本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥領域，尤其涉及一種大環(huán)內(nèi)酯類衍生物及其制備方法和應用，具體是一種二十四元大環(huán)內(nèi)酯類衍生物及其制備方法和在抑制甘蔗黑穗霉菌方面的應用。
背景技術：
世界對糖和甘蔗乙醇的日益增長的需求不斷推動著甘蔗農(nóng)業(yè)的發(fā)展。生長期間，甘蔗作物對多種生物和非生物因素均非常敏感，其中就包括甘蔗黑穗病。該病顯著減少甘蔗的長度和周長、節(jié)間數(shù)、水分含量和莖的重量，在甘蔗產(chǎn)量和糖分含量方面造成重大的損失。甘蔗黑穗病在世界范圍內(nèi)傳播，覆蓋大部分的甘蔗產(chǎn)區(qū)，造成嚴重的產(chǎn)量損失，是全球甘蔗生產(chǎn)中最嚴重的制約因素之一。化學農(nóng)藥已經(jīng)被證實是防治甘蔗黑穗霉菌的有效手段，然而，人工合成的化學農(nóng)藥的廣泛使用，不僅造成環(huán)境的嚴重污染，同時對人體健康也造成危害。生物農(nóng)藥主要泛指可以進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的微生物源農(nóng)藥，具有選擇性強、對人畜安全、對生態(tài)環(huán)境影響小、生產(chǎn)設備通用性較好、開發(fā)投資風險相對較小等優(yōu)點。減少使用化學農(nóng)藥，大力發(fā)展無公害生物農(nóng)藥是人類實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展和保障食品安全生產(chǎn)的高新技術突破口之一。
海洋微生物特殊的生存的環(huán)境形成了有別于陸生微生物的獨特新陳代謝途徑、生存繁殖方式及適應機制，從而可代謝產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎具有多種生物活性的次級代謝產(chǎn)物。許多海洋微生物次級代謝產(chǎn)物具有較強的抗植物病原真菌的作用。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種天然來源、結(jié)構(gòu)新穎、活性優(yōu)良的大環(huán)內(nèi)酯類衍生物及其制備方法，該大環(huán)內(nèi)酯類衍生物能夠有效抑制甘蔗黑穗霉菌，可作為防治甘蔗黑穗病的生物農(nóng)藥。
為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案：
大環(huán)內(nèi)酯類衍生物，具有以下結(jié)構(gòu)式：
上述大環(huán)內(nèi)酯類衍生物為3，5，9，11，17，19-六烯-2-酮基，8，14，16，21-四羥基-24-乙基二十四元環(huán)內(nèi)酯。
上述大環(huán)內(nèi)酯類衍生物的制備方法，從柳珊瑚內(nèi)生芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)的發(fā)酵液中提取分離而得。
發(fā)酵液按以下操作制備：將柳珊瑚內(nèi)生芽孢桿菌接入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，在28℃搖床140rpm轉(zhuǎn)速下震蕩培養(yǎng)10d，即得。
液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)配方為2.0g/L葡萄糖，2.0g/L酵母提取物，2.0g/L麥芽提取物，鹽度1.022。
提取分離按以下操作進行：將發(fā)酵液用超聲波破碎后再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，真空濃縮得到發(fā)酵液提取濃縮浸膏；再將濃縮浸膏采用濕法裝柱裝入正相硅膠柱內(nèi)，依次梯度洗脫，收集流份，進行薄層色譜檢測，合并成分相近的流份；通過高效液相色譜儀采用甲醇和水的混合液進行分離，即得。
梯度洗脫依次使用體積比CHCl3∶Me2CO＝1∶0.1、1∶0.2、1∶0.4、1∶0.8的氯仿-丙酮混合液及體積比CHCl3∶MeOH＝1∶0.1、1∶0.2、1∶0.35、0∶1的氯仿-甲醇混合液。
甲醇和水的混合液中甲醇和水的體積比為60∶40。
上述大環(huán)內(nèi)酯類衍生物在抑制甘蔗黑穗霉菌方面的應用。
上述大環(huán)內(nèi)酯類衍生物在制備防治甘蔗黑穗病的生物農(nóng)藥中的應用。
發(fā)明人從柳珊瑚內(nèi)生芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)的發(fā)酵液中提取分離獲得一種大環(huán)內(nèi)酯類衍生物M1，M1屬于二十四元大環(huán)內(nèi)酯類衍生物，命名為3，5，9，11，17，19-六烯-2-酮基，8，14，16，21-四羥基-24-乙基二十四元環(huán)內(nèi)酯。試驗表明，該二十四元大環(huán)內(nèi)酯類衍生物M1對甘蔗黑穗霉菌的冬孢子萌發(fā)的EC50值遠小于陽性對照試劑苯醚甲環(huán)唑乳油，說明化合物M1具有良好的抑制甘蔗黑穗霉菌活性。由于化合物M1為海洋天然活性成分，且可以大規(guī)模發(fā)酵提取，而且易溶于甲醇和乙醇，具有良好的親醇性，因此可單獨或組合應用于制備防治甘蔗黑穗病的高效生物農(nóng)藥。迄今為止，還未見有從海洋生物的次生代謝產(chǎn)物中獲得具有抑制甘蔗黑穗霉菌活性的天然化合物的報道，更是未見將二十四元大環(huán)內(nèi)酯類衍生物用于抑制甘蔗黑穗霉菌中的報道。因此，本發(fā)明為制備新型抑制甘蔗黑穗霉菌的生物農(nóng)藥提供了新的來源。
具體實施方式
一、本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酯類衍生物的制備
從平板挑取少量米粒大小的柳珊瑚內(nèi)生芽孢桿菌接入液體培養(yǎng)基(配方為2.0g/L葡萄糖，2.0g/L酵母提取物，2.0g/L麥芽提取物，鹽度1.022)，在28℃搖床140rpm轉(zhuǎn)速下震蕩培養(yǎng)10d，得發(fā)酵液200L。
將發(fā)酵液用超聲波破碎后再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，真空濃縮得到發(fā)酵液提取濃縮浸膏51.22g。將乙酸乙酯濃縮浸膏采用濕法裝柱裝入正相硅膠柱內(nèi)(裝柱溶劑：CHCl3)，采用CHCl3-Me2CO系統(tǒng)(體積比CHCl3∶Me2CO＝1∶0.1、1∶0.2、1∶0.4、1∶0.8)和CHCl3-MeOH系統(tǒng)(體積比CHCl3∶MeOH＝1∶0.1、1∶0.2、1∶0.35、0∶1)依次梯度洗脫，一共收集了117個流份，每個流份真空濃縮(0.09MPa，43℃)后進行薄層色譜檢測。根據(jù)TLC法檢測結(jié)果，將成分相近的流份進行合并，得到11個組分k1-k11。
取組分k7(0.22g)經(jīng)HPLC分析型柱確定分離條件后，再用HPLC制備柱進行分離，采用甲醇和水，在梯度MeOH∶H2O＝60∶40/V∶V處，獲得一個二十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類衍生物M1(6.5mg，甲醇溶，制備程序出峰時間t＝16.5分鐘)。
二、本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酯類衍生物的結(jié)構(gòu)解析
經(jīng)核磁共振檢測分析，確定本發(fā)明化合物M1的化學結(jié)構(gòu)為：
M1屬于二十四元大環(huán)內(nèi)酯類衍生物，命名為3，5，9，11，17，19-六烯-2-酮基，8，14，16，21-四羥基-24-乙基二十四元環(huán)內(nèi)酯。
其理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)分別為：黃色油狀，溶于甲醇，C25H36O6，HR-ESI-MS：m/z433.2507(calcd.for C25H36O6+H，433.2512)。1H(CD3OD，600MHz)和13C(CD3OD，150MHz)NMR數(shù)據(jù)如下。
1HNMR(600MHz，CD3OD，δ，ppm，J/Hz)：7.22(1H，q，J＝6.6，H-3)，6.58(1H，q，J＝2.4，H-4)，6.17(1H，s，H-9)，6.17(1H，m，H-17)，6.16(1H，m，H-18)，6.15(1H，m，H-9)，6.13(1H，s，H-2)，6.09(1H，s，H-10)，5.79(1H，m，H-8)，5.71(1H，m，H-16)，5.63(1H，m，H-19)，5.59(1H，m，H-5)，5.53(1H，t，J＝1.8，H-11)，4.27(1H，t，J＝3.6，H-23)，4.22(1H，t，J＝3.6，H-20)，3.85(1H，q，J＝3.64，H-7)，3.82(1H，s，H-20)，3.81(1H，s，H-15)，3.35(1H，s，OH-23)，3.31(1H，s，OH-13)，3.27(1H，m，H-13)，3.31(1H，s，OH-7)，3.31(1H，s，OH-15)，3.18(1H，s，OH-20)，2.56(1H，q，J＝2.4，Ha-6)，2.48(1H，s，Ha-12)，2.32(1H，q，J＝3.0，Hb-6)，2.24(1H，s，Hb-12)，1.82(1H，s，Ha-14)，1.78(1H，t，J＝3.0，Ha-22)，1.65(1H，d，J＝3.6，Ha-21)，1.62(1H，m，H-24)，1.59(1H，m，H-14)，1.51(1H，s，Hb-22)，1.41(1H，m，Hb-21)，0.91(3H，t，J＝3.0，H-25)。
13C NMR(150MHz，CD3OD，δ，ppm)：166.9(C-1)，144.6(C-3)，141.5(C-5)，137.2(C-8)，135.9(C-16)，135.4(C-19)，131.2(C-10)，130.8(C-4)，130.2(C-18)，129.8(C-17)，128.5(C-11)，125.3(C-9)，118.4(C-2)，82.7(C-23)，74.8(C-20)，70.4(C-7)，69.9(C-15)，68.8(C-13)，45.6(C-14)，43.2(C-6)，36.6(C-12)，36.3(C-21)，29.6(C-24)，28.1(C-22)，10.8(C-25)。
三、本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酯類衍生物抑制甘蔗黑穗霉菌冬孢子萌發(fā)活性測試
將不同份量的二十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類衍生物M1分別溶于YEPS液體培養(yǎng)基，配成系列濃度的二十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯母液備用。取少量密封于塑料袋中的甘蔗黑穗霉菌冬孢子置于YEPS液體培養(yǎng)基中，制成冬孢子懸浮液。將二十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯YEPS液體培養(yǎng)基母液與等量的冬孢子懸浮液各2mL于滅菌離心管中混合均勻，配成二十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯含量為50、10、5、1、0.5、0.1ug/ml的孢子懸浮液，置于28℃、180r/min的搖床中孵育8h，以不加殺菌劑的YEPS液體培養(yǎng)基為空白對照，陽性對照試劑為苯醚甲環(huán)唑乳油。每個二十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類衍生物濃度處理設3個重復。培養(yǎng)8h后，用顯微鏡10X鏡檢，觀察各二十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯濃度處理的冬孢子萌發(fā)情況，記錄每100個冬孢子中萌發(fā)的冬孢子數(shù)，利用SPSS19.0軟件求出二十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類衍生物抑制甘蔗黑穗霉菌冬孢子萌發(fā)的EC50值(半數(shù)有效抑制濃度)。
實驗結(jié)果表明，本發(fā)明化合物二十四元大環(huán)內(nèi)酯類衍生物M1抑制甘蔗黑穗病菌冬孢子萌發(fā)EC50值為0.702μg/mL。陽性對照試劑苯醚甲環(huán)唑乳油對抑制甘蔗黑穗霉菌的冬孢子萌發(fā)的EC50值為25.638μg/mL。該二十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類衍生物M1對甘蔗黑穗霉菌的冬孢子萌發(fā)的抑制能力為苯醚甲環(huán)唑乳油的36.52倍。說明該二十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類衍生物M1可抑制孢甘蔗黑穗霉菌的冬孢子在節(jié)間表面的萌發(fā)，防止冬孢子沉積之后進入芽分生組織，從而大大降低甘蔗黑穗霉菌的發(fā)病率。將甘蔗種莖分別放入該二十四元大環(huán)內(nèi)酯類衍生物M1藥液中浸泡30min，取出播種，甘蔗的出苗率達100％，說明本發(fā)明化合物不妨礙甘蔗的安全生長，具有良好的抑制甘蔗黑穗霉菌活性，為純天然活性成分，對生態(tài)環(huán)境影響小，可以用于制備新型抗甘蔗黑穗霉菌生物農(nóng)藥。且該化合物是由柳珊瑚內(nèi)生芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)發(fā)酵而得，可大規(guī)模生產(chǎn)。