本發(fā)明涉及基因檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種檢測(cè)ALDH2基因突變的探針及其應(yīng)用和試劑盒。
背景技術(shù)：
：乙醛脫氫酶(AcetaldehydeDehydrogenase，ALDH)由ALDH基因編碼，可分為ALDH1A1、ALDH1B1和ALDH2。其中，ALDH2在人體內(nèi)把乙醛催化成乙酸的能力最強(qiáng)。ALDH2基因位于第12號(hào)染色體(12q24)，由13個(gè)外顯子構(gòu)成，編碼的酶蛋白肽鏈由500個(gè)氨基酸殘基組成。研究表明，該基因的多態(tài)性在亞洲人群中很常見，并且可能影響人群的飲酒行為。ALDH2與亞洲人群最為密切的是ALDH2基因的rs671位點(diǎn)G→A突變，可導(dǎo)致其編碼的多肽鏈谷氨酸(Glu)變?yōu)橘嚢彼?Lys)。ALDH2基因與酒精在人體內(nèi)的分解代謝有關(guān)，還參與硝酸甘油的代謝。飲酒后吸收進(jìn)入體內(nèi)的乙醇，主要在肝臟進(jìn)行代謝。乙醇被氧化成乙醛后，95％在肝臟變成乙酸，余下5％在其他組織及血液被代謝掉。乙醇在體內(nèi)代謝產(chǎn)物是乙醛，是導(dǎo)致酒精性肝病的主要原因。由于ALDH2G(ALDH2*1)的基因序列發(fā)生突變形成ALDH2L(ALDH2*2)等位基因，二者隨機(jī)組合可編碼形成ALDH2GG、ALDH2GL或ALDH2LL，3種基因型。ALDH2*1/ALDH2*1基因型(野生型)的飲酒者，體內(nèi)把乙醛氧化成乙酸能力很強(qiáng)，對(duì)乙醇耐受性高，可以過量飲酒，但應(yīng)適當(dāng)節(jié)制。ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突變型雜合型)的飲酒者，血液中乙醛的濃度是前者的6倍，對(duì)酒有一定的耐受性，可以適量飲酒。ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突變型純合型)的飲酒者血液中乙醛的濃度是前者的19倍，對(duì)酒敏感，沒有耐受性，飲酒后很快出現(xiàn)嚴(yán)重不適現(xiàn)象。大量乙醛滯留在體內(nèi)，除了損傷肝臟導(dǎo)致脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌，還與增加食道癌、口咽癌和胃癌、冠心病、心肌梗死等風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。硝酸甘油作為抗心絞痛的經(jīng)典藥物，已有多位學(xué)者對(duì)其生物轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究，2002年Chen等發(fā)現(xiàn)在巰基化合物參與下，ALDH2能夠催化硝酸甘油生成1，2-二硝酸甘油和亞硝基硫醇，之后ALDH2在硝酸甘油代謝中的重要作用引起越來越多學(xué)者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2*1/ALDH2*1基因型(野生型)具有ALDH2的正常活力，ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突變型雜合型)存在6％的酶活力，而ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突變型純合型)則完全喪失酶的活力，使硝酸甘油無法產(chǎn)生一氧化氮，難以發(fā)揮藥效。ALDH2除了與酒精性肝病等消化道疾病息息相關(guān)外，還與其他一些疾病相關(guān)，如消化道腫瘤、白血病、帕金森病(PD)等。ALDH2位點(diǎn)的多態(tài)性為先天遺傳，與任何疾病的發(fā)生無關(guān)，與年齡無關(guān)。研究表明，ALDH2*2在人類各族群中的分布是不同的，亞洲人種出現(xiàn)頻率較高。中國(guó)漢族ALDH2*2的頻率為15.5％，墨西哥1.0％，日本人23.8％，歐洲人0％，南非人0％。中國(guó)人群中廣東漢族最高，達(dá)31％，武漢漢族12％，洛陽(yáng)人15％，上海人25％，臺(tái)灣人30％。此外，ALDH2各基因型的發(fā)生率在男女性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，ALDH2基因多態(tài)性檢測(cè)將為硝酸甘油的用藥、飲酒指導(dǎo)及相關(guān)高風(fēng)險(xiǎn)疾病的提示提供有效的參考依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用意義。目前，用于ALDH2基因分型的方法有以下幾種，各有其特點(diǎn)。1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR-RFLP)PCR-RFLP為最為經(jīng)典的SNP分型方法，它先利用PCR擴(kuò)增跨越多態(tài)位點(diǎn)的靶DNA，然后用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物，最后根據(jù)酶切產(chǎn)物的電泳條帶判斷基因型。例如Hayashida等曾用該法對(duì)ALDH2進(jìn)行分型，PCR擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為430bp，野生型等位基因(ALDH2*1)會(huì)被AcuⅠ酶切成296bp和134bp2個(gè)片段，反之，突變型等位基因(ALDH2*2)則不能被AcuⅠ酶切。這樣野生型純合子ALDH2*1/*1的條帶為296bp、134bp，雜合子ALDH2*1/*2的條帶為430bp、296bp、134bp，突變型純合子ALDH2*2/*2的條帶為430bp。PCR-RFLP分型法操作簡(jiǎn)單，所需模板DNA量少，無需使用大型貴重儀器，實(shí)驗(yàn)中不涉及危險(xiǎn)試劑，安全性高。但該法的一個(gè)最大缺點(diǎn)在于，會(huì)因?yàn)閮?nèi)切酶的活性、酶切時(shí)間、酶切體系的不恰當(dāng)?shù)仍蛟斐杉訇幮曰蚣訇?yáng)性而出現(xiàn)基因型的誤判。2.等位基因特異性PCR(allelespecificPCR，AS-PCR)AS-PCR的基本原理是根據(jù)SNP位點(diǎn)的堿基特點(diǎn)設(shè)計(jì)2條等位基因特異引物(針對(duì)于野生型等位基因的P1、針對(duì)突變型等位基因的P2)，它們的3’末端與SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)(或相同)，另需一條按常規(guī)方法設(shè)計(jì)的公共用引物P3。用P1、P3作引物，在野生型等位基因中有擴(kuò)增產(chǎn)物，在突變型等位基因中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，用P2、P3作引物，情況則剛好相反。PCR結(jié)束后，用凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無，從而確定基因型。AS-PCR方法避免采取酶切方法，步驟更簡(jiǎn)潔，但是等位基因特異性PCR擴(kuò)增方法的假陽(yáng)性率較高，其對(duì)實(shí)驗(yàn)要求較嚴(yán)格。3.Taqman探針技術(shù)Taqman探針技術(shù)在普通PCR的基礎(chǔ)上增加熒光標(biāo)記的探針，隨著PCR產(chǎn)物的不斷增加，熒光的強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，則可以檢測(cè)到一個(gè)熒光增長(zhǎng)曲線。該法的主要不足是采用熒光淬滅及雙末端標(biāo)記技術(shù)，其定量檢測(cè)受酶活性的影響；本底較強(qiáng)，有時(shí)無法鑒別高度相關(guān)序列；探針標(biāo)記以及實(shí)驗(yàn)儀器成本較高，不便普及應(yīng)用。4.高分辨率熔解曲線法高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(highresolutionmelting，HRM)是在實(shí)時(shí)熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，它在PCR體系中加入飽和雙鏈DNA結(jié)合染料，在PCR結(jié)束后制作高分辨率熔解曲線，根據(jù)熔解曲線的不同來對(duì)樣品進(jìn)行分型。該方法因其快速、通量大、使用成本低、結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍的關(guān)注。但HRM技術(shù)對(duì)儀器溫度的均一性要求非常高，需LightCycleryTM480PCR儀或LightScanner等價(jià)格高昂的專用儀器及精密的分析軟件。另外，該法要求擴(kuò)增片段的大小在400bp以下，引物設(shè)計(jì)受到局限，PCR條件的優(yōu)化比較復(fù)雜。5.直接測(cè)序法。測(cè)序法是檢測(cè)SNP的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確度高。包括直接測(cè)序(雙脫氧鏈終止法)、焦磷酸測(cè)序及微測(cè)序等。測(cè)序需要一些特殊的儀器設(shè)備，需要專業(yè)人員操作，費(fèi)用高，周期長(zhǎng)；對(duì)PCR產(chǎn)物的量、純度及特異性要求高，PCR后操作步驟繁瑣。測(cè)序法目前在臨床檢測(cè)方面的應(yīng)用還是有一定的困難，多作為其他分析方法的確認(rèn)。6.變性高效液相色譜法。該方法的原理基于發(fā)生錯(cuò)配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征的差異，利用色譜方法進(jìn)行分離。由于雜合雙鏈在突變位點(diǎn)處出現(xiàn)錯(cuò)配，易于形成“Y”型結(jié)構(gòu)，與色譜柱的固定相結(jié)合能力降低，因此雜合雙鏈DNA比純合雙鏈DNA優(yōu)先洗脫出來，通過洗脫峰的改變可以判斷是否存在突變。但它只可判斷有無突變，不能確定SNP的位置和類型，需用標(biāo)準(zhǔn)樣品或結(jié)合測(cè)序驗(yàn)證，且需要昂貴特殊儀器及專業(yè)分析軟件，這也是DHPLC未能得以廣泛推行的原因之一。此外，檢測(cè)過程需要打開反應(yīng)管，容易造成污染。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種檢測(cè)ALDH2基因突變的探針，該探針可針對(duì)ALDH2基因的rs671位點(diǎn)的G→A突變進(jìn)行檢測(cè)，其具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、假陽(yáng)性率低等特點(diǎn)。本發(fā)明的第二目的在于提供上述的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針在制備用于檢測(cè)ALDH2基因突變的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三目的在于提供一種試劑盒，該試劑盒含有上述的探針，可用于ALDH2基因的rs671位點(diǎn)的G→A突變進(jìn)行檢測(cè)，其具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、假陽(yáng)性率低、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低等特點(diǎn)。本發(fā)明的第四目的在于提供上述的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針在檢測(cè)ALDH2基因突變中的應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種檢測(cè)ALDH2基因突變的探針，其包括SEQIDNO.1所示的檢測(cè)探針，以及SEQIDNO.2-3所示的捕獲探針中的一種或兩種，檢測(cè)探針的5’端或3’端標(biāo)記有用于結(jié)合催化酶的親和物。上述的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針在制備用于檢測(cè)ALDH2基因突變的試劑盒中的應(yīng)用。一種試劑盒，其包括上述的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針。上述的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針在檢測(cè)ALDH2基因突變中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種檢測(cè)ALDH2基因突變的探針及其應(yīng)用和試劑盒的有益效果是：本發(fā)明提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針，其包括SEQIDNO.1所示的檢測(cè)探針，以及SEQIDNO.2-3所示的捕獲探針中的一種或兩種。其中，SEQIDNO.2所示的捕獲探針為野生型捕獲探針，可對(duì)野生型ALDH2基因檢測(cè)，SEQIDNO.3所示的捕獲探針為突變型捕獲探針，可對(duì)突變型ALDH2基因檢測(cè)。任意一種捕獲探針與檢測(cè)探針配合，在EFIRM技術(shù)平臺(tái)上均能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)ALDH2基因的rs671位點(diǎn)是否發(fā)生了G→A突變檢測(cè)，具有檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、假陽(yáng)性率低、特異性高、靈敏度高，成本低、操作簡(jiǎn)單方便等特點(diǎn)，為ALDH2基因突變的檢測(cè)提供了一種全新的檢測(cè)策略。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明采用實(shí)施例1提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針檢測(cè)不同濃度的待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果；圖2為本發(fā)明采用實(shí)施例2提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針檢測(cè)不同濃度的待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果；圖3為本發(fā)明采用實(shí)施例3提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針檢測(cè)三份樣本的檢測(cè)結(jié)果；圖4為本發(fā)明實(shí)施例8中對(duì)三份樣本的ALDH2基因rs671位點(diǎn)區(qū)域的測(cè)序結(jié)果圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針及其應(yīng)用和試劑盒進(jìn)行具體說明。一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)ALDH2基因突變的探針，該探針其包括SEQIDNO.1所示的檢測(cè)探針，以及SEQIDNO.2-3所示的捕獲探針中的一種或兩種，所述檢測(cè)探針的5’端或3’端標(biāo)記有用于結(jié)合催化酶的親和物。該探針基于人的ALDH2基因的rs671位點(diǎn)G→A突變進(jìn)行設(shè)計(jì)，可用于在電場(chǎng)誘導(dǎo)釋放和測(cè)量(EFIRM)技術(shù)平臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè)。該探針由本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的探索研究后得到，具有特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)。其中，SEQIDNO.2所示的捕獲探針為野生型捕獲探針，可將野生型ALDH2基因(rs671位點(diǎn)為G)片段捕獲固定。SEQIDNO.3所示的捕獲探針為突變型捕獲探針，可用于將突變型ALDH2基因(rs671位點(diǎn)為A)片段捕獲固定。各捕獲探針與檢測(cè)探針配合，在EFIRM技術(shù)平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對(duì)ALDH2基因的rs671位點(diǎn)是否發(fā)生了突變的檢測(cè)。相較于現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)，通過本發(fā)明提供的探針和EFIRM技術(shù)的結(jié)合，其具有操作簡(jiǎn)便快速(待測(cè)樣本處理方法簡(jiǎn)便)、檢測(cè)時(shí)間短(整個(gè)檢測(cè)過程耗時(shí)約30min，半個(gè)小時(shí)即可輸出結(jié)果)、特異性強(qiáng)(需要捕獲探針和檢測(cè)探針的雙特異性識(shí)別結(jié)合后，才具有檢出信號(hào))、靈敏度高(在電場(chǎng)誘導(dǎo)作用下，即微量的目標(biāo)序列能夠被捕獲，并通過電信號(hào)的放大作用，而輸出檢測(cè)信號(hào))、成本低(檢測(cè)過程中所用的試劑簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低)等特點(diǎn)。兩種捕獲探針以及檢測(cè)探針的序列長(zhǎng)度和堿基序列均是本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的探索優(yōu)化篩選后得到，具有較強(qiáng)的特異性和靈敏度，能夠有效地將相應(yīng)目標(biāo)序列捕獲固定，具有非常好的特異性。檢測(cè)探針的5’端或3’端標(biāo)記有用于結(jié)合催化酶的生物素，生物素的作用在于與鏈霉親和素標(biāo)記的催化酶結(jié)合，通過催化酶催化底物產(chǎn)生的電流釋放檢測(cè)信號(hào)。容易理解，生物素可以采用其他類型的物質(zhì)替代，例如地高辛或者異硫氰酸熒光素等。只要檢測(cè)探針的5’端或3’端標(biāo)記有用于結(jié)合催化酶的親和物即屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另一方面，本發(fā)明還提供了上述的探針在制備用于檢測(cè)ALDH2基因突變的試劑盒中的應(yīng)用。目前來說，基于EFIRM技術(shù)平臺(tái)用于檢測(cè)ALDH2基因突變中尤其是檢測(cè)ALDH2基因的rs671位點(diǎn)G→A突變的試劑盒基本沒有。本發(fā)明的試劑盒填補(bǔ)了這一檢測(cè)領(lǐng)域的空白，提供了更加便捷、快速、成本低、特異性好、靈敏度高的用于檢測(cè)ALDH2基因的rs671位點(diǎn)G→A突變的試劑盒，有效地克服了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)中存在的問題。為檢測(cè)ALDH2基因的s671位點(diǎn)的G→A突變提供了一種全新的檢測(cè)策略。優(yōu)選地，上述探針以溶液的形式獨(dú)立存在，例如捕獲探針以含有捕獲探針的捕獲探針溶液的形式存在，檢測(cè)探針以含有檢測(cè)探針的檢測(cè)探針溶液的形式存在。各探針溶液含有的探針濃度為可以根據(jù)實(shí)際情況設(shè)置。優(yōu)選地，各探針溶液含有的探針終濃度為0.5～1.5μM。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括將探針的捕獲探針固定至檢測(cè)孔板的固定物。固定物包括導(dǎo)電聚合物和離子化合物。導(dǎo)電聚合物選自吡咯、苯胺和噻吩中的一種，當(dāng)然，導(dǎo)電聚合物也可以是其他的導(dǎo)電聚合物材料。離子化合物選自氯化鈉和氯化鉀中的任意一種。導(dǎo)電聚合物帶正電，其在電場(chǎng)的作用下形成網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，被沉積在反應(yīng)孔的底部，網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)能夠穩(wěn)定地將捕獲探針固定在底部，有助于提高捕獲探針的穩(wěn)定性和捕獲能力。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括催化酶，催化酶是帶有標(biāo)記物的辣根過氧化物酶，優(yōu)選地，催化酶是帶有鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶。當(dāng)然，催化酶也可以是帶有標(biāo)記物的堿性磷酸酶，標(biāo)記物為地高辛抗體、異硫氰酸熒光素抗體或鏈霉親和素中的任意一種，標(biāo)記物與親和物相對(duì)應(yīng)，其可根據(jù)檢測(cè)探針上的親和物的類別進(jìn)行選擇。當(dāng)親和物是生物素時(shí)，標(biāo)記物為鏈霉親和素；當(dāng)親和物是地高辛?xí)r，標(biāo)記物為地高辛抗體；當(dāng)親和物是異硫氰酸熒光素時(shí)，標(biāo)記物為異硫氰酸熒光素抗體。只要親和物與標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)，可相互結(jié)合即可。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括底物，底物的類別根據(jù)催化酶的類別選擇。當(dāng)催化酶為辣根過氧化物酶時(shí)，底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基聯(lián)苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)和OPD(o-Phenylenediamine、鄰苯二胺)中的任意一種。TMB、ABTS和OPD均是辣根過氧化物酶的底物，在辣根過氧化物酶的催化作用下發(fā)生顯色反應(yīng)并伴隨電流產(chǎn)生，有助于提高檢測(cè)信號(hào)的釋放。當(dāng)催化酶為堿性磷酸酶時(shí)，底物是對(duì)BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽)和NBT(NitrotetrazoliumBluechloride、四唑硝基藍(lán))的組合物、硝基苯磷酸鹽、4-硝基苯磷酸二鈉、萘酚AS-BI磷酸鹽、萘酚-AS-MX-磷酸鹽中的任意一種。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括清洗液，清洗液包括洗液A和洗液B，洗液A是含SDS的SSC緩沖液，洗液B是含Tween20的PBS緩沖液。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括稀釋液，稀釋液是含酪蛋白的PBS緩沖液。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括雜交buffer。用于提高探針和目標(biāo)序列的結(jié)合效率。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括檢測(cè)孔板，檢測(cè)孔板的反應(yīng)孔內(nèi)固定有上述捕獲探針。需要說明的是，在其他的實(shí)施例中，捕獲探針也可不用固定在檢測(cè)孔板的反應(yīng)孔內(nèi)，在使用時(shí)采用相應(yīng)方法將捕獲探針固定至檢測(cè)孔板也是可以的。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1本實(shí)施例提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針包括野生型捕獲探針和檢測(cè)探針，檢測(cè)探針的5’端標(biāo)記有生物素(Biotin)。野生型捕獲探針的堿基序列如下：5’-ATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTCACTTCAGTGTA-3’(SEQIDNO.2)，其中，下劃線部分用于與野生型ALDH2基因的覆蓋了rs671位點(diǎn)(G)的目標(biāo)序列(SEQIDNO.4)的靶區(qū)域(5’-TACACTGAAGTGA-3’)反向互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而將野生型目標(biāo)序列捕獲固定。另外，該野生型捕獲探針5’端的第1-77位富含胸腺嘧啶(T)的區(qū)域?yàn)檠娱L(zhǎng)臂，用于提高其與野生型目標(biāo)序列的捕獲結(jié)合概率，進(jìn)而提高檢測(cè)的靈敏度。從野生型ALDH2基因上的選取的覆蓋rs671位點(diǎn)的野生型目標(biāo)序列(SEQIDNO.4)的堿基序列如下：5’-GCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGC-3’，其中，下劃線部分為rs671位點(diǎn)(G)。檢測(cè)探針的堿基序列如下：5’-CTTATGGAGCCCCCAGCAGGTCCCACACTCACA-3’(SEQIDNO.1)，其中，下劃線部分用于與野生型目標(biāo)序列(SEQIDNO.4)上的靶區(qū)域(5’-TGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTC-3’)互補(bǔ)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)序列的特異性結(jié)合和檢測(cè)。本實(shí)施例提供的探針可用于對(duì)野生型ALDH2基因(rs671位點(diǎn)為G)的檢測(cè)，具有特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)。實(shí)施例2本實(shí)施例提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針包括突變型捕獲探針(SEQIDNO.3)和檢測(cè)探針(SEQIDNO.1)，檢測(cè)探針的堿基序列和結(jié)構(gòu)同實(shí)施例1。突變型捕獲探針的堿基序列如下：5’-ATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTCACTTTAGTGTA-3’(SEQIDNO.3)，其中，下劃線部分用于與突變型ALDH2基因的覆蓋了rs671位點(diǎn)(A)的突變型目標(biāo)序列(SEQIDNO.5)的靶區(qū)域(5’-TACACTAAAGTGA-3’，下劃線為rs671位點(diǎn)(A))反向互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而將突變型目標(biāo)序列捕獲固定。另外，該突變型捕獲探針5’端的第1-77位富含胸腺嘧啶(T)的區(qū)域?yàn)檠娱L(zhǎng)臂，通過延長(zhǎng)臂的修飾，可用于提高突變型捕獲探針與突變型目標(biāo)序列(SEQIDNO.5)的捕獲結(jié)合概率，提高檢測(cè)的靈敏度。從突變型ALDH2基因上的選取的突變型目標(biāo)序列(SEQIDNO.5)的堿基序列如下：5’-GCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGC-3’，其中，下劃線部分為rs671位點(diǎn)(A)。本實(shí)施例提供的探針可用于對(duì)突變型ALDH2基因(rs671位點(diǎn)為A)的檢測(cè)，具有特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)。實(shí)施例3本實(shí)施例提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針包括：野生型捕獲探針、突變型捕獲探針以及檢測(cè)探針。野生型捕獲探針的堿基序列同實(shí)施例1，突變型捕獲探針的堿基序列同實(shí)施例2，檢測(cè)探針的堿基序列和結(jié)構(gòu)同實(shí)施例1。本實(shí)施例提供的探針不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品的ALDH2基因rs671位點(diǎn)的突變情況進(jìn)行檢測(cè)，還能夠區(qū)別出待測(cè)樣品是野生型純合子、還是突變型雜合子或者是突變型純合子，同樣具有特異性好、靈敏度高、假陽(yáng)性率低等特點(diǎn)。實(shí)施例4本實(shí)施例提供了試劑盒，該試劑盒包括上述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針。該試劑盒可用于對(duì)ALDH2基因rs671位點(diǎn)的G→A突變進(jìn)行檢測(cè)，其具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、假陽(yáng)性率低等特點(diǎn)。實(shí)施例5本實(shí)施例提供了試劑盒，該試劑盒不僅包括上述實(shí)施例1-3中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)檢測(cè)ALDH2基因突變的探針。還包括帶有鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶、TMB、含SDS的2×SSC緩沖液以及含Tween20的PBS緩沖液、吡咯溶液、氯化鉀溶液、雜交buffer。容易理解，在其他的實(shí)施例中，試劑盒可包括鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶、TMB、含SDS的2×SSC緩沖液以及含Tween20的PBS緩沖液、吡咯溶液、氯化鉀溶液、雜交buffer中的一種或多種。本實(shí)施例提供的試劑盒的效果同實(shí)施例4。實(shí)施例6實(shí)施例1提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針的靈敏度驗(yàn)證。以實(shí)施例1提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針的野生型捕獲探針(命名為ALDH2-WLSCP13，SEQIDNO.2)為實(shí)驗(yàn)組、以SEQIDNO.6所示的捕獲探針(命名為ALDH2-WCP13，堿基序列為：5’-TCACTTCAGTGTAGCATGGCCTTAG-3’，其第1-13位用于與野生型目標(biāo)序列(SEQIDNO.4)的靶區(qū)域結(jié)合，捕獲目標(biāo)序列；第14-25位為延長(zhǎng)臂，但該序列和長(zhǎng)度與野生型捕獲探針的延長(zhǎng)臂不同)為對(duì)照組、以不同濃度(1nM、100pM、10pM、1pM)的SEQIDNO.4所示的目標(biāo)序列(寡核苷酸片段)為待測(cè)樣本，驗(yàn)證實(shí)施例1提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針的靈敏度，檢測(cè)方法如下。1捕獲探針(以下簡(jiǎn)稱CP)固定1.1配制吡咯(pyrrole)與CP的混合液取1個(gè)1.5mL離心管，依次加入超純水885μl，離子化合物100μl3MKCl，渦旋震蕩混勻，離心；加入導(dǎo)電聚合物5μlpyrrole(≥98.0％，購(gòu)自Sigma，貨號(hào)W338605)，渦旋震蕩混勻，離心；加入10μl100μM的CP(實(shí)驗(yàn)組加入SEQIDNO.2所示的野生型捕獲探針(ALDH2-WLSCP13)、對(duì)照組加入SEQIDNO.6所示的野生型捕獲探針(ALDH2-WCP13)；渦旋震蕩混勻后離心，備用。1.2固定捕獲探針在96孔的檢測(cè)孔板(E-plate)(其結(jié)構(gòu)和工作原理可見參考文獻(xiàn)201620769829.2)上，按其操作說明書，往反應(yīng)孔加入30μl的已配制好的pyrrole與CP的混合液(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各自都設(shè)置5個(gè)反應(yīng)孔，均加入各自對(duì)應(yīng)的混合液，其中四個(gè)孔用于后續(xù)步驟加入不同濃度的待測(cè)樣本，作為檢測(cè)孔，剩下的一個(gè)孔用于做空白對(duì)照孔)，加樣時(shí)槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM儀器上(其工作原理和結(jié)構(gòu)可參考申請(qǐng)日為2016年8月11日、申請(qǐng)?zhí)枮?01610658321.X、名稱為保持結(jié)構(gòu)及包括保持結(jié)構(gòu)的檢測(cè)儀的專利文獻(xiàn))，按其操作說明書，進(jìn)行電場(chǎng)操作。1.3EFIRM電場(chǎng)處理在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對(duì)應(yīng)列，電場(chǎng)參數(shù)設(shè)置為：電壓A：350mV，1s；電壓B:950mV，1s；進(jìn)行9個(gè)循環(huán)。電場(chǎng)處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。1.4E-plate板清洗：在洗板機(jī)程序上選擇對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行下一步，樣本上樣操作。其中，洗液A為含0.05％(質(zhì)量百分比)SDS的2×SSC緩沖液。2樣本雜交2.1雜交buffer預(yù)處理取雜交buffer(購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號(hào):B548207)平衡至室溫。2.2配制待測(cè)樣本將待測(cè)樣本與雜交buffer按體積比1:2混合，渦旋振蕩后離心，即可上樣進(jìn)行檢測(cè)。2.3加待測(cè)樣本在E-plate上，在對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔里加入上述待測(cè)樣本與雜交buffer混合后的混合液30μl，且控制待測(cè)樣本在各組的三個(gè)檢測(cè)孔中的終濃度依次為1nM、100pM、10pM、5pM。各組的空白對(duì)照孔僅加入相同體積的雜交buffer。需要注意的是:加樣時(shí)槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進(jìn)行電場(chǎng)操作。2.4EFIRM電場(chǎng)處理在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對(duì)應(yīng)列，電場(chǎng)參數(shù)設(shè)置為：電壓A：300mV，1s；電壓B:500mV，1s；進(jìn)行150個(gè)循環(huán)。電場(chǎng)處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。2.5室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺(tái)上室溫孵育15min。2.6E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行DP加樣操作。3檢測(cè)探針(DP)結(jié)合3.1DP溶液配制從4℃冰箱取出稀釋液，取1個(gè)1.5mL離心管，加入990μl的稀釋液，往各組的反應(yīng)孔中加入對(duì)應(yīng)的10μl100μMDP(SEQIDNO.1，即實(shí)施例1中的檢測(cè)探針)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。其中，稀釋液為含0.1％(質(zhì)量體積比)酪蛋白的PBS緩沖液(pH7.4)。酪蛋白的作用是封閉非特異性位點(diǎn)，以提高檢測(cè)的靈敏性和準(zhǔn)確度。3.2加樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在對(duì)應(yīng)的孔加入對(duì)應(yīng)DP溶液30μl，加樣時(shí)槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進(jìn)行電場(chǎng)操作。3.3室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺(tái)上室溫孵育15min。3.4E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行加樣操作。4鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(Poly-HRP)與生物素結(jié)合4.1Poly-HRP溶液配制從4℃冰箱取出稀釋液，取1個(gè)1.5mL離心管，加入999μl的稀釋液，加入1μl的酶液(含Poly-HRP，濃度為0.5mg/ml，購(gòu)自thermofisher,產(chǎn)品名稱為PierceTMStreptavidinPoly-HRP，貨號(hào)為21140，單位規(guī)格為0.5mL)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。4.2加酶液在對(duì)應(yīng)的各孔加入上述稀釋液和酶液混合后的混合液30μl，Poly-HRP通過其標(biāo)記的鏈霉親和素與檢測(cè)探針上的生物素識(shí)別并結(jié)合。4.3室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺(tái)上室溫孵育15min。4.4E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(3bottom，3top)，清洗液選擇洗液B。清洗完畢，立刻進(jìn)行TMB加樣操作。其中，洗液B為含0.1％(質(zhì)量百分比)Tween20的PBS緩沖液。5數(shù)據(jù)讀取5.1加底物在反應(yīng)孔中加入底物60μl，加樣時(shí)槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極。加完立刻到EFIRM上進(jìn)行電場(chǎng)操作。其中，底物為含TMB的溶液(購(gòu)自thermofisher，產(chǎn)品貨號(hào)為34028，名稱為1-StepTMUltraTMB-ELISA)。加入酶的底物，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流，檢測(cè)各孔內(nèi)電流值即完成整個(gè)檢測(cè)過程。5.2EFIRM電場(chǎng)讀數(shù)在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對(duì)應(yīng)列，電場(chǎng)參數(shù)設(shè)置為：電壓A：-200mV，60s；電壓B:0mV，0s；進(jìn)行1個(gè)循環(huán)。電場(chǎng)處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。儀器將自動(dòng)完成檢測(cè)工作，檢測(cè)數(shù)據(jù)自動(dòng)上傳到云計(jì)算平臺(tái)。根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制柱狀圖，橫坐標(biāo)為檢測(cè)組的類別，縱坐標(biāo)為各檢測(cè)組中各反應(yīng)孔中的電流值(Current)，單位為納安(nA)，本實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果如表1和圖1所示。表1.采用實(shí)施例1提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針檢測(cè)不同濃度的待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果由表1和圖1的結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組的ALDH2-WCP13，實(shí)施例1提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針的野生型捕獲探針ALDH2-WLSCP13的靈敏度更高，其在待測(cè)樣本的濃度低至1pM的情況下也能夠?qū)⒋郎y(cè)樣本檢出，其檢出電流信號(hào)達(dá)到234.7nA，比對(duì)照組的電流信號(hào)值(107.32nA)高。由此表明，通過延長(zhǎng)臂的設(shè)置，SEQIDNO.2所示的野生型捕獲探針的捕獲能力較好，能夠?qū)⒌蜐舛鹊哪繕?biāo)序列捕獲固定，使得實(shí)施例1提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針具有較高的靈敏度。實(shí)施例7實(shí)施例2提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針的靈敏度驗(yàn)證。以實(shí)施例2提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針的野生型捕獲探針(SEQIDNO.3，命名為ALDH2-MLSCP13)為實(shí)驗(yàn)組、以SEQIDNO.7所示的捕獲探針(命名為ALDH2-MCP13，堿基序列為：5’-TCACTTTAGTGTAGCATGGCCTTAG-3’，其中，第1-13位與突變型目標(biāo)序列的靶區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合)為對(duì)照組、以不同濃度(1nM、100pM、10pM、1pM)的SEQIDNO.5所示的突變型目標(biāo)序列(寡核苷酸片段)為待測(cè)樣本，檢測(cè)實(shí)施例2提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針的靈敏度，檢測(cè)方法與實(shí)施例6基本相同。檢測(cè)結(jié)果如表2和圖2所示。表1.采用實(shí)施例2提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針檢測(cè)不同濃度的待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果由表2和圖2的結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組的ALDH2-MCP13，實(shí)施例2提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針的突變型捕獲探針ALDH2-MLSCP13的檢出限更低，其在待測(cè)樣本的各濃度下均有較強(qiáng)的檢出電流信號(hào)值。由此，進(jìn)一步表明，通過在突變型探針的5’端加入的延長(zhǎng)臂，提高了突變型捕獲探針(SEQIDNO.3)的捕獲能力，能夠?qū)⒌蜐舛鹊哪繕?biāo)序列(SEQIDNO.5)捕獲固定，使得實(shí)施例2提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針也具有較高的靈敏度。實(shí)施例8本實(shí)施例提供了采用實(shí)施例3提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針檢測(cè)ALDH2基因rs671位點(diǎn)突變情況的方法，步驟如下。1捕獲探針(以下簡(jiǎn)稱CP)固定1.1配制吡咯(pyrrole)與CP的混合液取1個(gè)1.5mL離心管，依次加入超純水885μl，離子化合物100μl3MKCl，渦旋震蕩混勻，離心；加入導(dǎo)電聚合物5μlpyrrole，渦旋震蕩混勻，離心；加入10μl100μM的CP；渦旋震蕩混勻后離心，備用。1.2固定捕獲探針在96孔的檢測(cè)孔板(E-plate)上，按其操作說明書，往反應(yīng)孔加入30μl的已配制好的pyrrole與CP的混合液，加樣時(shí)槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM儀器上，按其操作說明書，進(jìn)行電場(chǎng)操作。設(shè)置2個(gè)檢測(cè)組，分別為野生型檢測(cè)組和突變型檢測(cè)組。每個(gè)檢測(cè)組設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔，一個(gè)陰性對(duì)照孔，一個(gè)樣本1的檢測(cè)孔、一個(gè)樣本2的檢測(cè)孔和一個(gè)樣本3的檢測(cè)孔(樣本的檢測(cè)孔根據(jù)需要檢測(cè)的樣本數(shù)量確定，可以是一個(gè)，或者多個(gè))。野生型檢測(cè)組的各反應(yīng)孔里加入野生型捕獲探針(SEQIDNO.2)；突變型檢測(cè)組的各反應(yīng)孔里加入突變型捕獲探針(SEQIDNO.3)。1.3EFIRM電場(chǎng)處理在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對(duì)應(yīng)列，電場(chǎng)參數(shù)設(shè)置為：電壓A：350mV，1s；電壓B:950mV，1s；進(jìn)行9個(gè)循環(huán)。電場(chǎng)處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。1.4E-plate板清洗：在洗板機(jī)程序上選擇對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行下一步，樣本上樣操作。其中，洗液A為含0.05％(質(zhì)量百分比)SDS的2×SSC緩沖液。2樣本雜交2.1雜交buffer預(yù)處理取雜交buffer(購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號(hào):B548207)平衡至室溫。2.2配制待測(cè)樣本待測(cè)樣本(樣本采集方式：小心取出口腔拭子；握住手柄，將拭子分別伸進(jìn)兩側(cè)口腔，使拭子頭部充分接觸左側(cè)臉頰內(nèi)部/左側(cè)上下牙床處粘膜，用刷牙的力度上下擦動(dòng)，同時(shí)，旋轉(zhuǎn)拭子，讓拭子頭部充分接觸口腔粘膜，將拭子頭放置在采樣管中，加PBS浸泡，并震蕩重懸細(xì)胞，于-20℃保存。)從-20℃冰箱取出，放進(jìn)4℃冰箱解凍。完全溶解后，使用煮沸法或0.4MNaOH預(yù)處理待測(cè)樣本，然后將待測(cè)樣本與雜交buffer按體積比1:2混合，渦旋振蕩后離心，即可上樣進(jìn)行檢測(cè)。2.3加待測(cè)樣本在E-plate上，在對(duì)應(yīng)的孔里加入上述待測(cè)樣本(樣本1、樣本2或樣本3)與雜交buffer混合后的混合液30μl。(需要注意的是:加樣時(shí)槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進(jìn)行電場(chǎng)操作。)野生型檢測(cè)組的陽(yáng)性對(duì)照孔加入含ALDH2-WT(野生型寡核酸片段，SEQIDNO.4)的陽(yáng)性對(duì)照Buffer混合液，突變型檢測(cè)組的陽(yáng)性對(duì)照孔加入含ALDH2-MT(突變型寡核酸片段，SEQIDNO.5)的陽(yáng)性對(duì)照Buffer混合液，各檢測(cè)組的陰性對(duì)照孔均僅加入Buffer。樣本檢測(cè)孔加入相應(yīng)的待測(cè)樣本(樣本1、樣本2或樣本3)與雜交buffer混合后的混合液。2.4EFIRM電場(chǎng)處理在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對(duì)應(yīng)列，電場(chǎng)參數(shù)設(shè)置為：電壓A：300mV，1s；電壓B:500mV，1s；進(jìn)行150個(gè)循環(huán)。電場(chǎng)處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。2.5室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺(tái)上室溫孵育15min。2.6E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行DP加樣操作。3DP結(jié)合3.1DP溶液配制從4℃冰箱取出稀釋液，取1個(gè)1.5mL離心管，加入990μl的稀釋液，往各檢測(cè)組的反應(yīng)孔中加入對(duì)應(yīng)的10μl100μMDP(SEQIDNO.1)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。其中，稀釋液為含0.1％(質(zhì)量體積比)酪蛋白的PBS緩沖液(pH7.4)。酪蛋白的作用是封閉非特異性位點(diǎn)，以提高檢測(cè)的靈敏性和準(zhǔn)確度。3.2加樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在對(duì)應(yīng)的孔加入對(duì)應(yīng)DP溶液30μl，加樣時(shí)槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進(jìn)行電場(chǎng)操作。3.3室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺(tái)上室溫孵育15min。3.4E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行加樣操作。4鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(Poly-HRP)與生物素結(jié)合4.1Poly-HRP溶液配制從4℃冰箱取出稀釋液，取1個(gè)1.5mL離心管，加入999μl的稀釋液，加入1μl的酶液(含Poly-HRP，濃度為0.5mg/ml)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。4.2加酶液在對(duì)應(yīng)的各孔加入上述稀釋液和酶液混合后的混合液30μl，Poly-HRP通過其標(biāo)記的鏈霉親和素與檢測(cè)探針上的生物素識(shí)別并結(jié)合。4.3室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺(tái)上室溫孵育15min。4.4E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(3bottom，3top)，清洗液選擇洗液B。清洗完畢，立刻進(jìn)行TMB加樣操作。其中，洗液B為含0.1％(質(zhì)量百分比)Tween20的PBS緩沖液。5數(shù)據(jù)讀取5.1加底物在對(duì)應(yīng)的各孔加入底物60μl，加樣時(shí)槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極。加完立刻到EFIRM上進(jìn)行電場(chǎng)操作。其中，底物為含TMB的溶液。加入酶的底物，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流，檢測(cè)各孔內(nèi)電流值即完成整個(gè)檢測(cè)過程。5.2EFIRM電場(chǎng)讀數(shù)在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對(duì)應(yīng)列，電場(chǎng)參數(shù)設(shè)置為：電壓A：-200mV，60s；電壓B:0mV，0s；進(jìn)行1個(gè)循環(huán)。電場(chǎng)處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。儀器將自動(dòng)完成檢測(cè)工作，檢測(cè)數(shù)據(jù)自動(dòng)上傳到云計(jì)算平臺(tái)。根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制柱狀圖，橫坐標(biāo)為檢測(cè)組的類別，縱坐標(biāo)為各檢測(cè)組中各檢測(cè)孔的電流值(Current)，單位為納安(nA)。本實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果如圖3和表3所示。5.3結(jié)果分析質(zhì)控結(jié)果說明：對(duì)于野生型和突變型檢測(cè)組，陰性對(duì)照的值均需小于100nA，陽(yáng)性對(duì)照值均需大于100nA，否則結(jié)果不成立。閾值設(shè)定即為100nA。需要說明的是，采用其他實(shí)施例提供的探針的進(jìn)行檢測(cè)的方法與本實(shí)施例基本相同。表3.采用實(shí)施例3提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針檢測(cè)三份樣本的檢測(cè)結(jié)果組別陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照樣本1樣本2樣本3野生型檢測(cè)組24.47nA213.56nA206.77nA38.23nA196.99nA突變型檢測(cè)組20.13nA240.17nA33.88nA841.73nA191.09nA由表3和圖3(圖中：縱坐標(biāo)為電流值nA)可知，在野生型檢測(cè)組中，陰性對(duì)照值為24.47nA，小于100nA，陽(yáng)性對(duì)照值為213.56nA，大于100nA，符合質(zhì)控要求；在突變型檢測(cè)組中，陰性對(duì)照值為20.13nA，小于100nA，陽(yáng)性對(duì)照值為240.17nA，大于100nA，符合質(zhì)控要求。樣本1的野生型檢測(cè)結(jié)果為206.77nA，大于100nA，野生型檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；樣本1的突變型檢測(cè)結(jié)果為33.88nA，小于100nA，突變型檢測(cè)結(jié)果為陰性；說明樣本1為ALDH2野生型純合子，即基因型為ALDH2GG(ALDH2*1/ALDH2*1)。樣本2的野生型檢測(cè)結(jié)果為38.23nA，小于100nA，野生型檢測(cè)結(jié)果為陰性；樣本2的突變型檢測(cè)結(jié)果為841.73nA，大于100nA，突變型檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；說明樣本2為突變型純合子，即基因型為ALDH2LL(ALDH2*2/ALDH2*2)。樣本3的野生型檢測(cè)結(jié)果為196.99nA，大于100nA，野生型檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，樣本3的突變型檢測(cè)結(jié)果為191.09nA，大于100nA，突變型檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。兩種基因型信號(hào)均成陽(yáng)性，說明樣本3為突變型雜合子，即基因型為ALDH2GL(ALDH2*1/ALDH2*2)。此外，通過對(duì)上述三份樣本的檢測(cè)結(jié)果也表明實(shí)施例3提供的探針的野生型捕獲探針(SEQIDNO.2)和突變型捕獲探針(SEQIDNO.3)的特異性較好。因?yàn)槎叩膲A基序列只有一個(gè)堿基的差異，但各自都僅與其互補(bǔ)的目標(biāo)序列特異性結(jié)合，例如樣本1的突變型檢測(cè)結(jié)果為陰性(33.88nA)，說明突變型捕獲探針(SEQIDNO.3)不與SEQIDNO.4所示的目標(biāo)序列結(jié)合，表明突變型捕獲探針的特異性好，假陽(yáng)性率低；又例如樣本2的野生型檢測(cè)結(jié)果為陰性(38.23nA)，說明野生型捕獲探針(SEQIDNO.2)不與SEQIDNO.5所示的目標(biāo)序列結(jié)合，這也表明野生型捕獲探針的特異性好，假陽(yáng)性率低。另外，本實(shí)施例中，還利用引物5’-TGGAGCCCAGTCACCCTT-3’和5’-CGCCCAGCAGACCCTAAAT-3’，通過測(cè)序的方式檢測(cè)樣本1、樣本2和樣本3的ALDH2基因的rs671位點(diǎn)的突變情況，以驗(yàn)證上述檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，針對(duì)rs671位點(diǎn)區(qū)域的測(cè)序結(jié)果如圖4所示。圖4的結(jié)果顯示(圖中：a代表樣本1、b代表樣本2、c代表樣本3，箭頭處為待測(cè)突變位點(diǎn))，樣本1為野生型純合子，樣本2為突變型純合子，樣本3為突變型雜合子，該結(jié)果與上述的檢測(cè)結(jié)果一致，表明采用實(shí)施例3提供的ALDH2基因突變的探針檢測(cè)ALDH2基因rs671位點(diǎn)G→A突變的結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。綜上所述，本發(fā)明提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針基于人的ALDH2基因rs671位點(diǎn)G→A突變進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過在捕獲探針的5’端引入特殊序列的延長(zhǎng)臂修飾，提高了捕獲探針的捕獲能力，進(jìn)而提高其檢測(cè)的靈敏度，再然后根據(jù)rs671位點(diǎn)位點(diǎn)的附件序列選取一段互補(bǔ)結(jié)合區(qū)(靶區(qū)域)作為捕獲探針的結(jié)合區(qū)域，提高其檢測(cè)的特異性，降低其假陽(yáng)性率。此外，本發(fā)明提供的檢測(cè)ALDH2基因突變的探針不僅能夠檢測(cè)出ALDH2基因在rs671位點(diǎn)是否發(fā)生突變，還能夠檢測(cè)出突變基因型是雜合還是純合。且采用本發(fā)明提供的探針在EFIRM技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，具有操作簡(jiǎn)便快速、耗時(shí)短、成本低等特點(diǎn)。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>北京易活生物科技有限公司<120>一種檢測(cè)ALDH2基因突變的探針及其應(yīng)用和試劑盒<160>7<170>PatentInversion3.5<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>1cttatggagcccccagcaggtcccacactcaca33<210>2<211>90<212>DNA<213>人工序列<400>2atttttttttttttttttatttttttttttttttttatttttttttttttttttattttt60ttttttttttttatttttcacttcagtgta90<210>3<211>90<212>DNA<213>人工序列<400>3atttttttttttttttttatttttttttttttttttatttttttttttttttttattttt60ttttttttttttatttttcactttagtgta90<210>4<211>59<212>DNA<213>智人（Homosapiens）<400>4gctgcaggcatacactgaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggc59<210>5<211>59<212>DNA<213>智人（Homosapiens）<400>5gctgcaggcatacactaaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggc59<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6tcacttcagtgtagcatggccttag25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7tcactttagtgtagcatggccttag25當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3