本發(fā)明涉及一株蠟狀芽孢桿菌，可應用于在pH4.5～9.1的微酸性到堿性范圍、好氧條件下對還原態(tài)無機硫化物的生物去除，屬于生物和環(huán)境保護技術領域。

背景技術：

在一些食品加工的生產(chǎn)中會釋放出大量的惡臭對人體有毒害的硫化氫廢氣(H₂S是一種還原態(tài)無機硫化物)，導致周邊環(huán)境污染。例如，在我國的禽畜屠宰行業(yè)中，屠宰加工車間產(chǎn)生的惡臭廢氣主要成分是硫化氫，濃度可高達8.0mg/m³。動物蛋白飼料魚粉的加工，由于多以新鮮度低的魚、和腐敗的臭魚爛蝦及水產(chǎn)品加工廠的下腳料為原料，在高溫蒸煮和干燥工序中，也釋放出大量的硫化氫廢氣。

針對以上現(xiàn)象，需要能夠快速去除硫化氫、適用于多種設施且成本低廉的脫硫除臭方法。目前脫臭方法主要是物理法、化學法和生物法。生物脫臭法是指利用微生物降解惡臭物質，達到去除臭味的方法。微生物處理臭氣的基本原理是利用微生物把溶解于水中的惡臭物質吸收于微生物體內(nèi)，在有氧條件下，通過微生物的代謝活動使其降解的一種過程，即對惡臭物質進行氧化分解獲得營養(yǎng)物和能量，并實現(xiàn)微生物的增殖過程。生物脫硫除臭法，具有處理效率高、無二次污染、所需設備簡單、管理維護方便、比物理法和化學法運轉成本低等優(yōu)點。

硫化物是自然界中的一種重要物質，無機硫和其化合物在自然界中分布范圍很廣，能以不同形式的離子或分子形式存在，種類可達30多種，其中僅有5種無機硫化物在室溫和一個大氣壓下在溶液中具有穩(wěn)定性，它們是SO₄^2-、HSO₄^-、S⁰、H₂S、HS^-。其它形式的硫例如多硫化合物、硫代硫酸鹽和連多硫酸鹽也可在自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，但它們是不穩(wěn)定的。硫的生物循環(huán)過程與物理化學過程緊密結合，共同構成了硫的自然界循環(huán)圈。硫的自然界循環(huán)主要是通過硫的生物循環(huán)來實現(xiàn)的，包括(1)無機硫化物在好氧硫細菌的作用下被氧化為單質硫和硫酸鹽的過程，稱為硫元素氧化過程；(2)硫酸鹽在細菌的作用下被轉化為有機硫的過程，被稱為硫的同化還原過程；(3)在厭氧環(huán)境條件下，硫酸鹽經(jīng)過硫酸鹽還原菌作用被還原為低價硫化物的過程，稱為異化還原過程。

自然界中能氧化無機硫化物的細菌種類很多，大部分屬于化能自養(yǎng)型，主要可分為三大類：無色硫細菌、光合硫細菌、硫桿菌屬。微生物參與硫素循環(huán)的各個過程，起著重要的作用。目前用于脫除硫化氫的微生物主要是自養(yǎng)硫桿菌屬細菌，此類細菌利用還原態(tài)的硫化物作為能源，由此將硫的不完全氧化物轉化為硫酸等物質，從而去除硫化氫等惡臭物質。微生物催化的硫素轉化途徑為：S^2-→S⁰→SO₃^2-→SO₄^2-

然而目前通常利用的自養(yǎng)型硫氧化細菌進行還原態(tài)無機硫化物的去除應用存在如下缺點：1、在氧化硫化物的同時產(chǎn)生硫酸，一方面抑制了硫氧化菌活性，大量產(chǎn)酸還會導致菌體自溶降低除硫速率；2、需要加入堿進行中和，增加了處理的成本。

目前能夠在pH4.5～9.1的微酸性到堿性條件下將還原態(tài)無機硫化物氧化生成硫酸鹽的化能異養(yǎng)型細菌蠟狀芽孢桿菌的研究未見有報道。因此，篩選一株比較容易培養(yǎng)、在自然環(huán)境下能夠高效去除還原態(tài)無機硫化物的異養(yǎng)型細菌菌株非常重要。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術中硫氧化細菌在去除無機硫化物應用中，氧化硫化物的同時產(chǎn)生硫酸，抑制了硫氧化菌活性，導致菌體自溶、降低除硫速率的問題，提供一株可以耐受最高S^2-濃度達300mg/L的蠟狀芽孢桿菌及其脫除還原態(tài)無機硫化物方面的應用，該菌株具有可以在pH 4.5～9.1范圍內(nèi)高效脫硫的特點。

本發(fā)明的目的可以通過采取以下技術方案達到：

一株蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ZJNB-B3，于2016年6月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學，保藏號為：CCTCC NO.M2016337，于2016年6月30日鑒定樣本存活。

一株蠟狀芽孢桿菌CCTCC NO：M 2016337的應用，能夠用于還原態(tài)無機硫化物脫除。

進一步地，所述蠟狀芽孢桿菌CCTCC NO：M 2016337的應用，該菌株可在pH 4.50～9.10范圍生長，能夠將還原態(tài)無機硫化物氧化生成硫酸鹽；分批培養(yǎng)顯示，該菌株氧化無機硫化物最適初始pH為7.0，最適溫度為30℃，最適初始硫化物S^2-濃度為250mg/L，該菌株在48h能夠將標定濃度244mg/L S^2-降為6.32mg/L，脫硫率達97.4％。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明提供一株蠟狀芽孢桿菌CCTCC NO：M 2016337，以及其應用于氧化還原態(tài)無機硫化物的應用。蠟狀芽孢桿菌CCTCC NO：M 2016337是具有對還原態(tài)無機硫化物有較高氧化能力的細菌。所述菌株屬于異養(yǎng)菌，對生長營養(yǎng)條件要求簡單，生長快速，可以在pH 4.5～9.1較寬范圍生長。所述菌株能夠氧化還原態(tài)無機硫化物成為硫酸根，可以不加入堿在pH 4.5～9.1環(huán)境下進行還原態(tài)無機硫化物的氧化去除，因此可以應用于禽畜屠宰加工、飼料魚粉加工和其他一些食品加工產(chǎn)生的無機硫化物惡臭硫化氫氣體的脫除無害化處理。

附圖說明

圖1是蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3菌株的掃描電子顯微鏡照片。

圖2是蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3菌株能夠耐受不同硫化物S^2-濃度，48小時累計產(chǎn)生的硫酸根圖。

圖3是蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3菌株在氧化初始S^2-濃度為250mg/L，培養(yǎng)溫度為30℃，在不同初始pH值為5、6、7條件下的代謝產(chǎn)生硫酸根變化曲線圖。

圖4是蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3菌株在氧化初始S^2-濃度為250mg/L，最適初始pH值為7時，在25℃、30℃、35℃不同溫度培養(yǎng)下代謝產(chǎn)生硫酸根變化曲線圖。

圖5是蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3菌株在氧化初始S^2-濃度為250mg/L，最適初始pH值為7，最適培養(yǎng)溫度為30℃時，硫酸根、硫化物、pH值隨時間變化曲線圖。

具體實施方式

現(xiàn)參照圖1至圖5以及具體實施例1闡述本發(fā)明：

具體實施例1突變菌株蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3的來源。

申請人在2015年取魚粉加工廠污水排放處沉淀的濕污泥250g，通過不斷添加Na₂S的方法富集、分離得到一株能夠利用無機硫化物的細菌，鑒定結果為蠟狀芽孢桿菌XJ-2菌株，脫硫率達87.1％，分離與鑒定XJ-2菌株的研究論文《一株魚粉加工硫化氫惡臭氣體脫除菌株的分離與鑒定》發(fā)表在2015年9月的環(huán)境工程學報，2015,9(9)：4465～4470。因為菌株XJ-2的脫硫率不是很高，在該論文中所述的XJ-2可以在pH5.0～8.5生長的條件都是在不含有無機硫化物的培養(yǎng)液體下的菌體自然生長狀態(tài)。菌株XJ-2在含有無機硫化物S^2-條件下，能夠耐受最高的硫化物S^2-濃度和氧化產(chǎn)生多少濃度的硫酸根的生理代謝功能尚為不明。

在此前期研究背景下，申請人在2016年使用紫外線誘變技術對蠟狀芽孢桿菌XJ-2菌株進行了誘變，通過篩選得到了脫硫率高達97.4％的突變細菌，經(jīng)過鑒定為蠟狀芽孢桿菌，突變菌株命名為蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。隨后，研究了ZJNB-B3菌株能夠耐受的最高硫化物S^2-濃度，獲得了在含有無機硫化物S^2-條件下，將S^2-氧化產(chǎn)生硫酸根的最適初始pH值、最適培養(yǎng)溫度的生理代謝參數(shù)。

用紫外線對XJ-2菌株進行誘變：

將保存的XJ-2菌種轉接到細菌斜面培養(yǎng)基上，30℃活化培養(yǎng)24h，將活化菌苔轉移到裝有玻璃珠的無菌水三角瓶中，置于30℃、150r/min的條件下?lián)u瓶，制成單細胞菌懸液,細胞濃度約10⁸個/ml。取菌懸液在紫外燈下照射30～60s,取出，30℃恒溫培養(yǎng)24h，然后涂布在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基固體平板上，在30℃培養(yǎng)2天，挑取生長的單菌落進行劃線、分離純化，得到幾株突變菌株，經(jīng)過脫硫率篩選，最后獲得一株脫硫率較高，達97.4％的突變菌株ZJNB-B3。

具體實施例2蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3菌株的鑒定

(1)形態(tài)特性

該菌株革蘭氏染色為陽性，桿菌，細胞大小1.0～1.2×3.0～5.0μm，形態(tài)見掃描電子顯微鏡照片圖1。

(2)分子生物學鑒定

采用16S rDNA通用引物，對細菌的16S rDNA進行PCR擴增，并進行DNA測序，將得到的序列與美國The National Center for Biotechnology Information(NCBI)的GenBank中公開的已知序列經(jīng)過Blast軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)進行比對，目標菌株與已知的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus LN890259.1)相似性達到了100％，根據(jù)分子生物學鑒定結果，將鑒定菌株命名為蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3(Bacillus cereus ZJNB-B3)，具體見基因表。

具體實施例3蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3菌株對不同濃度硫化物的氧化生理代謝研究。

挑取二環(huán)試管斜面培養(yǎng)物至100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)18小時，得到對數(shù)生長期的種子液。按5～10％的體積比將種子接種于pH為7、總量100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，添加Na₂S水溶液，使反應初始S^2-濃度為100，200，250，300，400m_g/L，置于30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)48小時，每隔12h取樣分析瓶內(nèi)液體的硫化物、硫酸根的含量，及pH值變化，結果見圖2。當初始S^2-濃度為400mg/L時，該條件下的0h初始pH高達9.3，在強堿性條件下，反應開始階段細菌被部分殺死而且生長受到抑制，到24小時pH才有所下降到7.53，菌體開始繁殖，48小時pH降為7.17，但產(chǎn)生的硫酸根為1.9mg/L，脫硫效率較低，因此可知菌株最高可以耐受S^2-濃度為300mg/L。圖2還表明了菌株氧化還原態(tài)無機硫化物的最適初始S^2-濃度為250mg/L，此條件氧化S^2-產(chǎn)生的硫酸根濃度最大，達60.5mg/L。

具體實施例4蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3菌株將S^2-氧化產(chǎn)生硫酸根的最適初始pH值、最適培養(yǎng)溫度生理代謝研究。

(1)ZJNB-B3菌株在不同初始pH值下，培養(yǎng)溫度為30℃，氧化初始S^2-濃度為250mg/L能夠積累產(chǎn)生的硫酸根生理代謝變化見圖3，積累產(chǎn)生的硫酸根濃度由高到低的結果為pH7＞pH6＞pH5，因此，菌株將硫化物氧化產(chǎn)生硫酸根的最適初始pH值是7。

(2)ZJNB-B3菌株在初始pH值為7，不同培養(yǎng)溫度下，氧化初始S^2-濃度為250mg/L能夠積累產(chǎn)生的硫酸根生理代謝變化見圖4，積累產(chǎn)生的硫酸根濃度由高到低的結果為30℃＞25℃＞35℃，菌株將硫化物氧化產(chǎn)生硫酸根的最適培養(yǎng)溫度是30℃。

具體實施例5蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3菌株在初始S^2-濃度為250mg/L、最適初始pH值和最適培養(yǎng)溫度下對硫化物的氧化生理代謝研究。

ZJNB-B3菌株在最適初始pH值為7，最適培養(yǎng)溫度30℃培養(yǎng)下，氧化250mg/L硫化物產(chǎn)生的硫酸根和pH值變化見圖5。該菌株在48h能夠將液體中S^2-濃度降為6.32mg/L，脫硫率達97.4％。

該蠟狀芽孢桿菌ZJNB-B3菌可以在pH4.5～9.1較寬范圍將還原態(tài)無機硫化物氧化成硫酸根，可以不加入堿實現(xiàn)在pH4.5～9.1環(huán)境下進行還原態(tài)無機硫化物的氧化脫除，因此可應用于禽畜屠宰加工、飼料魚粉加工或者其它食品加工產(chǎn)生的無機硫化物惡臭硫化氫氣體的脫除無害化處理。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施例，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明揭露的范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其構思加以等同替換或改變，都屬于本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 寧波大學

<120> 一株蠟狀芽孢桿菌及其在氧化無機硫化物中的應用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1295

<212> DNA

<213> 蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）

<400> 1

aacacgtggg taacctgccc ataagactgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg 60

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