胞特異的表面標(biāo)志物消耗細(xì)胞群，諸如進(jìn)行重新編程的細(xì)胞群中的非多能細(xì)胞，例如對(duì)分化或非多能細(xì)胞特異的表面標(biāo)志物其包括CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46或CD7。因此，所得到的細(xì)胞群被描述為針對(duì)多能細(xì)胞富集的細(xì)胞群。在本發(fā)明的某些方面，針對(duì)靶細(xì)胞富集的富集細(xì)胞群中的細(xì)胞具有獨(dú)特的基因或蛋白表達(dá)譜，例如，至少兩種諸如SSEA4、TRA 1-60、TRA-1-81、CD30以及CD50的多能性標(biāo)志物的細(xì)胞表面表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)表達(dá)兩種或多種多能性標(biāo)志物的靶細(xì)胞富集細(xì)胞群。在具體的實(shí)施方案中，針對(duì)表達(dá)SSEA4與Tra181或Tra160組合的靶細(xì)胞富集細(xì)胞群。在更具體的實(shí)施方案中，針對(duì)表達(dá)SSEA4、Tra181以及CD30的靶細(xì)胞富集細(xì)胞群。在一實(shí)施方案中，富集細(xì)胞群中至少大約5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、98％或99％的細(xì)胞為靶細(xì)胞類型，諸如多能細(xì)胞。

因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了針對(duì)多能細(xì)胞富集細(xì)胞群的方法，通過基于多能性標(biāo)志物的細(xì)胞表面表達(dá)，諸如SSEA4、TRA 1-60、TRA-1-81、CD30以及CD50，分選細(xì)胞群并且收集表達(dá)此類標(biāo)志物的細(xì)胞以獲得針對(duì)多能細(xì)胞富集的細(xì)胞群。在本發(fā)明其他的實(shí)施方案中，針對(duì)多能細(xì)胞富集細(xì)胞群，通過基于分化或分化細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞表面表達(dá)，諸如CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46以及CD7，分選細(xì)胞群并且消耗此類細(xì)胞的細(xì)胞群以獲得針對(duì)多能細(xì)胞富集的細(xì)胞群。在具體的實(shí)施方案中，基于CD13的表達(dá)分選細(xì)胞群，并且將CD13+細(xì)胞從細(xì)胞群移除以獲得針對(duì)多能細(xì)胞富集的細(xì)胞群。

如本文所用的，“飼養(yǎng)層細(xì)胞”或“飼養(yǎng)層”為用于描述一種類型的細(xì)胞與第二種類型的細(xì)胞共培養(yǎng)以提供第二種類型的細(xì)胞可以在其中生長(zhǎng)的環(huán)境的術(shù)語(yǔ)，因?yàn)轱曫B(yǎng)層細(xì)胞為第二種細(xì)胞類型的支持提供了生長(zhǎng)因子與營(yíng)養(yǎng)素。隨著它們支持的細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞任選地來源于不同的種類。例如，某些人細(xì)胞類型，包括干細(xì)胞，可以由小鼠胚胎成纖維細(xì)胞與永生化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)支持。與其他的細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，飼養(yǎng)層細(xì)胞通常為滅活的，通過輻射或用諸如絲裂霉素C的抗有絲解離劑處理以防止它們過大而不適于它們支持的細(xì)胞。不限制前述事項(xiàng)，特異的飼養(yǎng)層細(xì)胞類型可為人飼養(yǎng)層細(xì)胞，諸如人皮膚成纖維細(xì)胞或人胚胎干細(xì)胞。另一種飼養(yǎng)層細(xì)胞類型可為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mEF)。

如本文所用的，“無飼養(yǎng)層”(FF)環(huán)境指諸如細(xì)胞培養(yǎng)或培養(yǎng)基基本上無飼養(yǎng)層細(xì)胞的環(huán)境并且不受飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)的預(yù)調(diào)節(jié)。“預(yù)調(diào)節(jié)”培養(yǎng)基指飼養(yǎng)層細(xì)胞已在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)一段時(shí)間，諸如至少一天后收獲的培養(yǎng)基。預(yù)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基包含許多中介物質(zhì)，諸如培養(yǎng)基中培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞所分泌的生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，無飼養(yǎng)層環(huán)境基本上沒有人飼養(yǎng)層細(xì)胞并且在具體的實(shí)施方案中，額外地不受飼養(yǎng)層細(xì)胞預(yù)調(diào)節(jié)，人飼養(yǎng)層細(xì)胞包括但不限于人成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，無飼養(yǎng)層環(huán)境基本上沒有動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞，并且進(jìn)一步地，在具體的實(shí)施方案中，不受飼養(yǎng)層細(xì)胞預(yù)調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，無飼養(yǎng)層環(huán)境基本上沒有人與動(dòng)物的飼養(yǎng)層細(xì)胞并且不受飼養(yǎng)層細(xì)胞預(yù)調(diào)節(jié)。

基因組穩(wěn)定性指細(xì)胞忠實(shí)地復(fù)制DNA并且保持DNA復(fù)制過程完整性的能力。如本文所用于描述本發(fā)明細(xì)胞的，“基因組穩(wěn)定的細(xì)胞”與“具有基因組穩(wěn)定性的細(xì)胞”指顯示突變與染色體畸變(諸如易位、非整倍性、拷貝數(shù)變異以及重復(fù))頻率的細(xì)胞，其頻率與正常人體細(xì)胞的突變與染色體畸變頻率基本上相似。

“成分”指可用于細(xì)胞培養(yǎng)基以保持和/或促進(jìn)生長(zhǎng)和/或細(xì)胞分化的任何化合物或其他的材料，無論是化學(xué)起源的還是生物起源的。術(shù)語(yǔ)“組分”“營(yíng)養(yǎng)素”以及“成分”可互換地使用。細(xì)胞培養(yǎng)基所用的常規(guī)的成分可包括但不限于氨基酸、鹽、金屬、糖、脂質(zhì)、核酸、激素、維生素、脂肪酸、蛋白等。如所期望的效果所需，通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員選擇在體外促進(jìn)和/或保持細(xì)胞培養(yǎng)的其他成分。

“分離”或“使分離”指從自然環(huán)境分離并且收集組合物或材料，諸如從組織或機(jī)體分離個(gè)體的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。在一方面，細(xì)胞群或細(xì)胞組合物基本上沒有與它的本質(zhì)有關(guān)的細(xì)胞與材料?！胺蛛x的”或“純化的”或“基本上純的”，對(duì)靶細(xì)胞群而言，指至少大約50％，至少大約75％，至少大約85％，至少大約90％，并且在具體的實(shí)施方案中，至少大約95％純的細(xì)胞群，對(duì)靶細(xì)胞組成全部細(xì)胞群而言。通過本領(lǐng)域中熟知的適當(dāng)?shù)姆椒梢栽u(píng)估細(xì)胞群或組合物的純度。例如，基本上純的多能細(xì)胞群指至少大約50％，至少大約75％，至少大約85％，至少大約90％，并且在具體的實(shí)施方案中，至少大約95％，以及在某些實(shí)施方案中，大約98％純的細(xì)胞群，對(duì)靶細(xì)胞組成全部細(xì)胞群而言。在本文術(shù)語(yǔ)“本質(zhì)上純的”與“基本上純的”可互換地使用。

“傳代”或“使……傳代”指當(dāng)細(xì)胞增生到所希望的程度時(shí)，細(xì)分并且將細(xì)胞平板接種到多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)表面或器皿的行為。在一些實(shí)施方案中，“傳代”或“使……傳代”指細(xì)分、稀釋并且平板接種細(xì)胞。因?yàn)榧?xì)胞從原代培養(yǎng)表面或器皿傳代到隨后的一套表面或器皿，因此隨后的培養(yǎng)物可稱為“傳代培養(yǎng)”或“首次傳代”等。每次細(xì)分并且平板接種到新的培養(yǎng)皿的行為被認(rèn)為是一次傳代。

“平板接種”指將細(xì)胞或細(xì)胞們置于培養(yǎng)皿從而使得細(xì)胞粘附并且涂抹在細(xì)胞培養(yǎng)皿上。

“多能性因子”指單獨(dú)或與其他的制劑組合，能夠增加細(xì)胞的發(fā)育能力的制劑。多能性因子包括但不限于多核苷酸、多肽以及能夠增加細(xì)胞的發(fā)育能力的小分子。例如，示例性多能性因子包括轉(zhuǎn)錄因子與小分子重新編程劑。轉(zhuǎn)錄因子可指蛋白(即多肽)以及編碼蛋白的多核苷酸，除非本文用法另有指示。例如，示例性轉(zhuǎn)錄因子包括Oct、Klf、Myc與Sox多肽，以及編碼這些多肽的多核苷酸。本文提供了額外的轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)例。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“多肽”與“蛋白”可互換地使用，除非有相反的規(guī)定，并且根據(jù)常規(guī)意義，即氨基酸序列。多肽不限于特定長(zhǎng)度，例如它們可包含全長(zhǎng)蛋白序列或全長(zhǎng)蛋白的片段，并且可包括多肽的翻譯后修飾，例如糖基化作用、乙?；饔?、磷酸化作用等，以及本領(lǐng)域中已知的其他的修飾，天然存在的與非天然存在的。使用任何各種熟知的重組和/或合成技術(shù)制備本發(fā)明的方法中所用的多肽。

本發(fā)明的方法，在某些實(shí)施方案中，使用本文所述的多肽的活性片段(例如Sox-2、c-Myc、Oct3/4、Klf4、Lin28、Nanog等，或基質(zhì)、輔因子和/或其下游效應(yīng)物)，例如包含至少大約10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、50個(gè)、75個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、400個(gè)、500個(gè)、1000個(gè)等連續(xù)氨基酸或更多本文所述的多肽，包括所有中間的長(zhǎng)度。在一具體的實(shí)施方案中，當(dāng)用于本文所述的方法中時(shí)，使用的片段或片段組合保留了調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)和/或保持多能性的能力。

在其他的方面，本發(fā)明使用本文所述的多肽組合物(例如Sox-2、c-Myc、Oct3/4、Klf4、Lin28、Nanog等，或基質(zhì)、輔因子和/或其下游效應(yīng)物)的變體。本發(fā)明通常所包含的多肽變體，沿其長(zhǎng)度方向，通常展示了與本文所示的多肽序列的至少約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性(例如，如下文所述所測(cè)定的)。在具體的實(shí)施方案中，使用的變體或其變體的組合保留了如本文所述的誘導(dǎo)多能性的能力。

在其他方面，本發(fā)明使用多肽變體，沿其長(zhǎng)度方向，展示了與本公開內(nèi)容所用的野生型哺乳動(dòng)物多肽的相應(yīng)區(qū)域的至少約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性(例如，如下文所述所測(cè)定的)。

多肽變體在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面不同于天然存在的多肽。此類變體可為天然存在的或可為合成產(chǎn)生的，例如，通過修飾一種或多種本發(fā)明方法中所用的以上的多肽序列并且使用本領(lǐng)域中熟知的許多技術(shù)的任一種評(píng)估它們的效果。

“增生的”指一個(gè)細(xì)胞分成兩個(gè)本質(zhì)上相同的細(xì)胞或細(xì)胞群在數(shù)量上增加(例如以再生)的性能。

“增殖”指在組織或機(jī)體外，例如在諸如塑料的(包被塑料的)細(xì)胞培養(yǎng)皿或燒瓶的無菌容器中使細(xì)胞生長(zhǎng)(例如經(jīng)由細(xì)胞增生再生)。

“原代培養(yǎng)”指細(xì)胞、組織和/或培養(yǎng)物，其中分離的細(xì)胞與培養(yǎng)基置于初次培養(yǎng)皿中。細(xì)胞、組織和/或培養(yǎng)物可為保持的和/或可增生的，然而，只要細(xì)胞、組織和/或培養(yǎng)物依然在首次培養(yǎng)皿中，細(xì)胞、組織和/或培養(yǎng)物就稱為原代培養(yǎng)。

術(shù)語(yǔ)“小分子重新編程劑”或“小分子重新編程化合物”在本文中可互換地使用并且指能夠單獨(dú)或與其他的多能性因子組合增加細(xì)胞發(fā)育能力的小分子?！靶》肿印敝妇哂蟹肿恿啃∮诩s5KD,小于約4KD，小于約3KD，小于約2KD，小于約1KD或小于約5KD的制劑。小分子可以為核酸、模擬肽、類肽、碳水化合物、脂質(zhì)或其他有機(jī)的或無機(jī)的分子?；瘜W(xué)的和/或生物的混合物的文庫(kù)，諸如真菌、細(xì)菌、或海藻提取物，為本領(lǐng)域中已知的并且可用任何本發(fā)明的測(cè)定篩選。在具體的實(shí)施方案中，本文所用的小分子重新編程劑具有小于10000道爾頓，例如，小于8000道爾頓，6000道爾頓，4000道爾頓，2000道爾頓，例如50-1500道爾頓、500-1500道爾頓、200-2000道爾頓、500-5000道爾頓的分子量。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“基本上無”與“本質(zhì)上無”可互換地使用，并且當(dāng)用于描述組合物，諸如細(xì)胞群或培養(yǎng)基時(shí)，指無指定物質(zhì)的組合物，諸如95％無、96％無、97％無、98％無、99％無指定物質(zhì)或通過常規(guī)方法測(cè)定檢測(cè)不到。相似的意義可以應(yīng)用于術(shù)語(yǔ)“缺乏”，其中提及特定物質(zhì)或組合物組分的缺乏。

本發(fā)明中使用的細(xì)胞

本發(fā)明中使用的起始細(xì)胞群可來自于基本上任何合適的來源，并且對(duì)細(xì)胞類型或多能性狀態(tài)而言可為異源的或同源的。在一實(shí)施方案中，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且在具體的實(shí)施方案中，細(xì)胞從選自嚙齒動(dòng)物、貓、狗、豬、山羊、綿羊、馬、牛或靈長(zhǎng)類動(dòng)物的哺乳動(dòng)物分離出來。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為人。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明待被使用或處理的細(xì)胞為成年細(xì)胞，包括基本上任何可得到的成年細(xì)胞類型。

細(xì)胞可為體細(xì)胞的、非多能的、不完全地或部分多能的干細(xì)胞、專能細(xì)胞、寡聚多能細(xì)胞、單能細(xì)胞、終末分化細(xì)胞、或包含任何前述組合的混合細(xì)胞群。本發(fā)明的方法中所用的多能細(xì)胞可為天然存在的干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞、或可以為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞?！盎旌系摹奔?xì)胞群為發(fā)育能力不同程度的細(xì)胞群。例如，混合的細(xì)胞群可包含進(jìn)行重新編程的細(xì)胞，從而使得混合群包含多能細(xì)胞、部分多能的細(xì)胞以及非多能細(xì)胞，諸如完全分化細(xì)胞。

在一實(shí)施方案中，起始的細(xì)胞群選自成年的或新生的干/祖細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，起始的干/祖細(xì)胞群選自中胚層干/祖細(xì)胞、內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞以及外胚層干/祖細(xì)胞。

在其他的實(shí)施方案中，起始的干/祖細(xì)胞群為中胚層干/祖細(xì)胞。中胚層干/祖細(xì)胞的示例性實(shí)例包括但不限于中胚層干/祖細(xì)胞、內(nèi)皮干/祖細(xì)胞、骨髓干/祖細(xì)胞、臍帶干/祖細(xì)胞、脂肪組織來源的干/祖細(xì)胞、造血干/祖細(xì)胞(HSCs)、間充質(zhì)干/祖細(xì)胞、肌肉干/祖細(xì)胞、腎臟干/祖細(xì)胞、成骨細(xì)胞干/祖細(xì)胞、軟骨細(xì)胞干/祖細(xì)胞等。

在其他有關(guān)的實(shí)施方案中，起始的干/祖細(xì)胞群為外胚層干/祖細(xì)胞。外胚層干/組細(xì)胞的示例性實(shí)例包括，但不限于神經(jīng)干/祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜干/祖細(xì)胞、皮膚干/祖細(xì)胞等。

在其他有關(guān)的實(shí)施方案中，起始的干/組細(xì)胞群為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞。內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的示例性實(shí)例包括，但不限于肝臟干/祖細(xì)胞、胰腺干/祖細(xì)胞、上皮干/祖細(xì)胞等。

在某些實(shí)施方案中，起始的細(xì)胞群可為異源的或同源的細(xì)胞群，選自胰島細(xì)胞、CNS細(xì)胞、PNS細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞腎細(xì)胞、肺臟細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、卵泡細(xì)胞、血管細(xì)胞、上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。

誘導(dǎo)細(xì)胞的重新編程與增加細(xì)胞潛能

繼續(xù)在細(xì)胞中進(jìn)行各種策略以誘導(dǎo)多能性或增加潛能(Takahashi,K.與Yamanaka,S.,Cell 126,663-676(2006)；Takahashi等,Cell 131,861-872(2007)；Yu等,Science 318,1917-1920(2007)；Zhou等,Cell Stem Cell 4,381-384(2009)；Kim等,Cell Stem Cell 4,472-476(2009)；Yamanaka等,2009；Saha,K.,Jaenisch,R.,Cell Stem Cell 5,584-595(2009))，并且提高重新編程的效率(Shi等,Cell Stem Cell 2,525-528(2008a)；Shi等,Cell Stem Cell 3,568-574(2008b)；Hua ngfu等,Nat Biotechnol 26,795-797(2008a)；Hua ngfu等,Nat Biotechnol 26,1269-1275(2008b)；Silva等,Plos Bio 6,e253.doi:10.1371/journal.pbio.0060253(2008)；Lyssiotis等,PNAS 106,8912-8917(2009)；Ichida等,Cell Stem Cell 5,491-503(2009)；Maherali,N.,Hochedli nger,K.,Curr Biol 19,1718-1723(2009b)；Esteban等,Cell Stem Cell 6,71-79(2010)；Fe ng等,Cell Stem Cell 4,301-312(2009))。

通常，用于重新編程的技術(shù)包括直接或間接地調(diào)節(jié)特異性細(xì)胞通路，使用多核苷酸-，多肽-和/或基于小分子的方法。例如，通過將細(xì)胞與一種或多種多能性因子接觸增加細(xì)胞潛能。如本文所用的，“接觸”可以包括在多能性因子(諸如，例如小分子、蛋白、肽等)存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞或?qū)⒍嗄苄砸蜃右氲郊?xì)胞。通過在包括諸如蛋白的轉(zhuǎn)錄因子的因子存在的情況下，在允許將轉(zhuǎn)錄因子引入到細(xì)胞的條件下，可以將多能性因子引入到細(xì)胞。例如，見Zhou H等,Cell Stem Cell.2009 May 8；4(5):381-4；WO/2009/117439。例如，使用瞬態(tài)法，例如蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射、非整合基因傳遞、mRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)等或任何其他合適的技術(shù)可促進(jìn)引入到細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，通過已引入到細(xì)胞中的重組載體表達(dá)或通過在外源性轉(zhuǎn)錄因子多肽存在的情況下孵育細(xì)胞從而使得多肽進(jìn)入細(xì)胞，將轉(zhuǎn)錄因子引入到細(xì)胞中。

在具體的實(shí)施方案中，多能性因子為轉(zhuǎn)錄因子。與增加、確立、或保持細(xì)胞潛能有關(guān)的示例性轉(zhuǎn)錄因子包括但不限于Oct-3/4、Cdx-2、Gbx2、Gsh1、HesX1、HoxA10、HoxA11、HoxB1、Irx2、Isl1、Meis1、Meox2、Nanog、Nkx2.2、Onecut、Otx1、Oxt2、Pax5、Pax6、Pdx1、Tcf1、Tcf2、Zfhx1b、Klf-4、Atbf1、Esrrb、Gcnf、Jarid2、Jmjd1a、Jmjd2c、Klf-3、Klf-5、Mel-18、Myst3、Nac1、REST、Rex-1、Rybp、Sall4、Sall1、Tif1、YY1、Zeb2、Zfp281、Zfp57、Zic3、Coup-Tf1、Coup-Tf2、Bmi1、Rnf2、Mta1、Pias1、Pias2、Pias3、Piasy、Sox2、Lef1、Sox15、Sox6、Tcf-7、Tcf7l1、c-Myc、L-Myc、N-Myc、Hand1、Mad1、Mad3、Mad4、Mxi1、Myf5、Neurog2、ngn3、Olig2、Tcf3、Tcf4、Foxc1、Foxd3、BAF155、C/EBPβ、mafa、Eomes、Tbx-3；Rfx4、Stat3、Stella以及UTF-1。示例性轉(zhuǎn)錄因子包括Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc以及Nanog。

小分子重新編程劑也為多能性因子并且也可用于本發(fā)明的方法中以誘導(dǎo)重新編程并且保持或增加細(xì)胞潛能。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，一種或多種小分子重新編程劑用于誘導(dǎo)體細(xì)胞的多能性，增加或保持細(xì)胞潛能或提高重新編程的效率。

在一些實(shí)施方案中，小分子重新編程劑用于本發(fā)明的方法中以提高重新編程的效率。通過(1)重新編程與多能細(xì)胞產(chǎn)生所需要的時(shí)間的減少(例如，通過與沒有小分子相似的或相同的過程相比，縮短了產(chǎn)生多能細(xì)胞的時(shí)間至少一天)或可選地或組合，(2)通過特定過程所產(chǎn)生的多能細(xì)胞數(shù)量的增加(例如，通過與沒有小分子相似的或相同的過程相比，某個(gè)時(shí)間段內(nèi)重新編程的細(xì)胞數(shù)量增加了至少10％、30％、50％、100％、200％、500％等)可以測(cè)量重新編程效率的提高。在一些實(shí)施方案中，觀察到重新編程效率2倍或20倍的提高。在一些實(shí)施方案中，重新編程效率提高了超過20倍。在一些實(shí)施方案中，觀察到超過沒有小分子重新編程劑的方法多于100倍的效率(例如，產(chǎn)生的多能細(xì)胞的數(shù)量有超過100倍的增加)。

幾類小分子重新編程劑對(duì)增加、確立和/或保持細(xì)胞潛能是重要的。示例性小分子重新編程劑包括，但不限于抑制H3K9甲基化作用或促進(jìn)H3K9脫甲基作用的制劑；抑制H3K4脫甲基作用或促進(jìn)H3K4甲基化作用的制劑；抑制組蛋白脫乙酰作用或促進(jìn)組蛋白乙?；饔玫闹苿?；L型鈣通道激動(dòng)劑；cAMP通路的激活劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑；MEK抑制劑；TGFβ受體/ALK5抑制劑；HDAC抑制劑；Erk抑制劑；ROCK抑制劑；FGFR抑制劑；以及PARP抑制劑。示例性小分子重新編程劑包括GSK3抑制劑；MEK抑制劑；TGFβ受體/ALK5抑制劑；HDAC抑制劑；Erk抑制劑；以及ROCK抑制劑。這些類別的小分子劑每一個(gè)在下文有詳細(xì)的描述。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，小分子重新編程劑用于取代本發(fā)明的方法中一種或多種轉(zhuǎn)錄因子以誘導(dǎo)多能性，提高重新編程的效率，和/或增加或保持細(xì)胞潛能。例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞與一種或多種小分子重新編程劑接觸，其中，包括足以提高重新編程的效率的劑量。在其他的實(shí)施方案中，除了轉(zhuǎn)錄因子以外，還在本發(fā)明的方法中使用一種或多種小分子重新編程劑。在一實(shí)施方案中，在條件下，細(xì)胞與至少一種多能性轉(zhuǎn)錄因子及至少一種小分子重新編程劑接觸以增加、確立和/或保持細(xì)胞潛能或提高重新編程過程的效率。

在其他的實(shí)施方案中，在條件下，細(xì)胞與至少一種多能性轉(zhuǎn)錄因子及至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種或至少十種小分子重新編程劑接觸一段時(shí)期足以增加、確立和/或保持細(xì)胞潛能或提高重新編程過程的效率。通過監(jiān)測(cè)本文別處所述的多能性特征可以評(píng)估多能性狀態(tài)或細(xì)胞分化。

在一實(shí)施方案中，細(xì)胞與包含一種或多種多能性因子的組合物和/或小分子重新編程劑的組合接觸，其中多能性因子與小分子增加或誘導(dǎo)細(xì)胞的多能性?？梢灶A(yù)期的是在體外、離體或在體內(nèi)可接觸本發(fā)明的細(xì)胞。

表征多能細(xì)胞

繼誘導(dǎo)重新編程后，基于有關(guān)的與可檢測(cè)的形態(tài)、與多能性有關(guān)的分子和/或生物化學(xué)變化可以選擇重新編程的細(xì)胞。細(xì)胞多能性的特異特征，其在評(píng)估細(xì)胞潛能中可單獨(dú)地或組合地監(jiān)測(cè)，包括但不限于基因表達(dá)、甲基化作用以及體內(nèi)與體外特征諸如：i)圓且扁的多能干細(xì)胞形態(tài)；ii)多能干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，其包括SSEA1(小鼠多能干細(xì)胞)、SSEA3/4(人多能干細(xì)胞)；TRA1-60/81；TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、Nanog和/或Sox2，以及如本發(fā)明提供的，CD30與CD50，以及前述事物的組合；iii)多能干細(xì)胞促進(jìn)小鼠嵌合體中種系傳遞的能力；iv)使用四倍體補(bǔ)償測(cè)定多能干細(xì)胞對(duì)胚體貢獻(xiàn)的能力；v)多能干細(xì)胞的畸胎瘤形成；vi)胚體的形成與體外三系分化；以及vii)失活的X染色體重新激活。在某些實(shí)施方案中，任何以上的特征的亞型用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞多能性。在一實(shí)施方案中，多能細(xì)胞通過具有扁的、圓形集落形態(tài)，SSEA4與Oct4的表達(dá)，以及形成嵌合體與畸胎瘤的能力表征多能細(xì)胞。

如本文所討論的，多能性作為連續(xù)體存在并且誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞似乎以“成熟的”狀態(tài)與“原初的”狀態(tài)存在，原初狀態(tài)中的細(xì)胞可能具有更大的分化潛能。常規(guī)的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞以成熟的狀態(tài)存在并且更接近地類似來源于植入后囊胚的細(xì)胞，而原初iPSC顯示了更接近地類似小鼠胚胎干細(xì)胞或來源于植入前囊胚的細(xì)胞的多能性特征?？梢酝ㄟ^各種差異定義成熟的與原初的細(xì)胞狀態(tài)，包括集落形態(tài)的差異、對(duì)抑制或激活關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)、基因表達(dá)信號(hào)以及再激活與胚胎外細(xì)胞有關(guān)的基因的能力。例如，常規(guī)的iPSC，代表成熟的多能狀態(tài)，展示了扁的集落形態(tài)，而原初iPSC展示了與小鼠胚胎干細(xì)胞相似的緊密半球形的集落形態(tài)。而且，常規(guī)的iPSC需要諸如TGFβ、激活素以及bFGF的關(guān)鍵細(xì)胞因子的外在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且依賴于ERK/MEK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以保持未分化的狀態(tài)，并且當(dāng)例如通過細(xì)胞與TGFβ或MEK抑制劑接觸來抑制這些通路時(shí)分化。相比之下，原初細(xì)胞不需要外在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，甚至當(dāng)用TGFβ與MEK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑處理時(shí)，還保持多能性。

額外地，基因表達(dá)分析揭示了原初的與成熟的多能細(xì)胞間的顯著差異。例如，原初iPSC顯著地抑制了Xist表達(dá)而常規(guī)的iPSC只顯示了對(duì)Xist表達(dá)的適度抑制；原初細(xì)胞顯示了顯著的X染色體再激活并且位于X染色體上增加的基因表達(dá)，超過了常規(guī)的iPSC中所見的表達(dá)；原初細(xì)胞表達(dá)胚胎外干細(xì)胞標(biāo)志物，包括但不限于Gata6、CDX2以及CGB。相比之下，早期的分化標(biāo)志物，諸如譜系特異性基因，諸如Foxa2、Sox17以及Brachyury，超過了原初iPSC，在常規(guī)的iPSC中更高表達(dá)。額外的用于鑒定多能性的原初狀態(tài)中的細(xì)胞的標(biāo)志物包括Klf4、Tbx3、Gbx2、Lin28、Soc3中的增加或Otx2、Sox17、Cer1、FoxA2、Zic1、Lhx2、Xist中的減少。

在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，原初細(xì)胞顯示與常規(guī)的iPSC相比，Xist表達(dá)減少了至少兩倍、至少五倍或至少十倍。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，多能性的原初狀態(tài)中細(xì)胞具有低于常規(guī)的iPSC兩倍的Xist表達(dá)并且位于X染色體上至少五個(gè)基因的表達(dá)水平比常規(guī)的iPSC高三倍。

X染色體再激活可以顯示通過位于X染色體上的至少5個(gè)基因、至少10個(gè)基因、或在具體的實(shí)施方案中，至少100個(gè)基因的表達(dá)水平超過常規(guī)的iPSC中此類基因水平至少兩倍、三倍、五倍或更多倍。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，對(duì)多次細(xì)胞傳代而言，例如對(duì)諸如至少1次、3次、5次、7次、10次、15次、20次或更多次的傳代而言，本發(fā)明的多能細(xì)胞保留了多能性的特征。

本發(fā)明的方法中使用的培養(yǎng)基平臺(tái)

本發(fā)明的培養(yǎng)基(即培養(yǎng)平臺(tái))包含化學(xué)定義的常備基礎(chǔ)培養(yǎng)基與各種小分子的組合，包括小分子抑制劑，其允許：

多能細(xì)胞在無飼養(yǎng)層環(huán)境中長(zhǎng)期培養(yǎng)；

細(xì)胞在無飼養(yǎng)層環(huán)境中重新編程；

多能細(xì)胞的單細(xì)胞解離；

多能細(xì)胞的細(xì)胞分選；

未分化狀態(tài)的保持；

重新編程效率的提高；和

原初多能細(xì)胞的產(chǎn)生。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中所用的化學(xué)定義的常備基礎(chǔ)培養(yǎng)基可為任何定義的適用于支持干細(xì)胞的保持、生長(zhǎng)和/或分化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，諸如常規(guī)的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明所用的定義的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)例包括，但不限于貝科改良Eagle培養(yǎng)基(“DMEM”)、Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BME)、DMEM/F-12(1:1DMEM與F-12體積:體積)、培養(yǎng)基199、F-12(Ham)營(yíng)養(yǎng)混合物、F-10(Ham)營(yíng)養(yǎng)混合物、最小必需培養(yǎng)基(MEM)、Williams'培養(yǎng)基E以及RPMI1640，除了別的以外，所有這些都可以從Gibco-BRL/Life技術(shù)公司，蓋瑟堡，馬里蘭州購(gòu)得?？墒褂迷S多這些培養(yǎng)基的幾個(gè)版本，并且特別用于構(gòu)建本發(fā)明的培養(yǎng)基的那些包括，但不限于DMEM11966、DMEM10314、MEM11095、Williams'培養(yǎng)基E 12251、Ham F12 11059、αMEM 12561以及培養(yǎng)基-19911151(都可從Gibco-BRL/Life技術(shù)公司購(gòu)得(1995-1996目錄))。例如培養(yǎng)基可包括下列的一種或多種：氨基酸、維生素、有機(jī)鹽、無機(jī)鹽、微量成分、緩沖鹽、糖、ATP等(合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分從圣路易斯，密蘇里州的Sigma-Aldrich購(gòu)得)。

本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中所用的小分子及其種類在下文進(jìn)行更加詳細(xì)地描述。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基包含一種或多種，兩個(gè)或多個(gè)或三個(gè)或多個(gè)的TGFβ、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及ROCK抑制劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基包含TGFβ、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及ROCK抑制劑。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基與方法中所用的示例性TGFβ、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及ROCK抑制劑在下文進(jìn)行了描述。培養(yǎng)基可額外地包含PARP抑制劑，諸如奧拉帕尼(AZD-2281)。

GSK-3β抑制劑

GSK-3β抑制劑包括，但不限于結(jié)合GSK-3β的抗體、顯性陰性的GSK-3β變體與siRNA以及將GSK-3β作為靶標(biāo)的反義核酸。其他示例性GSK-3β抑制劑包括但不限于Kenpaullone,1-Azakenpaullone,CHIR99021,CHIR98014,AR-A014418,CT 99021,CT 20026,SB216763,AR-A014418,鋰,SB 415286,TDZD-8,BIO,BIO-丙酮肟,(5-甲基-lH-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺,吡啶咔唑-環(huán)青霉素二烯釕復(fù)合體,TDZD-8 4-芐基-2-甲基-l,2,4-t噻二唑嗪-3,5-二酮,2-硫代(3-碘芐基)-5-(l-吡啶基)-[l,3,4]-惡二唑,OTDZT,α-4-對(duì)溴溴代苯乙酮,AR-AO 144-18,3-(l-(3-羥丙基)-lH-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮；TWSl 19吡咯并嘧啶化合物,L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2或它的十八烷基化形式；2-氯-l-(4,5-二溴-thiophen-2-基)-乙酮,SB216763,以及SB415286。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中所用的示例性GSK3抑制劑包括CHIR99021,BIO以及Kenpaullone,而且CHIR99021在具體的實(shí)施方案中為優(yōu)選的。

ERK/MEK抑制劑

示例性ERK/MEK通路抑制劑包括但不限于MEK或ERK抗體、顯性陰性MEK或ERK變體、與siRNA以及抑制MEK和/或ERK表達(dá)的反義核酸。其他示例性ERK/MEK抑制劑包括但不限于PD0325901、PD98059、UO126、SL327、ARRY-162、PD184161、PD184352,舒尼替尼，索拉非尼，凡德他尼，帕唑帕尼，阿西替尼，GSKl 120212、ARRY-438162、RO5126766、XL518、AZD8330、RDEAl 19、AZD6244、FR180204以及PTK787。

額外的ERK/MEK抑制劑包括國(guó)際公開的專利申請(qǐng)WO 99/01426,WO 02/06213,WO 03/077914,WO 05/051301以及WO2007/044084中公開的那些化合物。

更多的示例性ERK/MEK抑制劑包括下列的化合物：--6-(4-溴-2-氯-苯胺)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-e-5-羧酸(2,3-二羥基-丙氧基)-胺；6-(4-溴-2-氯-苯胺)-7-氟-3-(四氫-吡喃-2-ylm-乙基)-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羥基-乙氧基)-胺,1-[6-(4-溴-2-氯-苯胺)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-唑-5-基]-2-羥基-乙酮,6-(4-溴-2-氯-苯胺)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-e-5-羧酸(2-羥基-1,1-二甲基-乙氧基)-胺,6-(4-溴-2-氯-苯胺)-7-氟-3-(四氫呋喃-2-ylm-乙基)-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羥基-乙氧基)-胺,6-(4-溴-2-氟-苯胺)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-e-5-羧酸(2-羥基-乙氧基)-胺,6-(2,4-二氯-苯胺)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5--羧酸(2-羥基-乙氧基)-胺,6-(4-溴-2-氯-苯胺)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-e-5-羧酸(2-羥基-乙氧基)-胺,在下文中稱為MEK抑制劑1；2-[(2-氟-4-碘苯基)胺]-N-(2-羥乙氧基)-1,5-二甲基-6--氧-1,6-二氫吡啶-3-羧胺；在下文中稱為MEK抑制劑2；以及4-(4-溴-2-氟苯基胺)-N-(2-羥乙氧基)-1,5-二甲基-6--氧-1,6-二氫吡啶-3-羧胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中所用的MEK/ERK抑制劑為PD98059。

TGFβ受體/ALK5抑制劑

示例性ALK5抑制劑包括ALK5抗體，ALK5的顯性陰性變體，以及抑制ALK5表達(dá)的反義核酸。其他示例性ALK5抑制劑包括但不限于SB431542、A-83-01、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-lH-吡唑-4-基)-l,5-萘啶、Wnt3a/BIO、BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604、SB-505124以及嘧啶衍生物，例如參見,WO2008/006583,通過引用并入本文。

另外，雖然“ALK5抑制劑”不打算包含非特異性激酶抑制劑，應(yīng)理解“ALK5抑制劑”包含除了ALK5以外抑制ALK4和/或ALK7的抑制劑，例如，諸如SB-431542(例如參見Inman等,J MoI.Phamacol.62(1):65-74(2002)。

鑒于本文顯示抑制ALK5的效應(yīng)的數(shù)據(jù)，應(yīng)相信的是抑制TGFβ/激活劑通路具有相似的效應(yīng)。因此，任何抑制劑，例如TGFβ/激活劑通路的上游或下游可以與ALK5組合或代替本文每段中所述的ALK5抑制劑使用。示例性TGFβ/激活劑通路包括但不限于：TGFβ受體抑制劑，SMAD 2/3磷酸化作用的抑制劑，SMAD 2/3與SMAD 4相互作用的抑制劑，以及SMAD 6與SMAD 7激活劑/激動(dòng)劑。而且，下文所述的分類僅僅出于組織的目的，并且本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)理解化合物可以影響一種或多種通路中的點(diǎn)，因此化合物可以一個(gè)以上所定義的分類發(fā)揮功能。

TGFβ受體抑制劑可以包括以TGFβ受體為靶標(biāo)的抗體、顯性陰性變體與siRNA或反義核酸。抑制劑的特定實(shí)例包括但不限于SU5416；2-(5-苯并[l,3]二氧-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶氫氯化(SB-505124)；lerdelimμMb(CAT-152)；metelimμMab(CAT-192)；GC-1008；IDl1；AP-12009；AP-11014；LY550410；LY580276；LY364947；LY2109761；SB-505124；SB-431542；SD-208；SM16；NPC-30345；Ki26894；SB-203580；SD-093；格列衛(wèi)；3,5,7,2',4'-戊羥基黃酮(莫林)；激活素-M108A；P144；可溶的TBR2-Fc；以及以TGFβ受體為靶標(biāo)的反義轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞。(例如參見Wrzesinski等,Clinical Cancer Research 13(18):5262-5270(2007)；Kaminska等,Acta Biochimica Polonica 52(2):329-337(2005)；以及Cha ng等,Frontiers in Bioscience 12:4393-4401(2007)。

本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中所用的示例性TGFβ受體抑制劑包括SB431542,A-83-01以及RepSox。在具體的實(shí)施方案中，TGFβ抑制劑為SB431542。

ROCK抑制劑

ROCK為充當(dāng)靶蛋白R(shí)ho(其中有三種亞型存在--RhoA,RhoB以及RhoC)的絲氨酸/蘇氨酸激酶。示例性ROCK抑制劑包括但不限于ROCK抗體，顯性陰性ROCK變體，與siRNA以及抑制ROCK表達(dá)的反義核酸。其他示例性ROCK抑制劑包括但不限于thiazovivin，Y27632、法舒地爾、AR122-86、Y27632H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、羥基-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B、N-(4-吡啶基)-N'-(2,4,6-三氯苯基)尿素、3-(4-吡啶基)-1H-吲哚以及(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨乙基)-環(huán)己酰胺。

本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中所用的示例性ROCK抑制劑包括thiazovivin,Y27632,pyrintegrin以及Blebbistatin。在某些實(shí)施方案中，ROCK抑制劑為thiazovivin。

FGFR抑制劑

示例性FGFR抑制劑包括但不限于FGFR抗體、顯性陰性FGFR變體與siRNA以及抑制FGFR表達(dá)的反義核酸。其他示例性FGFR抑制劑包括但不限于RO-4396686、CHIR-258、PD 173074、PD 166866、ENK-834、ENK-835、SU5402、XL-999、SU6668、CHIR-258、R04383596以及BIBF-1120。

PARP抑制劑

PARP抑制劑抑制多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(“PARP”)。PARP蛋白為DNA修復(fù)酶，其發(fā)揮在細(xì)胞中調(diào)節(jié)DNA修復(fù)通路的功能。PARP參與剪輯切除修復(fù)(BER)通路，并且PARP抑制可促進(jìn)多能細(xì)胞重新編程或保持期間細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中所用的示例性PARP抑制劑包括但不限于iniparib、veliparib以及奧拉帕尼(AZD-2281)。

本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中小分子的量可以變化并且根據(jù)特定的培養(yǎng)條件優(yōu)化，包括所用的特異性分子與組合，培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞類型以及本發(fā)明的培養(yǎng)基所用的特異性應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，小分子以足以誘導(dǎo)多能性、提高重新編程的效率或增加或保持細(xì)胞潛能的濃度存在于培養(yǎng)基中。

在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)基中小分子的優(yōu)選濃度與組合顯示于表1中。在本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)基的具體實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基為“SMC4”培養(yǎng)基，如表1中所示。SMC4培養(yǎng)基包含如表1中所示的常規(guī)的人ESC培養(yǎng)基與特異性通路調(diào)節(jié)劑以及添加劑。培養(yǎng)基組分以表1中所示此類組分的最佳范圍的量存在于培養(yǎng)基中，并且以表1中所示的最佳濃度存在。SMC4培養(yǎng)基的實(shí)施方案可任選地包含任何一種或多種可選擇的培養(yǎng)基以及表2中所示的通路調(diào)節(jié)劑與激活劑，以表2中所示的最佳范圍內(nèi)濃度，并且在某些實(shí)施方案中，以表2中所示的最佳濃度內(nèi)濃度。在培養(yǎng)基的具體實(shí)施方案中，SMC4培養(yǎng)基包含可溶性纖連蛋白，并在本文被稱為“SMC4+纖連蛋白”。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基還包含一種或多種Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽以及Sox多肽。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基不包含細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還包含細(xì)胞，例如，非多能細(xì)胞、部分多能細(xì)胞、多能細(xì)胞或包含各種潛能狀態(tài)的細(xì)胞的混合的細(xì)胞群。

表1.細(xì)胞培養(yǎng)組分與添加劑。下列的表格列出了分子的實(shí)例，以及它們影響的可以用于增強(qiáng)重新編程過程以及保持未分化的狀態(tài)中的多能干細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

SMC4+纖連蛋白是指以約5μg/mL的濃度添加可溶性纖連蛋白的上文所述的SMC4培養(yǎng)基。纖連蛋白可以以約0.05-500μg/mL的濃度存在于SMC4培養(yǎng)基中。

表2.具體可選擇的細(xì)胞培養(yǎng)組分與添加劑以增強(qiáng)在單細(xì)胞傳代上、細(xì)胞分選以及無飼養(yǎng)層系統(tǒng)上培養(yǎng)細(xì)胞的多能性與活力

細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基基本上無細(xì)胞因子和/或生長(zhǎng)因子，并且任選地為無飼養(yǎng)層環(huán)境。在其他的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含添加物，諸如血清、提取物、生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子等。

各種生長(zhǎng)因子與它們?cè)谂囵B(yǎng)基中的使用為本領(lǐng)域中熟知的并且例如，包括ECM蛋白、層粘連蛋白1、纖連蛋白、IV型膠原蛋白同種型、蛋白酶抑制劑、細(xì)胞表面粘附蛋白、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、鈣粘素、胞內(nèi)氯離子通道蛋白1、跨膜受體PTK7、胰島素樣生長(zhǎng)因子、抑制素βA、TGFβ/激活素/nodal信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的誘導(dǎo)物以及激活素A。例如，培養(yǎng)基中所用的細(xì)胞因子可包括下列的一種或多種：生長(zhǎng)因子諸如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF-2)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、各種白細(xì)胞介素(諸如IL-1至IL-18)、各種集落刺激因子(諸如粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF))、各種干擾素(諸如γ干擾素)以及其他具有對(duì)干細(xì)胞有影響的細(xì)胞因子，諸如干細(xì)胞因子(SCF)與紅細(xì)胞生成素(Epo)。這些細(xì)胞因子可商購(gòu)獲得，例如從R&D系統(tǒng)、明尼阿波利斯、明尼蘇達(dá)州商購(gòu)，并且可為天然的或重組的。在一些實(shí)施方案中，對(duì)各種各樣的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)而言，基礎(chǔ)培養(yǎng)基將包含濃度約0.01-100ng/ml、約0.2-20ng/ml,并且在具體的實(shí)施方案中約0.5-10ng/ml的FGF。其他的細(xì)胞因子，如果使用的話，將以憑經(jīng)驗(yàn)確定的或如通過已確立的細(xì)胞因子技術(shù)指導(dǎo)的濃度添加。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中可包括的額外的組分為胰島素(特別是胰島素Zn⁺⁺)與轉(zhuǎn)鐵蛋白。這些額外的成分，商購(gòu)獲得(例如從Sigma-Aldrich，圣路易斯，密蘇里州商購(gòu))，可以約0.1-約100μg/ml或約1μg/ml-約10μg/ml的濃度范圍配制到本發(fā)明的培養(yǎng)基中。額外地，重組胰島素或胰島素基本鋅的鹽可被替換為動(dòng)物源性或人源性的胰島素。可添加其他的成分或替代品至本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的那些添加組分。

細(xì)胞因子與類似的添加物組分可替換(或另外)被包括在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。此類組分通常與添加組分包括在一起，因?yàn)樘砑咏M分常規(guī)儲(chǔ)存在約-20℃下而不是常規(guī)用于儲(chǔ)存基礎(chǔ)培養(yǎng)基的約4℃溫度。細(xì)胞因子與類似的組分在更接近-20℃的溫度下一般更好。

本發(fā)明的方法中所用的基質(zhì)

任何合適的器皿或細(xì)胞培養(yǎng)皿都可用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或細(xì)胞培養(yǎng)添加物的支持物。支持物上無基質(zhì)包被為必需的。然而，用粘附促進(jìn)基質(zhì)(例如膠原蛋白、纖連蛋白、包含RGD的多肽、明膠等)包被培養(yǎng)皿的表面促進(jìn)細(xì)胞附著并且因此增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)基與本文公開的添加物的影響。用于培養(yǎng)并且傳代細(xì)胞的合適的基質(zhì)為本領(lǐng)域中已知的并且包括但不限于明膠、層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白、骨橋蛋白、諸如Matrigel^TM的天然存在的細(xì)胞系產(chǎn)生的矩陣混合物以及合成的或人造的表面，諸如聚胺單層與羧基末端的單層。

無飼養(yǎng)層環(huán)境

雖然細(xì)胞通常培養(yǎng)在飼養(yǎng)層細(xì)胞上或在用飼養(yǎng)層細(xì)胞預(yù)調(diào)節(jié)并且包含胎牛血清的培養(yǎng)環(huán)境中，但此類環(huán)境不適合于產(chǎn)生用于臨床與治療用途的細(xì)胞。例如，通常認(rèn)為在此類外源污染的環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞不適合于人的細(xì)胞移植，因?yàn)閯?dòng)物組分的暴露可存在免疫排斥與將未鑒定的病原體傳遞至被治療患者的嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)，并且可潛在地再激活動(dòng)物的逆轉(zhuǎn)錄病毒。使用無動(dòng)物培養(yǎng)基的培養(yǎng)系統(tǒng)，諸如本發(fā)明的無飼養(yǎng)層環(huán)境，促進(jìn)臨床級(jí)細(xì)胞系，特別是hESC與iPSC細(xì)胞系的產(chǎn)生。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的無飼養(yǎng)層環(huán)境基本上無人飼養(yǎng)層細(xì)胞，包括但不限于人成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞，并且不受飼養(yǎng)層細(xì)胞預(yù)調(diào)節(jié)。在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，無飼養(yǎng)層環(huán)境基本上無動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞，另外，在一些實(shí)施方案中，無飼養(yǎng)層環(huán)境沒有用飼養(yǎng)層細(xì)胞預(yù)調(diào)節(jié)。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，無飼養(yǎng)層環(huán)境基本上無人的與動(dòng)物的飼養(yǎng)層細(xì)胞，并且在更具體的實(shí)施方案中，無飼養(yǎng)層環(huán)境基本上無人的與動(dòng)物的飼養(yǎng)層細(xì)胞并且沒有用飼養(yǎng)層細(xì)胞預(yù)調(diào)節(jié)。

本發(fā)明的無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基用于本發(fā)明的方法中，包括多能細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞的重新編程，多能細(xì)胞的單細(xì)胞解離，多能細(xì)胞的細(xì)胞分選，原初多能細(xì)胞的產(chǎn)生以及細(xì)胞未分化狀態(tài)的保持。在本發(fā)明的具體方法中，無飼養(yǎng)層環(huán)境用于誘導(dǎo)多能性、提高重新編程的效率，和/或增加或保持細(xì)胞潛能的方法中。在某些實(shí)施方案中，無飼養(yǎng)層環(huán)境基本上沒有細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子，包括bFGF。

解離

通過酶促的或機(jī)械的方法可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞解離為單細(xì)胞，諸如解離為單細(xì)胞懸浮液。本領(lǐng)域中已知的允許細(xì)胞解離為單細(xì)胞的任何酶促劑可用于本發(fā)明的方法中。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，解離劑選自胰蛋白酶/EDTA、TrypLE選擇劑、IV型膠原蛋白酶以及中性蛋白酶。

螯合劑，諸如EDTA、Accutase或AccμMax，也可單獨(dú)地或與酶促劑組合，用于本發(fā)明的方法中解離細(xì)胞。解離劑可溶于無鈣與鎂的PBS以促進(jìn)解離為單細(xì)胞。

為增強(qiáng)解離期間與解離后細(xì)胞的存活，可以添加生存促進(jìn)物質(zhì)(例如生長(zhǎng)因子、參與細(xì)胞死亡與凋亡的細(xì)胞通路的抑制劑、或條件培養(yǎng)基)。在一些實(shí)施方案中，解離常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞并且將單細(xì)胞置于具有一種或多種小分子抑制劑的本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)中，諸如SMC4培養(yǎng)基或SMC4+纖連蛋白?？扇芜x地將解離的單細(xì)胞置于無飼養(yǎng)層環(huán)境中。在其他的實(shí)施方案中，解離前在無飼養(yǎng)層環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞并且置于具有一種或多種小分子抑制劑的本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)中，諸如SMC4培養(yǎng)基或SMC4+纖連蛋白，其可任選地為無飼養(yǎng)層環(huán)境。

通過機(jī)械力支持酶促解離為單細(xì)胞。可選地，解離劑可僅為機(jī)械力，諸如通過使用機(jī)械工具，諸如移液管或尖頭的微毛細(xì)管以分離細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng)與培養(yǎng)基收集中的通用技術(shù)在以下中概述：大規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Hu等,Curr.Opin.Biotechnol.8:148,1997)；無血清培養(yǎng)基(K.Kitano,Biotechnology 17:73,1991)；大規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Curr.Opin.Biotechnol.2:375,1991)；以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)(Birch等,Bioprocess Technol.19:251,1990)。其他感興趣的讀物包括理解培養(yǎng)基(M.McLuhan,Mentor N.Y.,1964)與培養(yǎng)基即信息(M.McLuhan&Q.Fiore,Bantam N.Y.,1967)。

為詳細(xì)闡述本發(fā)明實(shí)踐中所用的通用技術(shù)，實(shí)踐者可以參考細(xì)胞生物學(xué)、組織培養(yǎng)以及胚胎學(xué)方面標(biāo)準(zhǔn)的教科書與綜述。包括：“畸胎癌與胚胎干細(xì)胞：實(shí)踐的方法”(E.J.Robertson,ed.,IRL Press Ltd.1987)；“小鼠發(fā)育中的技術(shù)指南”(P.M.Wasserman等.eds.,Academic Press 1993)；“胚胎干細(xì)胞體外分化”(M.V.Wiles,Meth.Enzymol.225:900,1993)；“胚胎干細(xì)胞的特性與用途”(P.D.Rathjen等,al.,1993)。Robertson,Meth.Cell Biol.75:173,1997與Pedersen,Reprod.Fertil.Dev.10:31,1998中回顧了干細(xì)胞的分化。

富集與消耗策略

本發(fā)明也提供了用于富集多能細(xì)胞的細(xì)胞群的策略，作為增加產(chǎn)生iPSC效率的方法。富集策略提供了在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)衍生克隆的iPSC集落的方法，提高了iPSC產(chǎn)生效率。本發(fā)明的富集方法包括分選細(xì)胞群，已誘導(dǎo)其重新編程以鑒定及獲得表達(dá)多能性標(biāo)志物的細(xì)胞，因此獲得富集的多能細(xì)胞的細(xì)胞群。待被分選的細(xì)胞已被誘導(dǎo)重新編程并且可包含進(jìn)行重新編程的混合的細(xì)胞群，從而使得群體包含多能細(xì)胞、部分多能細(xì)胞以及非多能細(xì)胞，諸如終末分化細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，待被分選的細(xì)胞群已被誘導(dǎo)重新編程并且表達(dá)多能性標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)重新編程約4天-30天、約4天-24天、約6天-22天、或約8天-約12天后培養(yǎng)細(xì)胞。額外的富集方法涉及表達(dá)分化標(biāo)志物或非多能性細(xì)胞的消耗以獲得富集的多能細(xì)胞群。

本發(fā)明的富集策略包括獲得待被分選的細(xì)胞群的單細(xì)胞懸浮液。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，通過解離群體中的細(xì)胞并且重懸浮細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸浮液。解離的細(xì)胞可重懸浮在任何合適的用于保持細(xì)胞或進(jìn)行細(xì)胞分選的溶液或培養(yǎng)基。在具體的實(shí)施方案中，單細(xì)胞懸浮液包含一種或多種TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑。在某些實(shí)施方案中，單細(xì)胞懸浮液包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑，以及在某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。

在本發(fā)明的富集過程中，分選細(xì)胞以獲得多能細(xì)胞或消耗非重新編程的或非多能細(xì)胞，因此獲得富集的多能細(xì)胞群。在一實(shí)施方案中，制備單細(xì)胞懸浮液，然后制備用于分選的單細(xì)胞，諸如通過多能性標(biāo)志物染色，例如使用適當(dāng)?shù)目贵w?？赏ㄟ^任何合適的分選細(xì)胞的方法，諸如通過磁珠或流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分選，分選細(xì)胞。

基于各種多能性標(biāo)志物分選細(xì)胞，包括Oct、Sox、Nanog、SSEA3/4、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、KLF4、SSEA1(小鼠)以及如本發(fā)明中所示的CD30與CD50。在各種實(shí)施方案中，基于至少兩種、至少三種、或至少四個(gè)多能性標(biāo)志物分選細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，基于SSEA4的表達(dá)，并且在某些具體的實(shí)施方案中，基于SSEA4與TRA181或TRA160組合的表達(dá)分選細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，基于SSEA4、Tra181或TRA160以及CD30分選細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，最初，使用分化細(xì)胞的表面標(biāo)志物，其可包括但不限于CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46或CD7，針對(duì)非重新編程的細(xì)胞消耗細(xì)胞，然后針對(duì)多能性標(biāo)志物諸如SSEA4、Tra181以及CD30富集細(xì)胞。

分選以獲得針對(duì)多能性標(biāo)志物陽(yáng)性的細(xì)胞后，理想的細(xì)胞分?jǐn)?shù)為富含多能細(xì)胞的細(xì)胞群?？蓪⒏缓嗄芗?xì)胞的群體置于細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，諸如常規(guī)的hESC培養(yǎng)基或本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可添加飼養(yǎng)層細(xì)胞或任選地為無飼養(yǎng)層環(huán)境。在一些實(shí)施方案中，將表達(dá)多能性標(biāo)志物的分選的細(xì)胞置于添加了飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)且然后轉(zhuǎn)移至無飼養(yǎng)層環(huán)境。細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可添加一種或多種表1與2中所示的特異性通路調(diào)節(jié)劑與添加劑。在一實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基為無飼養(yǎng)層環(huán)境并且包含TFGβ抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑以及Rock抑制劑的其中之一；并且在某些實(shí)施方案中，TFGβ抑制劑為SB431542，GSK3抑制劑為CHIR99021，MEK抑制劑為PD0325901，以及Rock抑制劑為thiazovivin。在本發(fā)明其他具體的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為包含Matrigel^TM包被的組織平板、常規(guī)的hESC培養(yǎng)基以及表1中所示的特異性通路調(diào)節(jié)劑。在一實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包含表1中所述的SMC4培養(yǎng)基，任選地與任何可選的表2中所示的培養(yǎng)基與通路調(diào)節(jié)劑組合。

富集的細(xì)胞群可培養(yǎng)于本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中以獲得iPSC集落，iPSC集落通常出現(xiàn)在分選后約3天-約25天；分選后約5-9天或分選后約5-7天?？梢赃x擇或分選iPSC集落用于克隆擴(kuò)增。使用本發(fā)明的富集策略，富集3倍多能細(xì)胞的細(xì)胞群。

本發(fā)明也提供了消耗不合需要的細(xì)胞的細(xì)胞群的方法。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群，諸如進(jìn)行重新編程的細(xì)胞群或多能細(xì)胞群，消耗分化細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中，被誘導(dǎo)重新編程的多能細(xì)胞群或細(xì)胞可以消耗具有分化細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物的細(xì)胞?；诜只?xì)胞的表面標(biāo)志物，諸如CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、或CD7可以分選細(xì)胞群，并且可以從細(xì)胞群移除表達(dá)分化細(xì)胞的標(biāo)志物的細(xì)胞以獲得富含多能細(xì)胞的細(xì)胞群。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中CD13用作分化細(xì)胞的表面標(biāo)志物。

在其他的實(shí)施方案中，誘導(dǎo)以分化的細(xì)胞群，諸如誘導(dǎo)以分化為所需譜系的細(xì)胞群，消耗多能細(xì)胞以獲得分化群或分化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，分化細(xì)胞群包含已誘導(dǎo)其分化為特定譜系的細(xì)胞群，諸如ESC或iPSC。使用上文所述的分選技術(shù)，諸如根據(jù)磁珠或基于多能性標(biāo)志物的FACs分選群體中的細(xì)胞，細(xì)胞群可消耗多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，通過FACs使用多能性標(biāo)志物，分選包含分化細(xì)胞的細(xì)胞群并且獲得消耗了表達(dá)多能性標(biāo)志物的細(xì)胞的一小部分。在其他的實(shí)施方案中，通過FACs基于分化標(biāo)志物，諸如譜系特異性標(biāo)志物，像CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、或CD7分選細(xì)胞群以獲得消耗了多能性標(biāo)志物的一小部分。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中CD13用作分化細(xì)胞的表面標(biāo)志物。

本發(fā)明實(shí)踐將使用，除非明確指示意思相反，化學(xué)、生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)的常規(guī)方法，重組DNA技術(shù)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、干細(xì)胞技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因生物學(xué)，它們都在技術(shù)人員掌握范圍內(nèi)。出于示例目的下文描述了其中許多。在文獻(xiàn)中充分地解釋此類技術(shù)，例如參見Sambrook等，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第3版,2001年)；Sambrook等,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第2版,1989年)；Maniatis等,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(1982年)；Ausubel等,當(dāng)前的分子生物學(xué)技術(shù)(John Wiley與Sons,2008年7月升級(jí))；分子生物學(xué)中簡(jiǎn)短技術(shù):來源于當(dāng)前分子生物學(xué)技術(shù)的方法概略,Greene Pub.Associates and Wiley-interscience；Glover,DNA克隆:實(shí)踐方法,I&II卷(IRL Press,Oxford,1985年)；Anand,用于復(fù)合基因組分析的技術(shù)(學(xué)術(shù)出版社,紐約,1992年)；Guthrie與Fink,酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)指南(學(xué)術(shù)出版社,紐約,1991年)；寡核苷酸合成(N.Gait,Ed.,1984年)；核酸雜交(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1985年)；轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984年)；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(R.Freshney,Ed.,1986年)；Perbal,分子克隆的實(shí)踐指南(1984年)；Fire等,RNA干擾技術(shù):從基礎(chǔ)科學(xué)到藥物研發(fā)(劍橋大學(xué)出版社,劍橋,2005年)；Schepers,實(shí)踐中RNA干擾(Wiley-VCH,2005年)；E ngelke,RNA干擾(RNAi):siRNA技術(shù)的螺母與螺栓(DNA出版社,2003年)；Gott,RNA干擾,編輯與修正:方法與技術(shù)(分子生物學(xué)中的方法；人出版社,托托瓦,新澤西州,2004年)；Sohail,受RNA干擾的基因沉默:技術(shù)與應(yīng)用(CRC,2004年)；Clarke與Sanseau,微RNA:生物學(xué)，功能&表達(dá)(螺母&螺栓系列；DNA出版社,2006年)；固定化細(xì)胞與酶(IRL出版社,1986年)；論述,酶學(xué)中的方法(學(xué)術(shù)出版社,有限公司,紐約)；用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(J.H.Miller與M.P.Calos eds.,1987年,冷泉港實(shí)驗(yàn)室)；Harlow與Lane,抗體(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,冷泉港,紐約,1998年)；細(xì)胞與分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法(Mayer與Walker,eds.,學(xué)術(shù)出版社,倫敦,1987年)；實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè),I-IV卷(D.M.Weir與CC Blackwell,eds.,1986年)；Riott,基礎(chǔ)免疫學(xué)，第6版,(Blackwell科學(xué)出版社,牛津,1988年)；胚胎干細(xì)胞:方法與技術(shù)(分子生物學(xué)中的方法)(Kurstad Turksen,Ed.,2002年)；胚胎干細(xì)胞技術(shù):I卷:分離與表征(分子生物學(xué)中的方法)(Kurstad Turksen,Ed.,2006年)；胚胎干細(xì)胞技術(shù):II卷:分化模型(分子生物學(xué)中的方法)(Kurstad Turksen,Ed.,2006年)；人胚胎干細(xì)胞技術(shù)(分子生物學(xué)中的方法)(Kursad Turksen Ed.,2006)；間充質(zhì)干細(xì)胞:方法與技術(shù)(分子生物學(xué)中的方法)(Darwin J.Prockop,Donald G.Phinney,以及Bruce A.Bunnell Eds.,2008年)；造血干細(xì)胞技術(shù)(分子醫(yī)學(xué)中的方法)(Christopher A.Klug以及Craig T.Jordan Eds.,2001年)；造血干細(xì)胞技術(shù)(分子醫(yī)學(xué)中的方法)(Kevin D.Bunti ng Ed.,2008年)神經(jīng)干細(xì)胞:方法與技術(shù)(分子生物學(xué)中的方法)(Leslie P.Weiner Ed.,2008年)；Hogan等,操作小鼠胚胎的方法(第2版,1994年)；Nagy等,操作小鼠胚胎的方法(第3版,2002年),以及斑馬魚書，斑馬魚使用的實(shí)驗(yàn)室指南(斑馬魚),第4版,(俄勒岡大學(xué)出版社,尤金,俄勒岡州,2000年)。

如本說明書與所附的權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式“一(a)”，“一(an)”以及“所述(the)”包括復(fù)數(shù)參考，除非內(nèi)容另有明確地規(guī)定。

貫穿本說明書，除非上下文另有要求，應(yīng)理解詞語(yǔ)“包含(comprise)”，“包含(comprises)”以及“包含(comprisi ng)”暗示規(guī)定的步驟或成分或步驟或成分的組的包含，但是不排除任何其他的步驟或成分或步驟或成分的組。所謂“由…組成(consisti ng of)”意指包括并且限于跟隨在短語(yǔ)“consisti ng of”無論什么。因此，短語(yǔ)“由…組成(consisti ng of)”指示所列成分是必須的或強(qiáng)制的，并且沒有其他的成分存在。所謂“基本上由…組成(consisti ng essentially of)”意指包括短語(yǔ)后所列的任何成分，并且限于不干擾或有助于活性或所列成分公開內(nèi)容中指定的活動(dòng)其他的成分。因此，短語(yǔ)“基本上由…組成(consisti ng essentially of)”指示所列成分是必須的或強(qiáng)制的，但是其他的成分為任選的以及可能或不可能存在，取決于它們是否影響所列成分的活性或活動(dòng)。

可以組合上文所述的各種實(shí)施方案，以便提供其他的實(shí)施方案。通過引用，全文并入本說明書所涉及和/或申請(qǐng)資料頁(yè)所列舉的所有美國(guó)專利、美國(guó)專利申請(qǐng)公布、美國(guó)專利申請(qǐng)、國(guó)外的專利、國(guó)外的專利申請(qǐng)和非專利出版物。如有必要，可更改實(shí)施方案的各種方面，以便應(yīng)用各種專利、申請(qǐng)和出版物的概念再提供其他的實(shí)施方案。

根據(jù)上文的詳述，可對(duì)實(shí)施方案做出這些或其他改變?？傊?，在所附的權(quán)利要求中，所用的術(shù)語(yǔ)不應(yīng)當(dāng)解釋為，限制說明書和權(quán)利要求中所公開的具體實(shí)施方案，而應(yīng)當(dāng)解釋為包括所有可能的實(shí)施方案，以及授予權(quán)利的此類權(quán)利要求的等同物的全部范圍。因此，權(quán)利要求并不限于公開的內(nèi)容。

實(shí)施例

實(shí)施例1：實(shí)驗(yàn)方法

A.多能干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)

適應(yīng)無飼養(yǎng)層前，將人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(hiPSC)保持在飼養(yǎng)層細(xì)胞(絲裂霉素C處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)細(xì)胞(Millipore))上，并且與常規(guī)的培養(yǎng)基一起培養(yǎng)。如本申請(qǐng)中所用的，“常規(guī)的培養(yǎng)基”指包含DMEM/F12(Mediatech),10ng/mL bFGF(Invitrogen),20％v/v基因敲除的血清置換(Invitrogen),1％v/v非必需氨基酸(Mediatech),2mM左旋谷氨酰胺(Mediatech)以及100μMβ-巰基乙醇(Invitrogen)的基礎(chǔ)的人胚胎干細(xì)胞(hESC)培養(yǎng)基。表1的第一部分中也描述了常規(guī)的培養(yǎng)基。使用精尖的玻璃吸管，通過機(jī)械地切開將集落解體為小塊每5-7天傳代(團(tuán)塊傳代)hiPSC，收集并以1:3-1:6稀釋傳代至新近接種的絲裂霉素C處理的MEF細(xì)胞上，每日添加hESC培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)保持在設(shè)置成37℃、5％CO₂濕潤(rùn)的孵育箱內(nèi)。在具有飼養(yǎng)層細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞并且使用團(tuán)塊傳代在本文被稱為“常規(guī)的培養(yǎng)”。

對(duì)單細(xì)胞解離而言，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(Mediatech)洗滌hiPSC一次并且在37℃下用Accutase(Millipore)或TrypL(Invitrogen)處理3-5分鐘隨后通過移液管打破成單細(xì)胞。然后以等體積將單細(xì)胞懸浮液與上文所述的常規(guī)培養(yǎng)基混合，以300g旋轉(zhuǎn)沉降5分鐘并且重懸浮在SCM4培養(yǎng)基或SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基。在大多數(shù)情況下，將單細(xì)胞解離的細(xì)胞保持在SMC4培養(yǎng)基，SMC4培養(yǎng)基由添加了包括0.4μM PD0325901、1μM CHIR99021、5μM Thiazovivin以及2μM SB431542(所有Biovision)的各種小分子與添加劑的常規(guī)hESC培養(yǎng)基組成。20℃下，在添加至培養(yǎng)基前將小分子以儲(chǔ)備濃度5-25μM保持DMSO中。將所有的工作培養(yǎng)基保持在4℃下長(zhǎng)達(dá)4周。ROCK抑制劑的培養(yǎng)，與Thiazovivin一起優(yōu)于Y27632用于保持細(xì)胞在未分化的狀態(tài)。

重懸浮在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)先在37℃下用Matrigel^TM(1:25稀釋；BD Biosciences)包被1-2小時(shí)的無飼養(yǎng)層組織培養(yǎng)平板(BD Falcon)。在這種格式中，每隔一天細(xì)胞常規(guī)地接收新鮮的培養(yǎng)基并且當(dāng)融合達(dá)到66-75％時(shí)傳代，這通常發(fā)生在傳代后4-5天。隨著每一傳代，將細(xì)胞再解離為單細(xì)胞并且以1:5-1:10的稀釋傳代轉(zhuǎn)移至新的Matrigel^TM(BD Biosciences)包被的組織培養(yǎng)平板。對(duì)于界定，無生長(zhǎng)因子培養(yǎng)，將細(xì)胞懸浮液添加至預(yù)先用1％明膠(Mediatech)包被的組織培養(yǎng)平板。如上文所述的保持并且傳代細(xì)胞，除了SMC4培養(yǎng)基基本上無所有的細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子，包括bFGF之外。

出于冷凍的目的，將細(xì)胞解離為單細(xì)胞，重懸浮于添加了10％v/v DMSO(Mediatech)的SMC4+纖連蛋白中并且置于冷凍管(Nalgene)內(nèi)。一旦蓋上蓋子，就將冷凍管置于Mr.Frosty(Nalgene)內(nèi)并且在-80℃下保持過夜。第二天將冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮以長(zhǎng)期儲(chǔ)存。為解凍，將冷凍管置于37℃水浴大約1-2分鐘，直到大多數(shù)的冰融化。然后將解凍的細(xì)胞溶液與新鮮的常規(guī)hESC培養(yǎng)基輕微地混合并且以300g旋轉(zhuǎn)沉降5分鐘。將細(xì)胞溶液重懸浮在SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基中并且轉(zhuǎn)移至Matrigel^TM(BD Biosciences)包被的組織培養(yǎng)平板。隨著與所有其他的細(xì)胞培養(yǎng)孵育，細(xì)胞保持在設(shè)置成37℃與5％CO₂的濕潤(rùn)孵育箱中。

B.重新編程的誘導(dǎo)

為啟動(dòng)重新編程過程，使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或其他的方法諸如只有蛋白處理獲得重新編程因子(人Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28以及Nanog的可變組合)的異位表達(dá)。在大多數(shù)的情況下，將起始細(xì)胞以10％融合(即1x10⁵個(gè)細(xì)胞/6孔平板的孔)接種至明膠(Mediatech)包被的表面上。對(duì)病毒感染的方法而言，以1:2的稀釋將新近收集的慢病毒添加至起始細(xì)胞，添加4μg/mL聚凝胺(Millipore)，在32℃下以650g旋轉(zhuǎn)感染1.5小時(shí)。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至37℃與5％CO₂下再保持7小時(shí)。孵育完成后，用PBS洗滌細(xì)胞三次并且用新鮮的培養(yǎng)基供給。難以感染細(xì)胞，諸如無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)中的IMR90成纖維細(xì)胞，初始感染后48小時(shí)再重復(fù)一次這個(gè)過程。對(duì)誘導(dǎo)重新編程的非遺傳方法諸如直接的蛋白應(yīng)用至細(xì)胞的使用而言，將蛋白混合物或由重新編程因子組成的混合物以8μg/mL添加至細(xì)胞溶液并且在培養(yǎng)基變化前保持24小時(shí)。重復(fù)這一步驟額外的2-4次。所有起始細(xì)胞都培養(yǎng)在它們自己各自的體細(xì)胞培養(yǎng)基直到第4天后添加起始的蛋白，在這一點(diǎn)上，培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為一部分體細(xì)胞培養(yǎng)基與一部分常規(guī)的hESC培養(yǎng)基。根據(jù)融合(通常在4-6天)使細(xì)胞胰蛋白酶化，與相等部分的培養(yǎng)基混合，以300g旋轉(zhuǎn)沉降5分鐘，重懸浮在1:1體細(xì)胞的/常規(guī)的hESC培養(yǎng)基中并且以1:4-1:6擴(kuò)增至更大的培養(yǎng)平板。例如，6孔平板的兩個(gè)孔中的細(xì)胞通常擴(kuò)增到10cm皿上。擴(kuò)增后第二天，培養(yǎng)基完全轉(zhuǎn)換為常規(guī)的hESC培養(yǎng)基。一旦擴(kuò)增的細(xì)胞達(dá)到融合(通常在8-12天)，它們將進(jìn)行富集(參見獨(dú)特的群富集)。在所有的情況下，每隔一天常規(guī)地改變培養(yǎng)基。

C.獨(dú)特的群富集

在用各種策略，包括個(gè)體的慢病毒構(gòu)建體或包含Oct4和/或Klf4和/或Sox2和/或Myc的多順反子性載體誘導(dǎo)起始細(xì)胞重新編程并且培養(yǎng)大約8-12天(參見上文)后，細(xì)胞解離為單細(xì)胞(參見多能干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng))并且用各種多能性的表面標(biāo)志物、體細(xì)胞的標(biāo)志物和/或不完全的重新編程的標(biāo)志物將其染色。簡(jiǎn)而言之，解離的細(xì)胞重懸浮在包含漢克斯平衡鹽溶液(Invitrogen)、4％胎牛血清(Invitrogen)以及10mM Hepes(Invitrogen)的染色溶液中并且保持在冰上。按照制造商推薦的稀釋，將結(jié)合的第一抗體添加至細(xì)胞溶液并且在冰上孵育溶液15分鐘。洗滌細(xì)胞溶液，重懸浮在染色緩沖液中并且保持在冰上。在這一點(diǎn)上，采用各種富集/消耗策略，包括熒光激活的細(xì)胞分選(BD Biosciences,參見下文)與磁珠細(xì)胞分選(Miltenyi Biotec,參見下文)。

在FACS Aria(BD,Biosciences)上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選。按照說明，所用的第一抗體包括SSEA4(BD Biosciences)、Tra-181(Biosciences)、Tra-161(BD Biosciences)、CD30(BD Biosciences)以及CD50(BD Biosciences)。然后旋轉(zhuǎn)沉降分選的細(xì)胞并且重懸浮在SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至Matrigel^TM包被的組織培養(yǎng)平板。當(dāng)分選至微孔，即96孔平板時(shí)，以300g旋轉(zhuǎn)沉降平板2分鐘。每隔一天替換SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基持續(xù)3-4天。3-4天后，在培養(yǎng)剩余的時(shí)間里SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基通常被SMC4培養(yǎng)基取代。通常分選后7-9天可見到集落形成。在Guava EasyCyte 8HT(Millipore)上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行MACS微珠(Miltenyi Biotec)分離。簡(jiǎn)單地說，細(xì)胞解離為單細(xì)胞(參見多能干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng))并且用適當(dāng)?shù)腇ITC-結(jié)合的第一抗體，按照說明，包括SSEA4(BD Biosciences)、Tra-181(Biosciences)、Tra-161(BD Biosciences)、CD30(BD Biosciences)以及CD50(BD Biosciences)。然后細(xì)胞被抗FITC微珠(Miltenyi Biotec)磁性標(biāo)記。然后將標(biāo)記的細(xì)胞懸浮液裝載到LS MACS柱(Miltenyi Biotec)上。以300g旋轉(zhuǎn)沉降從陽(yáng)性或陰性選擇的部分收集的細(xì)胞5分鐘并且重懸浮在SMC4+纖連蛋白中，轉(zhuǎn)移至Matrigel^TM(BD Biosciences)包被的組織培養(yǎng)平板。翌日，將新鮮的培養(yǎng)基添加至培養(yǎng)物并且隨后每隔一天替換。3-4天后，在培養(yǎng)剩余的時(shí)間里SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基通常被SMC4培養(yǎng)基取代。通常分選后5-7天出現(xiàn)集落。

D.堿性磷酸酶染色

在4％v/v多聚甲醛(Alfa Aesar)中固定細(xì)胞30秒，用PBS洗滌三次并且用堿性磷酸酶染色試劑盒染色(Sigma-Aldrich)。簡(jiǎn)單地說，將1mL亞硝酸鈉溶液添加至1mL FRV-堿性溶液，混合并且在25℃下孵育2分鐘。然后將溶液與45mL H₂O混合，隨后添加1mL萘酚AS-BI堿性溶液。將堿性染色混合物添加至固定的細(xì)胞并且在25℃下孵育15分鐘隨后用PBS洗滌。然后在堿性磷酸酶存在的情況下給細(xì)胞計(jì)分。

E.免疫熒光染色

在4％v/v多聚甲醛(Alfa Aesar)中固定細(xì)胞15分鐘，用包含0.2％v/v吐溫(PBST)(Fisher Scientific)洗滌三次并且在25℃下使用0.15％v/v TritonX-100(Sigma-Aldrich)在PBS中滲透1小時(shí)。透化作用后，在25℃下用1％v/v牛血清白蛋白(BSA)(Invitrogen)的PBST(PBSTB)(Fisher Scientific)封閉細(xì)胞30分鐘。PBSTB溫和去除后，在4℃下將細(xì)胞與第一抗體在PBSTB中孵育過夜。本研究中所用的第一抗體包括Nanog(Abcam)、Tra-1-60(BD Biosciences)、Tra-181(BD Biosciences)、SSEA4(BD Biosciences)、β-III微管蛋白(R&D Systems)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(Sigma)以及Sox17(R&D Systems)。過夜孵育后，用PBST洗滌細(xì)胞三次并且在25℃下，以1:200稀釋在PBSTB中用第二抗體(Alexa 488 or 555；Invitrogen)染色1小時(shí)。在PBST中洗滌細(xì)胞三次并且用Hoechst染料(Invitrogen)染色。使用熒光顯微鏡或CCD照相機(jī)捕獲染色細(xì)胞的圖像。

F.分化誘導(dǎo)與畸胎瘤形成

無飼養(yǎng)層iPSC分化為單層與擬胚體。對(duì)單層分化而言，轉(zhuǎn)變分化培養(yǎng)基之前允許iPSC達(dá)到接近融合，因?yàn)橐坏┓只?xì)胞通常減少它們的增生。簡(jiǎn)單地說，一旦融合，SMC4培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變?yōu)榘珼MEM/F12(Mediatech)、20％胎牛血清(Invitrogen)、1％非必需氨基酸(Mediatech)、2mM左旋谷氨酰(Mediatech)以及100μMβ-巰基乙醇的分化培養(yǎng)基。一旦培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變，就允許iPSC分化14天。每2-3天改變培養(yǎng)基。對(duì)胚體(“EB”)形成與分化而言，hiPSC為用Accutase(Millipore)解離的單細(xì)胞并且以最終的濃度75,000個(gè)細(xì)胞/mL重懸浮在分化培養(yǎng)基中，添加5μM Thiazovivan。細(xì)胞以100μL/孔接種于V底96孔非組織培養(yǎng)平板(Nunc)并且以950g用離心機(jī)分離5分鐘。第二天，使用P1000以大約30-40EBs/孔將緊密的“球樣團(tuán)塊”轉(zhuǎn)移至超低結(jié)合的6孔平板(Corni ng)。7天后，以1:1轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移EBs至Matrigel包被的6孔平板。培養(yǎng)3周后，將細(xì)胞固定并且染色。

通過應(yīng)用的干細(xì)胞(Menlo Park,CA)進(jìn)行畸胎瘤抑制與分析。簡(jiǎn)單地說，將1000,000-2000,000個(gè)單細(xì)胞解離的hiPSC混合在添加了培養(yǎng)基與100μL Matrigel的100μL SMC4培養(yǎng)基中并且引入至腎被膜與淺褐色SCID小鼠的睪丸。收獲發(fā)育的畸胎瘤，將其切片并且分析各種分化的細(xì)胞類型與結(jié)構(gòu)。

G.RT-qPCR與qPCR分析

使用PicoPure RNA分離試劑盒(MDS Analytical Technologies)分離RNA，使用iScript cDNA合成試劑盒(Bio-Rad)0.5μg RNA用于產(chǎn)生cDNA的第一鏈。使用TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)與以下表3中所列的FAM標(biāo)記的TaqMan探針測(cè)定相對(duì)基因表達(dá)水平。

表3.ABI引物與探針

H.基因表達(dá)分析

使用Pico Pure RNA分離試劑盒(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)從細(xì)胞分離總RNA。簡(jiǎn)而言之，使用MessageAmp IIαRNA放大試劑盒(Applied Biosystems/Ambion,Austin,TX)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案，利用任選的第二輪放大，然后使用MessageAmp II生物素增強(qiáng)試劑盒(Applied Biosystems/Ambion,Austin,TX)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案轉(zhuǎn)錄到生物素標(biāo)記的αRNA，制備生物素化的αRNA。根據(jù)Affymetrix推薦純化生物素標(biāo)記的αRNA并使其成碎片。45℃下，20μg片段的αRNA用于與人基因組U133 Plus 2.0芯片(Affymetrix Inc.Santa Clara,CA)雜交16小時(shí)。洗滌陣列并且在Affymetrix孵育裝置450中染色，使用Affymetrix基因芯片掃描儀3000 7G掃描。使用Affymetrix表達(dá)控制臺(tái)軟件，應(yīng)用缺省分析設(shè)置分析圖像數(shù)據(jù)。通過對(duì)數(shù)分度強(qiáng)大的多陣列分析(RMA)標(biāo)準(zhǔn)化陣列，并且在針對(duì)基因組3.1的Spotfire(Tibco Spotfire,Palo Alto,CA)中使其形象化。

I.核型分析與拷貝數(shù)變異分析

在20G帶解離中期相細(xì)胞上，通過位于Madison,WI細(xì)胞系遺傳學(xué)進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析。

通過WiCell(Madison,WI)進(jìn)行高分辨率比較基因組雜交(NimbleGen 12x135k)以及隨后的拷貝數(shù)變異分析。

實(shí)施例2：細(xì)胞培養(yǎng)條件與方法以使無飼養(yǎng)層培養(yǎng)環(huán)境與酶促的單細(xì)胞能夠解離以及多能干細(xì)胞的傳代

本實(shí)施例涉及多能細(xì)胞群的培養(yǎng)與解離。此類細(xì)胞群包括但不限于，胚胎干細(xì)胞與誘導(dǎo)性多能細(xì)胞，諸如通過體細(xì)胞核移植(SCNT)或經(jīng)由多能性因子-誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)的引入所產(chǎn)生的那些。多能干細(xì)胞培養(yǎng)條件傳統(tǒng)上包括飼養(yǎng)層細(xì)胞的使用，飼養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)由輻照或絲裂霉素C處理使有絲解離失活，但是提供了支持干細(xì)胞培養(yǎng)所需的生長(zhǎng)因子與營(yíng)養(yǎng)素。不使用飼養(yǎng)層細(xì)胞的干細(xì)胞群的培養(yǎng)對(duì)于研究與工業(yè)應(yīng)用是有利的，其中同源的干細(xì)胞群是必需的或其中換算，工業(yè)行為需要無異種的，特定的干細(xì)胞產(chǎn)生培養(yǎng)條件。在本實(shí)施例中，測(cè)試幾個(gè)特異的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的小分子調(diào)節(jié)劑以建立，如果個(gè)體的小分子或小分子的組合(“混合物”)可用于增強(qiáng)多能細(xì)胞在無飼養(yǎng)層系統(tǒng)中的培養(yǎng)。

當(dāng)培養(yǎng)多能細(xì)胞群不使用飼養(yǎng)層反而使用更多確定的細(xì)胞外基質(zhì)諸如常規(guī)的hESC細(xì)胞培養(yǎng)基中的Matrigel^TM(諸如表1與2的第一部分中所述的常規(guī)的/基礎(chǔ)的培養(yǎng)基制)不支持細(xì)胞活力與多能性(圖1)。然而，Rock激酶的小分子抑制劑的使用提高了在這些條件下的細(xì)胞活力。而且，MAP激酶,TGFβ以及Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的小分子抑制劑的使用在缺乏飼養(yǎng)層的情況下保持細(xì)胞的多能性質(zhì)，盡管可能會(huì)注意到細(xì)胞活力中的變化。Rock激酶抑制劑的組合，與MEK、TGFβ以及GSK3抑制劑組合都保持多能干細(xì)胞的活力與多能性，當(dāng)培養(yǎng)在無飼養(yǎng)層環(huán)境中時(shí)。

多能細(xì)胞，諸如ESC或iPSC通常生長(zhǎng)為團(tuán)塊。傳統(tǒng)上，通過本領(lǐng)域中熟練的研究人員所識(shí)別的形態(tài)人工選擇集落這些細(xì)胞擴(kuò)增并且傳代。本文的實(shí)施例1描述了此類程序(描述為團(tuán)塊傳代)。然后將選擇的集落打碎并且將解離的細(xì)胞再接種于平板。多能細(xì)胞群的快速擴(kuò)增得益于酶促的、單細(xì)胞傳代的使用。諸如胰蛋白酶與accutase的酶通常用于傳代期間細(xì)胞的單細(xì)胞解離。

在特定的演示中，iPSC細(xì)胞顯示了顯著的活力下降當(dāng)酶促傳代并且作為單細(xì)胞平板接種在無飼養(yǎng)層環(huán)境中時(shí)，如通過圖3B中的7AAD合并可以見到。通過使用包含培養(yǎng)基組分諸如表1與2中所列的那些的本發(fā)明的培養(yǎng)平臺(tái)，將多能細(xì)胞群培養(yǎng)在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)基中并且酶促地解離單細(xì)胞傳代，極大地提高了細(xì)胞的活力以及多能性的保持。更具體地說，通過使用常規(guī)的/基礎(chǔ)的hESC培養(yǎng)基制劑與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路諸如MAP激酶通路、TGFβ通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白通路以及Rho/Rock通路的調(diào)節(jié)劑的組合，在需要單細(xì)胞解離與無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的應(yīng)用期間保持了多能干細(xì)胞的活力與多能性。

如圖2中所示，無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基上所產(chǎn)生的并且使用團(tuán)塊傳代的iPSC為使用諸如accutase的酶解離的單細(xì)胞并且作為單細(xì)胞平板接種于無飼養(yǎng)層系統(tǒng)中，諸如在Matrigel^TM與表1中所述的SMC4或SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基組合物的使用。只有當(dāng)將解離的細(xì)胞置于包含使用這些培養(yǎng)基中所述的小分子的組合的培養(yǎng)基中時(shí)，保持細(xì)胞活力。常規(guī)培養(yǎng)基的使用，諸如表1中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基制劑，導(dǎo)致了大量的細(xì)胞損失當(dāng)多能細(xì)胞酶促地解離為單細(xì)胞并且平板接種在無飼養(yǎng)層環(huán)境中時(shí)。一旦細(xì)胞適應(yīng)了無飼養(yǎng)層培養(yǎng)基與單細(xì)胞傳代，它們就以這種與SMC4培養(yǎng)基使用的方式不斷地保持。適應(yīng)無飼養(yǎng)層、但細(xì)胞傳代條件的hiPSC細(xì)胞的全部特征顯示于圖3中。多重傳代后保持這些細(xì)胞的多能狀態(tài)：通過免疫熒光與基因表達(dá)鑒定多能性標(biāo)志物。而且，約99.8％的細(xì)胞保持SSEA4與Tra1-81陽(yáng)性染色，如通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。這些細(xì)胞的基因表達(dá)譜與飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的人ESC相似。保持hiPSC中的轉(zhuǎn)基因沉默，核型為正常的并且與在飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)的相同的克隆一樣。而且，以這種方式傳代及保持的hiPSC分化為三個(gè)胚層，如通過體外分化與畸胎瘤形成(圖3I與3J)所示。

實(shí)施例3：細(xì)胞培養(yǎng)條件與方法以使多能細(xì)胞能夠單細(xì)胞分選同時(shí)保持多能性與細(xì)胞活力

如實(shí)施例2中所述的，ESC或iPSC的干細(xì)胞培養(yǎng)物常規(guī)培養(yǎng)在飼養(yǎng)層細(xì)胞上并且通過細(xì)胞集落的人工選擇然后在平板再接種前細(xì)胞集落機(jī)械地解離傳代。熟練的研究人員基于集落形態(tài)能夠識(shí)別具有多能的、非分化的特征的干細(xì)胞集落并且使用這種作為選擇多能細(xì)胞的一種方法。因此可以挑選并且人工地從其中一些細(xì)胞具有不太理想的特征的細(xì)胞群，諸如在培養(yǎng)或死細(xì)胞的團(tuán)塊中顯示分化跡象的細(xì)胞，富集多能群或具有理想特征的群。這種過程是辛苦的并且取決于熟練的研究人員挑選理想的細(xì)胞群。其中根據(jù)理想的特征單獨(dú)地選擇細(xì)胞細(xì)胞富集或分選技術(shù)的使用對(duì)本領(lǐng)域大有裨益。使用目前可獲得的技術(shù)，諸如磁性激活細(xì)胞分選(MACS)或熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)，此類富集步驟將需要在富集前多能細(xì)胞群的酶促傳代至單細(xì)胞格式并且接種回到培養(yǎng)基。而且，飼養(yǎng)層支持的培養(yǎng)物的使用對(duì)這些技術(shù)不太理想，因此有必要使用無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)。

在具體的實(shí)施方案中，使用如表1中所述的本發(fā)明的培養(yǎng)基組分以及實(shí)施例1與2中所述的方法，多能細(xì)胞群為解離的單細(xì)胞，使用細(xì)胞分選過程，諸如磁性激活細(xì)胞分選(MACS)或熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)富集并且接種在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)上而沒有損失多能性或細(xì)胞活力。

在具體的實(shí)例中，如圖4中所示，通過基于對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物SSEA4⁺/Tra181⁺陽(yáng)性的細(xì)胞選擇及分選解離的多能細(xì)胞保持在SMC4培養(yǎng)基(表1)中的單細(xì)胞群。這些表面抗原通常用作多能性標(biāo)志物。然后將分選的雙陽(yáng)性的群轉(zhuǎn)移至無飼養(yǎng)層培養(yǎng)(Matrigel^TM ECM包被)并且在轉(zhuǎn)回到SMC4培養(yǎng)基(表1)之前允許生長(zhǎng)在SMC4培養(yǎng)基(表1)或SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基2-4天。分選24小時(shí)內(nèi)見到細(xì)胞分裂并且分選后第5天細(xì)胞接近融合。分選的細(xì)胞為培養(yǎng)另外5次傳代的單細(xì)胞并且顯示不但表達(dá)未分化狀態(tài)的標(biāo)志物而且代表基本上純凈的多能細(xì)胞群，根據(jù)SSEA4⁺/Tra181⁺細(xì)胞雙染色流式細(xì)胞術(shù)(圖4B與4C)判斷。

在培養(yǎng)期間多能干細(xì)胞的富集與分選的實(shí)例中，對(duì)Tra181陽(yáng)性的細(xì)胞而言，富集包含多能的與分化細(xì)胞的培養(yǎng)，然后Tra181⁺細(xì)胞的傳代繼續(xù)保持純凈的多能干細(xì)胞群(圖17C)。

研究多能細(xì)胞的單細(xì)胞分選的效率。如圖4D與E中所見到的各種分選后事件數(shù)目，如通過FACS儀器所測(cè)量的，使用SMC4培養(yǎng)基或SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基平板接種于無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)，并且對(duì)堿性磷酸酶陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量計(jì)分。堿性磷酸酶為多能集落形成的早期誘導(dǎo)劑。量化的分選后接種效率，如通過堿性陽(yáng)性的集落數(shù)/接種的細(xì)胞數(shù)所示，在這個(gè)系統(tǒng)中見到大約8-10％(圖4E)。在其他的多能細(xì)胞群的保持中單細(xì)胞分選的潛能的演示，iPSC培養(yǎng)為解離的、對(duì)多能性標(biāo)志物SSEA4與Tra181特異的結(jié)合熒光的抗體標(biāo)記的單細(xì)胞，應(yīng)用于FACS并且基于這些標(biāo)記選擇。以1-9個(gè)事件/孔從FACS儀器直接平板接種選擇的SSEA4⁺/Tra181⁺細(xì)胞至96孔平板。盡可能少的1事件/孔產(chǎn)生克隆的堿性磷酸酶-陽(yáng)性的集落(圖4F與4G)。因此，此類單細(xì)胞分選系統(tǒng)用于多能細(xì)胞的克隆選擇，基于優(yōu)選與某些細(xì)胞表面標(biāo)志物有關(guān)的特征。

實(shí)施例4：方法與條件以使有效的細(xì)胞重新編程能夠無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)中多能狀態(tài)

iPSC用于工業(yè)的和/或臨床的應(yīng)用的用途使細(xì)胞在完全確定的培養(yǎng)條件，特別是無異種的條件中細(xì)胞的產(chǎn)生、選擇以及保持成為必要。因此，無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件中的細(xì)胞重新編程是高度理想的。然而，雖然由于經(jīng)由皮膚活檢或毛囊的通路，成纖維細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞為最常用的用于重新編程的細(xì)胞類型，這些細(xì)胞類型重新編程的效率非常低，并且還要證明無飼養(yǎng)層培養(yǎng)中這些細(xì)胞重新編程的有效方法。

如實(shí)施例2中所述，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路-特異地MAP激酶通路、TGFβ通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白通路以及Rho/Rock通路的抑制劑存在的情況下，常規(guī)的hESC干細(xì)胞培養(yǎng)基使多能培養(yǎng)物在缺乏飼養(yǎng)層細(xì)胞的情況下能夠生長(zhǎng)并且保持以及使用酶促的單細(xì)胞傳代擴(kuò)增這些培養(yǎng)物。在本實(shí)施例中，iPSC細(xì)胞產(chǎn)生于缺乏飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中。具體地，人成纖維細(xì)胞被表達(dá)多能性因子Oct4、KLF4、Sox2以及C-myc的病毒感染。如實(shí)施例1中所述的與平板接種在Matrigel^TM的細(xì)胞而不是飼養(yǎng)層細(xì)胞一起進(jìn)行重新編程實(shí)驗(yàn)方案。

與由無飼養(yǎng)層細(xì)胞重新編程相比，使用常規(guī)的hESC干細(xì)胞培養(yǎng)基或添加了SMC4培養(yǎng)基(表1)中所列的特異性通路調(diào)節(jié)劑的常規(guī)的hESC培養(yǎng)基。如圖5中可以見到的，使用個(gè)體的慢病毒表達(dá)Oct4、Klf4、Sox2以及Myc，誘導(dǎo)重新編程后，在添加了SMC4培養(yǎng)基的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)中見到許多iPSC樣集落而在單獨(dú)的常規(guī)的hESC培養(yǎng)基中保持的培養(yǎng)物中很少見到或見不到集落。SMC4培養(yǎng)基中產(chǎn)生的集落的隨后的特征顯示它們?cè)S多為真正的iPSC集落。通過多能性標(biāo)志物Oct4、Nanog、Sox2、KLF4、SSEA4以及TRA 1-81的表達(dá)測(cè)定細(xì)胞的多能性，使用免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)以及基因表達(dá)譜(圖13C-E)。而且，細(xì)胞顯示有效地分化為所有三個(gè)胚層當(dāng)培養(yǎng)在分化培養(yǎng)基中時(shí)。因此，通過本發(fā)明證明了無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)中iPSC的有效產(chǎn)生。這種方法的效率，與其他的重新編程方法的比較，描述于實(shí)施例8與表4中。

實(shí)施例5.用于產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)組合物與原初狀態(tài)的多能細(xì)胞的保持

最近的研究已證明通過表觀遺傳重新編程，終末分化細(xì)胞具有求助于祖細(xì)胞狀狀態(tài)(Xie,H.,Ye,M.,Fe ng,R.以及Graf,T.2004)，不同的分化細(xì)胞狀態(tài)(Szabo,Bhatia 2010)或甚至回到胚胎狀狀態(tài)(Takahashi等,2006)，諸如iPSC的能力。盡管iPSC的產(chǎn)生已變得更加常規(guī)，給定實(shí)驗(yàn)中只有很小百分比的體細(xì)胞重新編程為iPSC。歸因于這種低效率的幾個(gè)參數(shù)包括體細(xì)胞的增生狀態(tài)，導(dǎo)致基因激活或抑制的額外的突變形成，基因送遞的格式以及環(huán)境線索。也已報(bào)道了不是所有鑒定為iPSC的細(xì)胞與ESC表現(xiàn)相似。例如，基因表達(dá)譜已證明了許多iPSC顯示了在它們的ESC相對(duì)物表達(dá)譜方面顯著的差異。另外，Xist活性的研究與X染色體再激活分析顯示雖然一些ESC處于原初狀態(tài)(即多能性的基態(tài))，大多數(shù)，如果不是所有衍生的iPSC處于成熟的狀態(tài)(即成熟為分化)。組合的，這些差異可有助于減少的多能性與對(duì)于特定的細(xì)胞類型iPSC分化中低效率，減小了再生醫(yī)學(xué)中iPSC的值。

通過把涉及原初的與成熟的狀態(tài)后面的機(jī)制的關(guān)鍵的細(xì)胞通路作為目標(biāo)，本發(fā)明人已證實(shí)了轉(zhuǎn)變以成熟的狀態(tài)存在的包括常規(guī)的iPSC的多能干細(xì)胞為原初狀態(tài)的能力。使用表1與2中所列的培養(yǎng)基組分，可能的是此類成熟的多能細(xì)胞與常規(guī)的iPSC進(jìn)一步重新編程為原初狀態(tài)。更具體地，通過在包含細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)劑，諸如MAP激酶通路、TGFβ通路和/或Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的培養(yǎng)基中重新編程體細(xì)胞或培養(yǎng)iPSC,產(chǎn)生的或培養(yǎng)的iPSC的基因表達(dá)信號(hào)變得比常規(guī)的iPSC(常規(guī)的培養(yǎng)基中并且未與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)劑接觸所產(chǎn)生和/或培養(yǎng)的iPSC)更像ESC。如分級(jí)群聚中所示，常規(guī)的培養(yǎng)基與衍生hiPSC的SMC4培養(yǎng)基彼此相似并且不同于它們的親代系IMR90(圖6B)。然而，當(dāng)SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)的iPSC平板接種回到飼養(yǎng)層細(xì)胞時(shí)，它們比常規(guī)培養(yǎng)的iPSC更緊密地類似小鼠ESC，原初狀態(tài)的另一個(gè)論證(圖6E)。而且，SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)的iPSC顯著地減小了Xist活性并且增強(qiáng)X染色體的基因表達(dá)(圖6C與6D)。最終，SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)的iPSC，不但分化為所有三個(gè)胚層，而且證明了再激活與胚胎外細(xì)胞有關(guān)的基因的能力，只保留原初狀態(tài)中細(xì)胞的能力(圖3H)。因此，SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，包括以成熟的狀態(tài)存在的iPSC，促進(jìn)了原初狀態(tài)并且增強(qiáng)分化潛能。

為測(cè)定使用添加SMC4的培養(yǎng)基與細(xì)胞分選平臺(tái)所產(chǎn)生的hiPSC克隆的多能狀態(tài)(圖7)，hiPSC衍生于相同的起始成纖維細(xì)胞系與表達(dá)Oct4、Klf4以及Myc的3-因子多順反子性載體但是保持在常規(guī)培養(yǎng)下，包括團(tuán)塊傳代與飼養(yǎng)層細(xì)胞(FTi99)。進(jìn)行各種克隆以及來源于hESC的mRNA的Affymetrix全球基因表達(dá)分析(圖7B)?？梢姷剿卸嗄芗?xì)胞系具有與對(duì)照的成纖維細(xì)胞系(FTC1,Pearson得分0.886)不同的譜系并且彼此基本上相似的表達(dá)譜系(Pearson得分0.969)。產(chǎn)生的熱圖簽名代表hESC/FTi99(飼養(yǎng)層細(xì)胞與常規(guī)培養(yǎng)基上產(chǎn)生并且保持的hESC或hiPSC)與FTi91/FTi93(無飼養(yǎng)層與SMC4培養(yǎng)基上產(chǎn)生與保持的hiPSC)組(圖7C)間4倍差異性表達(dá)的1739個(gè)探針。1739個(gè)差異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄內(nèi)基因的深度分析中鑒定了一個(gè)感興趣的趨勢(shì)：雖然通常與原初狀態(tài)有關(guān)的幾個(gè)多能性基因在FTi91/FTi93組中被上調(diào)，更顯著地，與成熟狀態(tài)有關(guān)的許多分化基因在這個(gè)組內(nèi)被抑制(圖7D)。SMC4培養(yǎng)基所產(chǎn)生的hiPSC的全分析提示培養(yǎng)條件在決定未分化狀態(tài)方面發(fā)揮了更有影響力的作用，相對(duì)于起始細(xì)胞系或衍生策略。數(shù)據(jù)也提示來自或適應(yīng)SMC4培養(yǎng)條件的克隆展示了與優(yōu)選的質(zhì)量有關(guān)的原初特征，諸如與早期譜系標(biāo)志物的減小的表達(dá)一起高度未分化狀態(tài)(圖7E)。

實(shí)施例6：鑒定真正的hiPSC的抗體混合物的鑒定

研究多能干細(xì)胞表面標(biāo)志物。除了SSEA4與Tra181表達(dá)以外，也鑒定了CD30與CD50的表達(dá)并且認(rèn)為代表額外的多能性表面標(biāo)志物(圖10)。用具有真正的多能性標(biāo)志物，諸如Nanog表達(dá)的很少數(shù)細(xì)胞鑒定使用代表各種潛能狀態(tài)的多順反子性慢病毒表達(dá)Oc4、Klf4以及Sox2重新編程的細(xì)胞。迄今為止，沒有基于表面標(biāo)志物表達(dá)鑒定真正多能的hiPSC的可靠的方法。例如，如圖11中所見，一些鑒定為針對(duì)SSEA4、Tra181以及CD9陽(yáng)性的克隆群不表達(dá)Nanog，并且被錯(cuò)誤地鑒定為hiPSC。

目前的發(fā)明提供了鑒定表達(dá)Nanog，一個(gè)真正多能的細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞群的細(xì)胞表面標(biāo)志物的組合。具體地，針對(duì)CD30、SSEA4以及Tra181表面標(biāo)志物陽(yáng)性的細(xì)胞鑒定表達(dá)Nanog的細(xì)胞(圖11)。本研究證明了CD30/SSEA4/Tra181表達(dá)的組合代表與Nanog表達(dá)與真正多能的hiPSC相關(guān)的表面標(biāo)志物的獨(dú)特組合。

在其他增加的富集的實(shí)例中，分選進(jìn)行重新編程的細(xì)胞群以鑒定針對(duì)CD13表面標(biāo)志物表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞并且將這些CD13⁺細(xì)胞從重新編程的細(xì)胞群移除。關(guān)聯(lián)體細(xì)胞的CD13⁺群與非重新編程的細(xì)胞，以及消耗CD13⁺細(xì)胞的重新編程的細(xì)胞群增強(qiáng)了SSEA4/Tra181陽(yáng)性細(xì)胞的富集(圖12)。如圖12中所示，當(dāng)使用表達(dá)Oct4、Klf4以及Sox2的多順反子性載體重新編程體細(xì)胞21天時(shí)，建立各種不同的表面標(biāo)志物表達(dá)模式的細(xì)胞，只有一個(gè)小的細(xì)胞子集代表了SSEA4與Tra181陽(yáng)性細(xì)胞(虛線箭頭，圖12)。然而，當(dāng)基于CD13表達(dá)(實(shí)線箭頭，圖12)首次評(píng)估相同的群時(shí)，針對(duì)CD13陰性的群子集(即CD13細(xì)胞的耗盡)代表了已顯著地富集了SSEA4與Tra181表達(dá)細(xì)胞的群(11.04％，圖12)。與此相反，表達(dá)CD13高水平的細(xì)胞子集代表表達(dá)SSEA4與Tra181的少數(shù)細(xì)胞(1.14％,圖12)。

實(shí)施例7：來源于分化細(xì)胞的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的產(chǎn)生中單細(xì)胞分選的使用

如圖8A中所見，重新編程過程中早期的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，其中使用個(gè)體的表達(dá)Oct4、Klf4、Sox2以及myc的慢病毒誘導(dǎo)重新編程，包含形態(tài)不同的細(xì)胞的集落。這些細(xì)胞的一些針對(duì)多能性標(biāo)志物染色陽(yáng)性而其他的僅為轉(zhuǎn)化的、快速生長(zhǎng)的細(xì)胞。在重新編程的這個(gè)階段，尚不清楚由單獨(dú)的細(xì)胞形態(tài)其細(xì)胞集落將繼續(xù)形成iPSC。更快的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化但不是多能細(xì)胞迅速占據(jù)培養(yǎng)基。因此有利的是具有在重新編程過程早期選擇iPSC的富集步驟。而且，如圖8中所示，重新編程過程期間一些集落表達(dá)幾個(gè)多能性標(biāo)志物，并且為真正的iPSC，而一些集落未完全地重新編程并且只表達(dá)一些多能性標(biāo)志物。圖8B中集落1針對(duì)SSEA4與Tra181陽(yáng)性的，而集落4與5只針對(duì)一個(gè)或另一個(gè)標(biāo)志物陽(yáng)性。因此，同時(shí)地使用多能性的細(xì)胞表面標(biāo)志物或幾個(gè)標(biāo)志物而不是通過集落形態(tài)選擇多能細(xì)胞，這是更有效率的且更少技術(shù)上挑戰(zhàn)的。

本文也提供了使用本文所述的與細(xì)胞富集和/或分選方法組合的細(xì)胞培養(yǎng)組分，可能的是通過重新編程過程期間選擇顯示多能性的表面標(biāo)志物的個(gè)體的細(xì)胞，以更多數(shù)量并且在更短的時(shí)間段內(nèi)衍生的iPSC。更具體地，如圖9A與B中概要所示，使用本發(fā)明的方法進(jìn)行重新編程期間使用單細(xì)胞分選與基于多能性標(biāo)志物的富集的兩條iPSC的產(chǎn)生途徑。

途徑A中，啟動(dòng)重新編程后，產(chǎn)生各種潛能狀態(tài)的混合細(xì)胞群?；旌系募?xì)胞群包含分化細(xì)胞、部分重新編程的細(xì)胞、重新編程的細(xì)胞以及進(jìn)行重新編程的細(xì)胞。使用諸如磁珠分選或流式細(xì)胞術(shù)分選表達(dá)多能性標(biāo)志物諸如SSEA4的細(xì)胞(參見實(shí)施例1方法)富集細(xì)胞群。一旦富集，細(xì)胞就保持在SMC4培養(yǎng)基中(表1)或在具體的實(shí)施方案中，SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基大約3天隨后SMC4培養(yǎng)基，并且大約6-10天的培養(yǎng)期后，基于諸如SSEA4與TRA181的活的培養(yǎng)物標(biāo)志物染色鑒定iPSC集落，挑選并且分選用于克隆擴(kuò)增(圖9)。

在途徑B示意圖(圖9)下，重新編程啟動(dòng)后早期，分選混合的細(xì)胞群以獲得稀少的針對(duì)兩種或多種多能性標(biāo)志物陽(yáng)性的細(xì)胞群。此類標(biāo)志物包括但不限于SSEA4與TRA181。將表達(dá)多能性標(biāo)志物的組合的選擇的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至添加了飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)或無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)，特別是添加了表1與2中所述的細(xì)胞培養(yǎng)基組分的那些。用這種方法，與早先描述的方法相比，顯著減少的時(shí)間線與技術(shù)壁壘產(chǎn)生了iPSC集落。

在這種技術(shù)的具體示范中，IMR90成纖維細(xì)胞被表達(dá)Oct4、Sox2、Klf4以及c-Myc的慢病毒感染(OSKM)。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)幾天后，重新編程細(xì)胞從它們的體細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到添加了SMC4培養(yǎng)基的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)(表1)。重新編程啟動(dòng)后第8天，通過流式細(xì)胞術(shù)分析見到感染的細(xì)胞群以包含表達(dá)多能性標(biāo)志物SSEA4的適度的亞細(xì)胞群(圖13A)。使用如實(shí)施例1中所述的磁性激活的細(xì)胞分選，富集表達(dá)SSEA4細(xì)胞3倍的多能細(xì)胞群(圖13A)。富集針對(duì)SSEA4表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞后，將分選的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包含Matrigel^TM并且添加了常規(guī)的hESC培養(yǎng)基或SMC4培養(yǎng)基或在具體的實(shí)施方案中，SMC4+纖連蛋白培養(yǎng)基的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)。培養(yǎng)物的堿性磷酸酶染色顯示MEK、GSK3、Rock激酶以及TGFβ的小分子抑制劑的使用支持使用單細(xì)胞分選多能細(xì)胞的富集而常規(guī)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基不能(圖13A)。

三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的定量明確證明了只有在小分子抑制劑存在的情況下通過單細(xì)胞分選的多能細(xì)胞選擇(圖13B)。進(jìn)一步在SMC4培養(yǎng)基中培養(yǎng)用這種方法富集的細(xì)胞集落并且表征為真正的iPSC：免疫熒光與流式細(xì)胞術(shù)中，針對(duì)多能性標(biāo)志物SSEA4與Tra181，染色陽(yáng)性的真正的iPSC(圖13C與D)；顯示與人ESC相似的基因表達(dá)譜(圖13E)；顯示顯著的外源性轉(zhuǎn)基因的沉默(圖13F)并且能夠分化為所有三個(gè)胚層(圖13G)。當(dāng)使用相同的實(shí)驗(yàn)方案但用常規(guī)的培養(yǎng)條件(由包含飼養(yǎng)層細(xì)胞與缺乏的SMC4的常規(guī)培養(yǎng)基組成)時(shí)很少觀察到多能細(xì)胞集落。因此細(xì)胞重新編程期間，基于多能性的細(xì)胞表面標(biāo)志物，使用單細(xì)胞分選強(qiáng)力地富集多能細(xì)胞群的能力取決于表1與2中所列的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑與添加劑的使用。另外，當(dāng)添加的纖連蛋白用于培養(yǎng)系統(tǒng)中3天時(shí)，觀察到提高的分選后接種。也針對(duì)其他起始的細(xì)胞類型包括人脂肪源性干細(xì)胞完成這種重新編程過程。

在技術(shù)的其他實(shí)例中，F(xiàn)ACS用作從非重新編程的、部分重新編程的以及完全重新編程的細(xì)胞的混合物富集多能細(xì)胞群。與前面的實(shí)例一樣，IMR90成纖維細(xì)胞被表達(dá)Oct4、Sox2、Klf4/c以及Myc的慢病毒(OSKM)感染。成纖維細(xì)胞感染后幾天將細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)換至SMC4培養(yǎng)基中無飼養(yǎng)層培養(yǎng)。感染的細(xì)胞群包含對(duì)多能性的SSEA4與Tra181標(biāo)志物陽(yáng)性的適度的細(xì)胞群(圖14A)。選擇對(duì)兩種多能性標(biāo)志物陽(yáng)性的細(xì)胞并且從針對(duì)兩個(gè)標(biāo)志物陰性的或只針對(duì)一個(gè)標(biāo)志物陽(yáng)性的細(xì)胞分選出來。隨后的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)與添加如表1或2中所述的培養(yǎng)基的比較來自于針對(duì)兩種標(biāo)志物陽(yáng)性的細(xì)胞的培養(yǎng)物形成隨后表征為多能iPSC的集落而通過FACS門控針對(duì)多能性標(biāo)志物陰性的細(xì)胞不產(chǎn)生堿性磷酸酶陽(yáng)性的集落(圖14A,B)。更具體地，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MEK、GSK、Rock以及TGFβ的抑制劑作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基制劑的添加劑促進(jìn)了FACS在重新編程過程早期分選選擇與多能細(xì)胞富集中的使用。另外，當(dāng)添加的纖連蛋白用于培養(yǎng)系統(tǒng)3天時(shí)觀察到提高的分選后接種。

SMC4培養(yǎng)基與培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)其次用于發(fā)展高通量產(chǎn)生無飼養(yǎng)層與克隆衍生的hiPSC的方法。設(shè)計(jì)方案以處理誘導(dǎo)的細(xì)胞與SMC4培養(yǎng)基重新編程并且選擇如通過多能性標(biāo)志物的組合所示忠實(shí)地重新編程稀少的個(gè)體細(xì)胞。而且，我們將重新編程過程與多重平臺(tái)連接以基于雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)的選擇測(cè)定、qRTPCR以及免疫熒光(圖15)有效地選擇頂級(jí)克隆。

在優(yōu)化的多重實(shí)驗(yàn)方案中，使用3因子(OKS)多順反子性病毒啟動(dòng)重新編程，感染后第20天隨后在第30天通過FACS分選SSEA4⁺/Tra181⁺細(xì)胞至96孔平板(圖15與B)完成SSEA4⁺/Tra181⁺群的最初的大部分FACS分選。這種策略考慮到許多克隆的衍生并且導(dǎo)致表達(dá)多能性標(biāo)志物，展示外源基因活性衰減以及Oct4啟動(dòng)子的去甲基化作用(圖15A-C)的克隆FTC1克隆1與2的產(chǎn)生。通過體外與體內(nèi)分化為三個(gè)體細(xì)胞譜系(圖15D,E)，F(xiàn)TC1克隆1與2也顯示了多能的。也評(píng)估選擇的克隆染色體完整性并且顯示與它們親代細(xì)胞系與正常的核型甚至在FF培養(yǎng)中20次連續(xù)的單細(xì)胞傳代后具有最小的拷貝數(shù)變異，超過其他重新編程的策略顯著的改善(圖17)。

為測(cè)定平臺(tái)的再生性，使用表達(dá)Oct4、Klf4及Sox2的多順反子性載體誘導(dǎo)額外的成纖維細(xì)胞系、FTC5以及FTC7重新編程并且應(yīng)用于如圖15中所述的高通量平臺(tái)。如圖18中所述，衍生于FTC5與FTC7成纖維細(xì)胞系的集落顯示保持它們的未分化狀態(tài)，保留它們的多能性以及基因組穩(wěn)定性。因此，3種多能性因子、SMC4培養(yǎng)基以及多重特征化平臺(tái)的組合顯著增強(qiáng)了無飼養(yǎng)層重新編程的動(dòng)力學(xué)而同時(shí)以高通量的方式能夠鑒定、選擇以及擴(kuò)增克隆衍生的與基因組穩(wěn)定的hiPSC。

實(shí)施例8：用于多重iPSC克隆的快速產(chǎn)生的方法與培養(yǎng)組分

通過多能性基因諸如Oct4、Sox2、Klf4、c-myc、Lin28以及Nanog的異位表達(dá)人iPSC的產(chǎn)生為效率低的且技術(shù)要求高的過程。涉及多能性因子轉(zhuǎn)基因的慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒整合至宿主細(xì)胞基因組，與包括飼養(yǎng)層細(xì)胞支持組合的策略傳統(tǒng)上為用于iPSC產(chǎn)生的最有效的方法。使用用于人iPSC產(chǎn)生的病毒與飼養(yǎng)層細(xì)胞方法的歷史研究的文獻(xiàn)綜述顯示0.001％-0.01％的受感染的細(xì)胞變成iPS細(xì)胞的效率，其中在感染后第21-30天期間見到潛在的多能細(xì)胞并且這些為感染后第30-45天間通過人工“團(tuán)塊”傳代克隆衍生的。

其他用于引入多能性基因的方法包括附加型載體系統(tǒng)與修飾蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)。此類細(xì)胞被認(rèn)為是關(guān)于iPSC技術(shù)最終的臨床應(yīng)用的重要發(fā)展。然而，這些方法甚至效率比使用病毒系統(tǒng)重新編程的效率更低。而且，也減小了重新編程的效率或在某些情況下為不可能的，當(dāng)無飼養(yǎng)層細(xì)胞系統(tǒng)與常規(guī)的干細(xì)胞培養(yǎng)基制劑組合使用，妨礙iPSC用于工業(yè)與治療用途的發(fā)展。體細(xì)胞重新編程已表征為隨機(jī)過程；大多數(shù)細(xì)胞隨著時(shí)間流逝將最終重新編程。然而還必須描述一種強(qiáng)力的、技術(shù)簡(jiǎn)單的、有效率的并且可擴(kuò)展的用于單細(xì)胞重新編程中產(chǎn)生多重iPSC克隆的方法。

本發(fā)明提供了細(xì)胞培養(yǎng)條件與方法以在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)并且比目前的方法技術(shù)壁壘更低衍生克隆的iPSC集落。具體地，并且如圖13B中所見，特異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的小分子抑制劑用作SMC4培養(yǎng)基中添加劑允許在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)環(huán)境中比不使用SMC4培養(yǎng)基時(shí)iPSC集落的產(chǎn)生效率大得多。MEK、GSK、Rock及TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑用于允許無飼養(yǎng)層環(huán)境中有效的重新編程。

如圖13與表4中所見，在三個(gè)獨(dú)立的重新編程實(shí)驗(yàn)，當(dāng)在無飼養(yǎng)層環(huán)境重新編程過程中使用常規(guī)hESC培養(yǎng)基時(shí)看不到或只有一個(gè)集落，而小分子培養(yǎng)添加劑(即SMC4培養(yǎng)基)增強(qiáng)無飼養(yǎng)層重新編程事件達(dá)到0.035％的效率，并且導(dǎo)致感染后14-21天集落以及28-35天克隆的iPSC的衍生。因此，小分子抑制劑的使用增加了重新編程的效率，就重新編程時(shí)間與重新編程的細(xì)胞的百分比而言。使用這種方法產(chǎn)生的集落表征為使用標(biāo)準(zhǔn)的程序，諸如免疫熒光與基因表達(dá)譜的多能的。

在這種技術(shù)的另外示范中，分化細(xì)胞被表達(dá)個(gè)體的多能性基因Oct4、Klf4、Sox2以及Myc的病毒感染，并且被培養(yǎng)在SMC4培養(yǎng)基與無飼養(yǎng)層環(huán)境中(表1)8-12天。在該時(shí)間點(diǎn)上，并且如實(shí)施例6及圖13與14中所述，使用FACS或MACS單細(xì)胞分選富集細(xì)胞以獲得針對(duì)多能性標(biāo)志物諸如SSEA4與Tra181陽(yáng)性染色所確定的小的多能細(xì)胞群。使用這種方法，大大減少了iPSC產(chǎn)生時(shí)間軸：證明了在重新編程的細(xì)胞的百分比方面效率0.22％，分選后即刻出現(xiàn)集落(第10-16天)。重新編程的效率允許到感染后21-28天克隆的iPSC的衍生。

在提高重新編程的效率的其他示范中，其中3種(Oct4、Klf4及Sox2)或4種(Oct4、Klf4、Sox2及myc)多能性因子表達(dá)于相同的啟動(dòng)子元件的多順反子性載體系統(tǒng)與優(yōu)化的SMC4培養(yǎng)基、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)以及使用SSEA4與TRA181的單細(xì)胞分選系統(tǒng)組合使用，導(dǎo)致重新編程效率0.756％，在感染后第6-8天首先見到集落。這種方法如此有效率的從而使得僅在感染后第4天iPSC集落就出現(xiàn)。這些技術(shù)代表了優(yōu)于傳統(tǒng)的iPSC產(chǎn)生方法顯著的改善。

表4：各種策略中重新編程的動(dòng)力學(xué)。N.I.,未鑒定；*iPSC樣集落的形態(tài)表現(xiàn)；**計(jì)算為SSEA4+/Tra181+數(shù)量/接種的細(xì)胞；***iPSC集落擴(kuò)增并且保持為克隆細(xì)胞系所需的時(shí)間(基于Tra181/SSEA4染色)?；疑虼砦墨I(xiàn)檢索來源的數(shù)據(jù)。單獨(dú)的因子病毒；通過組合每個(gè)表達(dá)一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的單獨(dú)的病毒進(jìn)行感染，3代表Oct4/Klf4/Sox2組合并且4代表Oct4/Klf4/Sox2/cMyc組合。

實(shí)施例9：使用單細(xì)胞分選與富集從分化細(xì)胞群消耗多能細(xì)胞群的方法

藥物篩選與干細(xì)胞生物學(xué)的一些臨床應(yīng)用需要從多能細(xì)胞諸如ESC或iPSC分化為特定譜系的同源性細(xì)胞群的產(chǎn)生。分化細(xì)胞群與多能細(xì)胞的接觸導(dǎo)致誤導(dǎo)的篩選結(jié)果或甚至體內(nèi)腫瘤/畸胎瘤形成。富集分化細(xì)胞的細(xì)胞群或從細(xì)胞群消耗多能細(xì)胞的方法可包括本文實(shí)施例3與6中所述的分選技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)基中使用小分子添加劑以特異地阻止單細(xì)胞分選過程期間多能細(xì)胞分化或部分分化，如本發(fā)明所提供的，允許多能細(xì)胞從完全分化的細(xì)胞群陰性地選擇。相反地，在多能細(xì)胞針對(duì)多能性的表面標(biāo)志物仍保持完全陽(yáng)性的培養(yǎng)條件下，通過細(xì)胞分選從細(xì)胞群陽(yáng)性選擇分化細(xì)胞可以更加有效的。如圖20中所見，當(dāng)細(xì)胞在表1中所述的培養(yǎng)環(huán)境中預(yù)培養(yǎng)時(shí)，使用FACS，有效地分離混合的完全分化的成纖維細(xì)胞與多能細(xì)胞群。分選程序期間也可以使用小分子培養(yǎng)添加劑以穩(wěn)定單細(xì)胞懸浮液?？梢詮膱D20見到，在隨后的培養(yǎng)與堿性磷酸酶染色上，多能性標(biāo)志物陰性選擇的細(xì)胞完全見不到多能細(xì)胞。

實(shí)施例10：無飼養(yǎng)層培養(yǎng)上多能干細(xì)胞的無細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子培養(yǎng)

如實(shí)施例2中所討論的，常規(guī)人多能培養(yǎng)系統(tǒng)包括飼養(yǎng)層細(xì)胞與細(xì)胞因子，諸如bFGF，其用作外源性刺激保持未分化狀態(tài)中多能干細(xì)胞。飼養(yǎng)層細(xì)胞與產(chǎn)生重組的細(xì)胞因子的過程用作異種污染的來源。另外，尚未鑒定飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的關(guān)鍵因子與細(xì)胞因子刺激的精確的細(xì)胞通路。因此，人多能干細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)代表定義不清的系統(tǒng)并且阻礙轉(zhuǎn)化至臨床級(jí)大規(guī)模應(yīng)用。

為處理這種情況，本發(fā)明包括另外的實(shí)施方案，其中通過從SMC4培養(yǎng)基制劑移除bFGF與其他的細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子進(jìn)一步地修飾實(shí)施例2中所討論的無飼養(yǎng)層與單細(xì)胞傳代系統(tǒng)。而且，在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，用明膠取代Matrigel^TM，因?yàn)镸atrigel^TM代表動(dòng)物源性并且沒有充分表征的細(xì)胞外基質(zhì)。本發(fā)明的這些實(shí)施方案提供了完全定義的無細(xì)胞因子的培養(yǎng)系統(tǒng)，其考慮到內(nèi)源性自我更新并且保持多能干細(xì)胞，包括iPSC。

如圖21A與21B中所示，人多能干細(xì)胞，諸如用包含Oct4、Klf4及Sox2的多順反子性載體系統(tǒng)產(chǎn)生并且保持在無飼養(yǎng)層環(huán)境中的iPSC，易于單細(xì)胞傳代到明膠包被的缺乏額外的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子諸如bFGF的SMC4培養(yǎng)基培養(yǎng)表面。在該完全定義的系統(tǒng)中幾次傳代后，iPSC保持如通過Tra181與SSEA4共表達(dá)所示的它們的多能狀態(tài)(圖21C)。而且，我們已證明了在該完全定義的無細(xì)胞因子的系統(tǒng)中iPSC的產(chǎn)生。因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了缺乏生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子，包含SMC4培養(yǎng)基與明膠組合的完全定義的培養(yǎng)系統(tǒng)。

實(shí)施例11.多能干細(xì)胞的產(chǎn)生與保持中基因組穩(wěn)定性

研究提示重新編程過程與隨后多能干細(xì)胞培養(yǎng)可導(dǎo)致基因組異常傾向較高。另外，無飼養(yǎng)層培養(yǎng)已顯示引起核型異常細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)。如圖17A、圖17B及18C中所示，本發(fā)明提供了重新編程的方法以獲得具有基因組穩(wěn)定性的細(xì)胞以及保持具有基因組穩(wěn)定性重新編程的細(xì)胞的方法。在本發(fā)明的方法中，重新編程過程期間以及使用包含Oct4、Klf4及Sox2的3因子多順反子性構(gòu)建體重新編程細(xì)胞并且培養(yǎng)于SMC4培養(yǎng)基中時(shí)長(zhǎng)期無飼養(yǎng)層培養(yǎng)期間，保持基因組穩(wěn)定性。如圖17A中所見，高分辨率比較基因組雜交證明了當(dāng)使用SMC4培養(yǎng)基產(chǎn)生hiPSC并且保持在長(zhǎng)期無飼養(yǎng)層培養(yǎng)中時(shí)，檢測(cè)到最小的拷貝數(shù)變異。另外，在如圖17B與18C中所示的常規(guī)的長(zhǎng)期無飼養(yǎng)層與單細(xì)胞培養(yǎng)期間，保持基因組穩(wěn)定性。

實(shí)施例12：在培養(yǎng)期間使用細(xì)胞表面標(biāo)志物保持多能細(xì)胞的細(xì)胞群

通常需要或有必要從多能細(xì)胞培養(yǎng)移除分化細(xì)胞以保持多能干細(xì)胞諸如hESC與hiPSC的多能性。迄今為止，這個(gè)過程需要從細(xì)胞培養(yǎng)人工挑選出分化細(xì)胞或從極大分化的群體收集未分化細(xì)胞。這兩個(gè)過程都是勞動(dòng)密集型，需要技能訓(xùn)練，并且依賴于基于形態(tài)的細(xì)胞選擇，其不一定總是真正的培養(yǎng)中細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)示(圖8)。

在改善的方法中，本發(fā)明提供了在常規(guī)培養(yǎng)期間有效地并且精確地選擇未分化細(xì)胞的能力。如圖19A中所示，保持在SMC4培養(yǎng)基與FF培養(yǎng)中的hiPSC群易于富集或分選以保持未分化的多能細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)。在其他的實(shí)例中，如圖19B所示，通常被丟棄的大多數(shù)分化的細(xì)胞群，可以從細(xì)胞培養(yǎng)移除以獲得大多數(shù)未分化的多能細(xì)胞，如通過Tra181表達(dá)所述的。

序列表

<110> 菲特治療公司

<120> 用于單細(xì)胞分選與增強(qiáng)IPSC重新編程的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)

<130> D17C10271CN

<150> US 61/496,991

<151> 2011-06-14

<150> US 61/426,369

<151> 2010-12-22

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉(zhuǎn)基因Oct4正向引物

<400> 1

ctggttggag ggaaggtaat ctag 24

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉(zhuǎn)基因Oct4, Klf4, Myc, Lin28, Sox2 以及Nanog反向引物

<400> 2

ttttgtaatc cagaggttga ttgttc 26

<210> 3

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉(zhuǎn)基因Oct4, Klf4, Myc, Lin28, Sox2 以及Nanog探針

<400> 3

ccccgacgcg tct 13

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉(zhuǎn)基因Klf4正向引物

<400> 4

gccttacaca tgaagaggca ttt 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉(zhuǎn)基因Myc正向引物

<400> 5

tcttgtgcgt aactcgagtc tagag 25

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉(zhuǎn)基因Lin28正向引物

<400> 6

ccggaggcac agaattgac 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉(zhuǎn)基因Sox2正向引物

<400> 7

cactgcccct ctcacacatg 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉(zhuǎn)基因Nanog正向引物

<400> 8

catgcaacct gaagacgtgt aa 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 內(nèi)源性O(shè)ct4正向引物

<400> 9

gggtttttgg gattaagttc ttca 24

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 內(nèi)源性O(shè)ct4反向引物

<400> 10

gcccccaccc tttgtgtt 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 內(nèi)源性O(shè)ct4探針

<400> 11

tcactaagga aggaattg 18

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 內(nèi)源性Klf4正向引物

<400> 12

agcctaaatg atggtgcttg gt 22

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 內(nèi)源性Klf4反向引物

<400> 13

ttgaaaactt tggcttcctt gtt 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 內(nèi)源性Klf4探針

<400> 14

agtcttggtt ctaaaggtac c 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 內(nèi)源性Nanog正向引物

<400> 15

tgatgcccat ccagtcaatc t 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 內(nèi)源性nanog反向引物

<400> 16

cctcgctgat taggctccaa 20

<210> 17

<211> 0

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 內(nèi)源性nanog探針

<400> 17

000