本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種智慧基因的檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

智慧(即認(rèn)知能力)，是人腦加工、儲存和提取信息的能力，即人們對事物的構(gòu)成、性能、與他物關(guān)系、發(fā)展動力、發(fā)展方向以及基本規(guī)律的把握能力。知覺、記憶、注意、思維和想象的能力都被認(rèn)為是認(rèn)知能力，它是人們成功的完成活動最重要的心理條件。人們的智慧特點對于社會經(jīng)濟狀況都有顯著的影響，增強人們的智慧也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與財富增長和預(yù)期壽命的增加有關(guān)。

近年來分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和遺傳醫(yī)學(xué)的研究表明，人類的智力發(fā)育和大腦各部分功能的發(fā)展與完善受遺傳和環(huán)境因素的共同影響和制約，其中大約40-50％受遺傳因素的影響。由于遺傳因素人們無法改變，而環(huán)境因素卻可以人為去創(chuàng)造，因此我們可以根據(jù)兒童本身的遺傳因素為其量身打造外部環(huán)境(社會環(huán)境和自然環(huán)境等)，強化優(yōu)勢天賦，因材施教，進行個性化教育培養(yǎng)。

目前對智慧相關(guān)基因的檢測技術(shù)主要是直接測序法，但該方法不僅費用較高而且操作繁瑣、周期長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種智慧基因的檢測試劑盒，利用簡單、快速、價格低廉且易于判讀的檢測方法，在PCR體系中即可完成兩個位點不同基因型的檢測，無需開管操作，減少了PCR產(chǎn)物污染的可能性。具體地，

一種智慧基因的檢測試劑盒，試劑盒包括基因檢測的PCR試劑，所述PCR試劑包括基因位點SNP檢測的特異性引物和熒光探針，所述特異性引物檢測的基因位點包括JMJD1C基因位點rs7923609，LRRC14基因位點rs2721173中的一種或兩種，根據(jù)NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫公開的基因JMJD1C(rs7923609)和LRRC14(rs2721173)序列為模板，采用Primer 5軟件設(shè)計引物和探針，引物在多態(tài)性位點的上下游進行設(shè)計，且目的片段的長度控制在100bp左右，保證探針序列包含多態(tài)性位點，具體如下：

①當(dāng)檢測JMJD1C基因位點rs7923609時，

正向引物：5'-CAAACAAGCATTCTCACTTC-3' SEQ ID NO.1，

反向引物：5'-CATAGTTTGCTTAGCCAGTT-3' SEQ ID NO.2，

JMJD1C熒光探針：5'-TAATGACAATATCCCGTTGC-3' SEQ ID NO.5；

②當(dāng)檢測LRRC14基因位點rs2721173時，

正向引物:5'-AGGTTGAAAAGACCGAGAC-3' SEQ ID NO.3，

反向引物:5'-TTTAGGCCAGTGGTAAGG-3' SEQ ID NO.4，

LRRC14熒光探針：5'-TCCGTGCTTGGTGACGCTCTG-3' SEQ ID NO.6。

本發(fā)明引物和探針也可為本發(fā)明上述核苷酸序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6的互補序列。

進一步地，所述的JMJD1C熒光探針和LRRC14熒光探針分別為5'末端區(qū)域具有熒光基團，3'末端區(qū)域具有淬滅基團的雙標(biāo)記探針。

進一步地，所述的5'末端區(qū)域采用：FAM，TET，VIC，HEX，ROX，JOE，CY3或CY5其中的一種熒光基團標(biāo)記；3'末端區(qū)域采用：BHQ，DABCYL或TAMRA其中的一種淬滅基團標(biāo)記。

進一步地，所述的PCR試劑中各引物和探針在PCR試劑中的濃度為：JMJD1C正向引物的終濃度為0.08-0.15μM，JMJD1C反向引物的終濃度0.45-0.13μM，JMJD1C熒光探針的終濃度為0.04-0.25μM；LRRC14正向引物的終濃度為0.45-0.13μM，LRRC14反向引物的終濃度為0.08-0.15μM，LRRC14熒光探針的終濃度為0.04-0.25μM。

進一步地，試劑盒還包括PCR緩沖液、陰性對照品、陽性對照品、核酸DNA提取試劑、PCR反應(yīng)所需的Taq聚合酶、dNTP中的一種或多種。

進一步地，試劑盒的檢測程序為37℃5min，95℃15min；然后95℃20sec，51℃30sec，72℃30sec收集熒光，40個循環(huán)；熔解曲線分析：95℃30sec，40℃30sec，40-75℃收集熒光。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1.本發(fā)明技術(shù)方案中的設(shè)計出一種新的檢測人智慧基因JMJD1C(rs7923609)和LRRC14(rs2721173)基因多態(tài)性的檢測引物和相應(yīng)的熒光探針，PCR檢測特異性非常高，能夠?qū)崿F(xiàn)高度特異性擴增，采用“不對稱PCR技術(shù)”進行PCR擴增，結(jié)合實時熒光PCR技術(shù)，分析熔解曲線產(chǎn)生的熔解峰，通過特定熔解峰的有無方便的判讀不同的基因型。

2.本發(fā)明技術(shù)方案中的檢測引物與探針價格低廉，在不影響特異性的前提下，單個基因僅需單條熒光探針即可實現(xiàn)基因多態(tài)性的檢測。

3.本發(fā)明技術(shù)方案在實驗過程中只需單管就可完成不同基因型的檢測，操作簡單；且無需進行PCR產(chǎn)物的后續(xù)分析，檢測成本低、周期短、效率高，同時還降低了PCR產(chǎn)物污染引起的假陽性風(fēng)險。

附圖說明

圖1第1個PCR管在FAM通道出現(xiàn)Tm為53.9的JMJD1C-GG型熔解峰；

圖2第1個PCR管在HEX通道出現(xiàn)Tm為52.8℃的LRRC14-AA型熔解峰；

圖3第2個PCR管在FAM通道出現(xiàn)Tm為48.4℃的JMJD1C-AA型熔解峰；

圖4第2個PCR管在HEX通道出現(xiàn)Tm為63.3℃的LRRC14-GG型熔解峰；

圖5第3個PCR管在FAM通道出現(xiàn)Tm為48.8℃和55.2℃的JMJD1C-AG型熔解峰；

圖6第3個PCR管在HEX通道出現(xiàn)Tm為53.1℃和62.9℃的LRRC14-GA型熔解峰；

圖7第4個PCR管在FAM通道出現(xiàn)Tm為47.7℃和Tm為53.7℃的JMJD1C-AG型熔解峰；

圖8第4個PCR管在HEX通道出現(xiàn)Tm為53.4℃和63.4℃的LRRC14-GA型熔解峰；

圖9陰性對照管在FAM通道的熔解峰；

圖10陰性對照管在HEX通道的熔解峰。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

智慧基因JMJD1C(rs7923609)和LRRC14(rs2721173)基因多態(tài)性檢測

1.DNA提取

人唾液樣本采用Chelex-100法提取DNA，具體步驟如下：

A.取300μL唾液加入1.5mL離心管中，13000rpm離心3min，棄上清，向沉淀中加入500μL滅菌雙蒸水，劇烈振蕩后室溫下靜置15min，13000rpm離心3min，棄上清，收集沉淀；

B.沉淀中加入100μL核酸提取液，核酸提取液內(nèi)含顆粒物，每次吸取前應(yīng)充分搖勻，確保將顆粒一起吸出，在振蕩器上反復(fù)振蕩，56℃保溫30min以上；

C.取出后充分振蕩，100℃保溫8min，取出后充分振蕩，13,000rpm離心3min，上清液可直接用于PCR擴增，在4℃下可保存一周，也可存放在-20℃冰箱待用。

樣本還可包括體液、組織樣品或脫落細(xì)胞中的一種，例如血濾紙片、帶毛囊的毛發(fā)、口腔黏膜刮片或全血樣本等，血液樣本于-20℃以下保存不超過一年，根據(jù)取樣方式以及被測樣本的不同，可對樣本進行相應(yīng)的預(yù)處理。

2.引物和熒光探針的設(shè)計

根據(jù)NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫公開的基因JMJD1C(rs7923609)和LRRC14(rs2721173)序列為模板，采用Primer 5軟件設(shè)計引物和探針，引物在多態(tài)性位點的上下游進行設(shè)計，且目的片段的長度控制在100bp左右，保證探針序列包含多態(tài)性位點，具體如下：

引物：JMJD1C正向引物：5'-CAAACAAGCATTCTCACTTC-3'，

JMJD1C反向引物：5'-CATAGTTTGCTTAGCCAGTT-3'，

LRRC14正向引物：5'-AGGTTGAAAAGACCGAGAC-3'，

LRRC14反向引物：5'-TTTAGGCCAGTGGTAAGG-3'，

探針：JMJD1C熒光探針：5'-TAATGACAATATCCCGTTGC-3'，

LRRC14熒光探針：5'-TCCGTGCTTGGTGACGCTCTG-3'。

所述的JMJD1C熒光探針5'末端區(qū)域采用FAM熒光基團標(biāo)記，3'末端區(qū)域采用BHQ淬滅基團標(biāo)記；LRRC14熒光探針5'末端區(qū)域采用HEX熒光基團標(biāo)記，3'末端區(qū)域采用BHQ淬滅基團標(biāo)記。

引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。探針定量后-20℃避光保存。

3.PCR擴增試驗

PCR擴增所用的模板為攜帶JMJD1C基因的純合突變基因型、純合野生基因型、雜合突變基因型，及攜帶LRRC14基因的純合突變基因型、純合野生基因型、雜合突變基因型人的基因組DNA。

反應(yīng)體系如下：PCR緩沖液(2x buffer)10μL，JMJD1C正向引物(10μM)0.2μl，反向引物(10μM)2μl，熒光探針(10μM)0.3μl；LRRC14正向引物(10μM)1μl，反向引物(10μM)0.2μl，熒光探針(10μM)0.1μl，模板2μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，dNTP(10mM)0.4μL，ddH₂O 3.5μL。

反應(yīng)體系包括五個PCR反應(yīng)管，第一個PCR反應(yīng)管中，放置有JMJD1C基因純合突變基因型和LRRC14基因純合突變基因型的模板(JMJD1C-GG，LRRC14-AA)，第二個PCR反應(yīng)管中，放置有JMJD1C基因純合野生基因型和LRRC14基因純合野生基因型的模板(JMJD1C-AA，LRRC14-GG)，第三個PCR反應(yīng)管中，放置有JMJD1C基因雜合突變基因型和LRRC14基因雜合突變基因型的模板(JMJD1C-AG，LRRC14-GA)，第四個PCR反應(yīng)管為陽性對照，以雜合突變陽性對照品為模板，JMJD1C基因和LRRC14基因均為雜合突變基因型(JMJD1C-AG和LRRC14-GA)，第五個PCR反應(yīng)管為NTC，以雙蒸水為模板作為對照。其中，各個PCR反應(yīng)管中模板濃度相同。

反應(yīng)程序如下：

用SLAN8.0熒光定量PCR儀按如下程序進行擴增反應(yīng)：

擴增反應(yīng)條件：37℃5min，95℃15min；然后95℃20sec，51℃30sec，72℃30sec(收集熒光)，40個循環(huán)；

熔解曲線條件：95℃30sec，40℃30sec，40-75℃(收集熒光)。熒光通道選用FAM(465-510nm)和HEX(533-580nm)。

4.檢測結(jié)果分析

本實施例五個PCR反應(yīng)管的熔解曲線分別參見附圖1-10，結(jié)果表明，含有模板的各反應(yīng)管均出現(xiàn)特異性擴增，各PCR產(chǎn)物的Tm值之間均能夠很好的進行區(qū)分。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110> 申請人名稱 才賦基因科技（北京）有限公司

<120> 一種智慧基因的檢測試劑盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caaacaagca ttctcacttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

Catagtttgc ttagccagtt 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aggttgaaaa gaccgagac 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttaggccag tggtaagg 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

Taatgacaat atcccgttgc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

Tccgtgcttg gtgacgctct g 21