本發(fā)明涉及一種解脂亞羅酵母菌，特別是一種具有降膽固醇降甘油三酯作用的解脂亞羅酵母菌(Yarrowialipolytica)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甘油三酯(Triglyceride，縮寫TG)是長(zhǎng)鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人體內(nèi)含量最多的脂類，大部分組織均可以利用甘油三酯分解產(chǎn)物供給能量。甘油三酯來自食物中脂肪的分解，肝臟也能將血液中的某些糖類轉(zhuǎn)化為甘油三酯。如果甘油三酯過量，囤積于皮下就會(huì)使身體肥胖，囤積于血管壁則造成動(dòng)脈硬化，囤積于心臟就會(huì)導(dǎo)致心臟肥大，囤積于肝臟則會(huì)造成脂肪肝。甘油三酯高的后果無論發(fā)生在哪個(gè)部位，對(duì)人體損傷都很嚴(yán)重。如果在心臟，可引起冠心病、心梗；在大腦，可發(fā)生腦卒中、中風(fēng)；發(fā)生在眼底，會(huì)導(dǎo)致視力下降、失明；如在腎臟，可引起腎衰；發(fā)生在下肢，則出現(xiàn)肢體血流不暢導(dǎo)致壞死。此外，甘油三酯高的危害還包括引發(fā)高血壓、膽結(jié)石、胰腺炎；還能夠加重肝炎、致使男性性功能障礙、導(dǎo)致老年癡呆等。目前我國(guó)有近1/3的成年人血脂偏高，高脂血癥現(xiàn)在已成為人類健康的第一隱形殺手。膽固醇在體內(nèi)有著廣泛的生理作用，但當(dāng)其過量時(shí)便會(huì)導(dǎo)致高膽固醇血癥，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響?，F(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與高膽固醇血癥有密切的相關(guān)性。有關(guān)乳酸菌在降膽固醇方面的研究，國(guó)內(nèi)外有大量的論文報(bào)道和專利成果。CN101864375A植物乳桿菌(C88)、CN102604851A乳酸乳球菌、CN101559082A乳桿菌(MA2)、CN101724589A乳酸菌、CN1186855A尿鏈球菌(DM891128)及鼠李糖乳桿菌(grx10)在降膽固醇的作用中都有一定的效果，但酵母菌在降膽固醇方面的研究報(bào)道鮮見、在降甘油三酯方面更是未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種具有降低膽固醇、甘油三酯作用的酵母菌及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種分離自啤酒渣的酵母菌，為解脂亞羅酵母菌株(Yarrowialipolytica)，菌株已于2013年04月07日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC7427，保藏地址為：北京朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。本發(fā)明通過將啤酒渣涂布于麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上進(jìn)行分離，培養(yǎng)分純菌株菌落為乳白色，鏡檢形態(tài)為卵圓形，將分純菌株進(jìn)行簡(jiǎn)單染色、運(yùn)動(dòng)性檢查，進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化等實(shí)驗(yàn)。采用26SrDNA法對(duì)所分純的菌株進(jìn)行分子鑒定。其26SrDNA序列在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株EAM-ZT003T的基因序列，在所有相似的序列中，與解脂亞羅酵母菌株(Yarrowialipolytica)的同源性為100％，因此結(jié)合生理生化特征，鑒定該菌株為解脂亞羅酵母菌株，將其命名為EAM-ZT003T。本發(fā)明提供能用于進(jìn)一步研究開發(fā)預(yù)防和治療由于膽固醇甘油三酯過高所引起的心腦血管疾病的功能性保健食品和藥品的原料菌株。通過磷硫鐵比色法等方法測(cè)定菌株EAM-ZT003T的降膽固醇、甘油三酯以及耐酸、耐膽鹽效果，并且測(cè)定了菌株在小鼠體內(nèi)是否具有毒副作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：本發(fā)明提供的來源于啤酒渣的解脂亞羅酵母菌株，具有降膽固醇、降甘油三酯作用，并具有很好的安全性，且小鼠體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無毒無害，同時(shí)具有良好的膽鹽、強(qiáng)酸耐受性，其降膽固醇降甘油三酯能力強(qiáng)，能夠應(yīng)用在功能性食品和保健藥品的制備中。所謂功能性食品是指具有特定功能的食品，適宜于特定人群食用，可調(diào)節(jié)機(jī)體的功能，又不以治療為目的。【附圖說明】圖1為本發(fā)明的菌株簡(jiǎn)單染色結(jié)果。圖2為本發(fā)明的菌株平板菌落形態(tài)。圖3為本發(fā)明的菌株對(duì)蛋黃中膽固醇及膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的降解效果。圖4為本發(fā)明的菌株對(duì)甘油三酯的降解效果。圖5為本發(fā)明的菌株耐酸試驗(yàn)結(jié)果。圖6為本發(fā)明的菌株耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果。圖7為本發(fā)明的菌株對(duì)毒性試驗(yàn)小鼠的體重變化。圖8為本發(fā)明的菌株毒性試驗(yàn)結(jié)果(小鼠肝臟切片)。圖9為本發(fā)明的菌株毒性試驗(yàn)結(jié)果(小鼠腎臟切片)?！揪唧w實(shí)施方式】以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1本發(fā)明所提供的具有降膽固醇降甘油三酯能力的解脂亞羅酵母菌EAM-ZT003T的篩選和鑒定。1菌種的分離、純化稱取0.5g啤酒渣樣品，加入到裝有4.5ml無菌水的試管中，逐次稀釋至10-6，取10-4、10-5、10-6三管稀釋液各0.1ml，采用涂布法，涂布于麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上進(jìn)行分離，37℃恒溫培養(yǎng)48h。挑取菌落，連續(xù)劃線分離純化，最后選擇單菌落，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種后，接種到斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基的配方及條件為：葡萄糖1.0g、氯化鉀1.8g、酵母粉2.5g、無水乙酸鈉8.2g、蒸餾水1000mL，113℃，滅菌20min。分純菌株菌落為乳白色，直徑約2mm，邊緣整齊，容易挑起，鏡檢形態(tài)為卵圓形，出芽生殖，大小為(3-1.5)μm×(4-5.5)μm。將分純菌株命名為EAM-ZT003T。2菌株生理生化鑒定將分純菌株進(jìn)行簡(jiǎn)單染色、運(yùn)動(dòng)性檢查，進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化等實(shí)驗(yàn)。菌株經(jīng)半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，菌株沿穿刺線生長(zhǎng)，邊緣清晰，菌株無運(yùn)動(dòng)性。菌株不能液化明膠，不還原硝酸鹽。表1EAM-ZT003T生理生化鑒定結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果葡萄糖+山梨醇+鼠李糖-山梨糖-棉籽糖-核糖-半乳糖-D-木糖+果糖-松三糖-半乳糖-硝酸鹽(還原)-淀粉-蔗糖-明膠-尿素+硫化氫-纖維二糖-阿拉伯糖-密二糖-醋酸鹽-衛(wèi)茅醇-β-半乳糖苷-蕈糖-45℃-15℃+6.5％NaCl-10％NaCl-326SrDNA分子鑒定采用26SrDNA法對(duì)所分純的菌株進(jìn)行分子鑒定。26SrDNA擴(kuò)增及序列測(cè)定由寶生物工程(大連)有限公司完成。測(cè)序完成提交菌株EAM-ZT003T的26SrDNA序列在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株EAM-ZT003T的基因序列，在所有相似的序列中，與解脂亞羅酵母菌株(Yarrowialipolytica)的同源性為100％，因此結(jié)合生理生化特征，鑒定菌株EAM-ZT003T為解脂亞羅酵母菌株。分離自啤酒渣的解脂亞羅酵母菌株(Yarrowialipolytica)，菌株已于2013年04月07日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC7427。實(shí)施例2本發(fā)明所提供的具有降膽固醇降甘油三酯能力的解脂亞羅酵母菌EAM-ZT003T的降膽固醇效果。1降蛋黃中膽固醇菌的效果無菌條件下，于滅菌的培養(yǎng)基中加入一定量雞蛋黃作為膽固醇源，無菌均勻分裝到試管中。以2％(菌體濃度為108cfu/ml)的接種量加入菌液，37℃恒溫培養(yǎng)24h，在8000r/min下離心10min，取上清液按照磷硫鐵比色法，測(cè)定上清液中膽固醇含量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)定2個(gè)重復(fù)。硫磷鐵顯色劑的配置——三氯化鐵溶液：稱取5.0gFeCl3·6H2O溶于200ml濃磷酸中；磷硫鐵試劑(P-S-Fe試劑)：取40ml的三氯化鐵溶液用濃硫酸定容到500mL。磷硫鐵比色法：取容量為10ml的離心管，加入4.8ml無水乙醇及0.2ml發(fā)酵上清液，置室溫內(nèi)10min后，8000r/min離心5min。另取干凈試管，用移液槍準(zhǔn)確移取上清液2ml加入試管中，再沿管壁緩慢加入2ml配置好的硫磷鐵試劑，立即搖勻后，室溫冷卻30min。待所生顏色穩(wěn)定后，用分光光度計(jì)在560nm下進(jìn)行比色，用無水乙醇作空白調(diào)零，以未接菌的麥?zhǔn)?蛋黃培養(yǎng)基作對(duì)照。膽固醇降低率按照以下公式計(jì)算：膽固醇降低率＝(C-A)/C×100％A：菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液在560nm處的OD值C：對(duì)照在560nm處的OD值經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得菌株EAM-ZT003T的降蛋黃中膽固醇能力為32.8％。2降高純度膽固醇菌的效果將菌株以2％(菌體濃度為108cfu/ml)的接種量接種于高膽固醇MeclaryO-CHOL培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，在8000r/min下離心10min，取上清液按照磷硫鐵比色法，測(cè)定上清液中膽固醇含量。用無水乙醇作空白調(diào)零，以未接種的高膽固醇MeclaryO-CHOL培養(yǎng)基作對(duì)照。膽固醇降低率按照以下公式計(jì)算：膽固醇降低率＝(C-A)/C×100％A：菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液在560nm處的OD值C：對(duì)照在560nm處的OD值高膽固醇MeclaryO-CHOL培養(yǎng)基：以1000mL的麥?zhǔn)弦后w培養(yǎng)基計(jì)，含1.0mg/mL膽固醇膠束溶液制備：準(zhǔn)確稱量膽固醇0.1g放入小燒杯中，加入0.2g牛膽鹽、0.1g蔗糖酯、1mL吐溫80攪拌均勻，再移取5mL的冰乙酸加熱溶解，把溶解液用超聲波處理15min后，快速加入到配制好的麥?zhǔn)弦后w培養(yǎng)基中，邊加入邊攪拌，使其形成均勻穩(wěn)定的膠體溶液。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得菌株EAM-ZT003T的降膽固醇能力為12％。實(shí)施例3本發(fā)明所提供的具有降膽固醇降甘油三酯能力的解脂亞羅酵母菌EAM-ZT003T的降甘油三酯效果。無菌條件下，于滅菌的培養(yǎng)基中加入一定量的甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品，無菌分裝到試管中。以2％(菌體濃度為108cfu/ml)的接種量加入菌液(未接菌的試管作為空白對(duì)照)，37℃恒溫培養(yǎng)24h，于420nm處測(cè)定甘油三酯降解率。甘油三酯降低率＝(C-A)/C×100％式中的A為菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液在420nm處的OD值，C為空白對(duì)照在420nm處的OD值。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得菌株EAM-ZT003T的降甘油三酯能力為80％。實(shí)施例4本發(fā)明所提供的具有降膽固醇降甘油三酯能力的解脂亞羅酵母菌EAM-ZT003T的耐酸耐膽鹽試驗(yàn)。1菌株的耐酸試驗(yàn)將菌株活化后制成菌懸液，采用稀釋涂板法測(cè)定菌株的濃度。將活化菌株分別接種于pH6.8、pH3.0、pH2.0的麥?zhǔn)弦后w培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)10h，利用梯度稀釋平板法測(cè)定活菌數(shù)，做5個(gè)平行求平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株具有較強(qiáng)的耐酸性，在pH3.0的條件下存活率比較高，pH2.0時(shí)，培養(yǎng)10h，菌株的存活率有所下降，但仍能達(dá)到105cfu/ml。2菌株對(duì)0.3％膽鹽環(huán)境的耐受力測(cè)定將菌株活化后制成菌懸液(菌體濃度為108cfu/ml)，按2％的接種量分別接種于含0.0％牛膽鹽(即空白)、0.3％牛膽鹽的復(fù)合液體培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)24h后，分別測(cè)定其OD值，做5個(gè)平行求平均值，按下述公式計(jì)算菌株對(duì)膽鹽的耐受力。膽鹽耐受力(％)＝含膽鹽培養(yǎng)基的OD/空白培養(yǎng)基的OD×100％經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得菌株EAM-ZT003T的膽鹽耐受能力為91.7％。實(shí)施例5本發(fā)明所提供的具有降膽固醇降甘油三酯能力的解脂亞羅酵母菌EAM-ZT003T的小鼠毒性試驗(yàn)。將20只小鼠隨機(jī)分成2組，A組灌胃生理鹽水，B組灌胃解脂亞羅酵母菌懸液。A組小鼠每只每天灌胃生理鹽水0.5ml，B組小鼠每只每天灌胃含1×108個(gè)酵母菌的懸浮液0.5ml。為了保證菌體溶液中一定的活菌數(shù)，每次灌胃都采用新鮮處理的菌株。自由進(jìn)水，每周記錄體重。在給藥42天后，處死解剖，將心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺取出用生理鹽水沖洗并擦拭干凈后稱重，計(jì)算小鼠臟器指數(shù)，此外，內(nèi)臟分離做石蠟切片，觀察臟器是否發(fā)生病變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7、8、9。表1毒性試驗(yàn)小鼠臟器指數(shù)比較為期42天的毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠毛色光潔，食欲正常，灌胃42天未出現(xiàn)異常體征，未發(fā)現(xiàn)異常死亡，小鼠體重增長(zhǎng)前14天較快，14天后趨于緩慢，但試驗(yàn)過程中未出現(xiàn)消瘦、死亡現(xiàn)象。小鼠解剖后內(nèi)臟正常，顏色紅潤(rùn)、光滑，切片結(jié)果顯示，小鼠臟器無氣質(zhì)性改變。結(jié)果表明飼喂解脂亞羅酵母菌EAM-ZT003T對(duì)小鼠沒有毒副作用。結(jié)論：本發(fā)明提供的菌株具有極好的降膽固醇降甘油三酯的功效，并具有非常好的耐酸、耐膽鹽性，進(jìn)入人體胃腸道后，有較多的活菌存在，確保菌株的降膽固醇降甘油三酯活性，且菌株沒有任何毒副作用。本發(fā)明提供的解脂亞羅酵母菌EAM-ZT003T的上述特性使其能夠應(yīng)用于制備保健藥品和具有降脂降膽固醇功能的食品中。最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3