本發(fā)明涉及一種神經(jīng)肽及其合成方法和應(yīng)用，屬于多肽及其合成技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

神經(jīng)系統(tǒng)疾病主要是指發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、植物神經(jīng)系統(tǒng)的以感覺、運(yùn)動、意識、植物神經(jīng)功能障礙為主要表現(xiàn)的疾病，又稱神經(jīng)病。發(fā)生于骨骼肌及神經(jīng)肌肉接頭處的疾病，其臨床表現(xiàn)與神經(jīng)系統(tǒng)本身受損所致的疾病往往不易區(qū)別，故肌肉疾病也往往與神經(jīng)病一并討論。中樞神經(jīng)系統(tǒng)受致病因素影響(尤其是未能查出神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性病變時)而以精神活動障礙為主要表現(xiàn)的疾病稱為精神病。俗話中常稱精神病為“神經(jīng)病”，實(shí)誤。但神經(jīng)病與精神病常可并存，如散發(fā)性腦炎往往以精神癥狀為首發(fā)癥狀，麻痹癡呆患者亦可早期即出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。有些神經(jīng)病，如腦血管疾病、癲癇、腦炎、腦膜炎等臨床上常見。神經(jīng)病中慢性病占多數(shù)，往往遷延不愈，給患者的工作、生活帶來很大影響，致殘率很高。神經(jīng)病可由多種病因引起，許多神經(jīng)病病因不明，也有許多是遺傳病。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中記載，基因-NLG1及其表達(dá)的突觸粘附分子Neuroligins，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，如記憶缺陷、老年癡呆癥和精神分裂癥等患者中，發(fā)現(xiàn)其Neuroligins蛋白功能退化或者喪失。

目前市面上所采用的神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療藥物基本都是某些受體的抑制劑，這些藥物雖然能一定程度地緩解或治療病情，但往往有以下缺點(diǎn)：1.靶向結(jié)合的受體在體內(nèi)具有正常的生理功能，藥物抑制會影響其正常功能的發(fā)揮；2.由于靶向受體往往并不只在某一特定區(qū)域表達(dá)，或存在多個靶向受體，抑制劑類藥物都會存在一定的副作用，嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致病人死亡；3.抑制劑類藥物都是外源的小分子，清除這些分子會對機(jī)體帶來一定負(fù)荷，甚至毒性傷害；4.治標(biāo)不治本，很多藥物往往只能暫時緩解病情，必須長期頻繁給藥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)肽及其合成方法和應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了一種神經(jīng)肽，所述神經(jīng)肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。具體序列為：酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸- 精氨酸-谷氨酰胺--精氨酸-精氨酸-精氨酸-組氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-精氨酸-纈氨酸(YGRKKRRQRRRHSTTRV)。

本發(fā)明還提供了所述神經(jīng)肽的合成方法，按照SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，以纈氨酸作為第一個氨基酸，將其-NH₂裸露，然后與第二個氨基酸-精氨酸的-COOH縮合，形成酰胺鍵，照此依次連接其余氨基酸，最后連接酪氨酸，即得所述神經(jīng)肽。

優(yōu)選，所述神經(jīng)肽的合成方法包括以下步驟：

a.將第一個氨基酸(V纈氨酸)的-COOH連接到樹脂，然后將樹脂上未反應(yīng)完的功能團(tuán)封閉；

b.洗滌；

c.去除第一個氨基酸中-NH₂的保護(hù)基團(tuán)，使-NH₂裸露；

d.洗滌；

e.將第二個氨基酸(R精氨酸)的-COOH活化，然后縮合至第一個氨基酸中的-NH₂上，形成酰胺鍵；

f.洗滌；

g.去除第二個氨基酸中-NH₂的保護(hù)基團(tuán)，使-NH₂裸露；

h.洗滌；

i.重復(fù)e-h直到最后一個氨基酸(Y酪氨酸)的-NH₂裸露；

j.加入切割試劑，將合成的多肽從樹脂上切割，并切除所有氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，得切割液；

k.將切割液加入乙醚中，使多肽沉淀，離心，純化，即得。

優(yōu)選，所述神經(jīng)肽的合成方法包括以下步驟：

a.將第一個氨基酸(V纈氨酸)的-COOH用N,N-二異丙基乙胺(DIEA)連接到Cl樹脂(Cl-Resin)，然后將樹脂上未反應(yīng)完的功能團(tuán)用甲醇封閉；

b.用DMF洗滌；

c.用哌啶(Piperidine)去除第一個氨基酸中-NH₂的保護(hù)基團(tuán)9-芴甲氧羰基(Fmoc)，使-NH₂裸露；

d.用DMF洗滌；

e.將第二個氨基酸(精氨酸)的-COOH用N,N-二異丙基碳二亞胺+1-羥基苯并三唑(DIC+HOBT)活化，然后縮合至第一個氨基酸中的-NH₂上，形成酰胺鍵；

f.用DMF洗滌；

g.用哌啶(Pip)去除第二個氨基酸中-NH₂的保護(hù)基團(tuán)9-芴甲氧羰基(Fmoc)，使-NH₂裸露；

h.用DMF洗滌；

i.重復(fù)e-h直到最后一個氨基酸(酪氨酸)的-NH₂裸露；

j.加入切割試劑，將多肽從樹脂上切割，并切除所有氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，得切割液；

k.將切割液加入乙醚中，使多肽沉淀，離心即得到多肽粗品，純化，即得。

更優(yōu)選，所述切割試劑為：三氟乙酸+乙二硫醇+苯酚+茴香硫醚+水。

最后，本發(fā)明提供了所述神經(jīng)肽在制備神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病為由于神經(jīng)細(xì)胞狀態(tài)改變而導(dǎo)致的各類神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

優(yōu)選，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病為社交障礙或記憶缺陷相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

優(yōu)選，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病為老年癡呆癥、孤獨(dú)癥或者精神分裂癥。

本發(fā)明以突觸粘附分子Neuroligins羧基端的6個氨基酸為核心序列，通過化學(xué)合成的方法，在該多肽的氨基端添加了一段人類免疫缺陷病毒(HIV)的氨基酸序列，重組后的多肽(TAT-PBD)能夠穿透細(xì)胞膜到細(xì)胞中發(fā)揮功能。本發(fā)明所得神經(jīng)肽能夠替代神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者體內(nèi)的Neuroligins蛋白，彌補(bǔ)其功能缺失的缺陷，從而能夠有效治療治療社交障礙或記憶缺陷相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如老年癡呆、癥孤獨(dú)癥或者精神分裂癥等。

技術(shù)效果：相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)：1.本產(chǎn)品能有效改善實(shí)驗(yàn)動物社交記憶的缺陷，并且未觀察到不良反應(yīng)；2.本產(chǎn)品功能區(qū)域?yàn)閮?nèi)源性蛋白上的一段序列，幾乎不會引起細(xì)胞的排斥反應(yīng)；3.本產(chǎn)品所激活的信號通路為一條已知的神經(jīng)系統(tǒng)特有的信號通路；4.本產(chǎn)品能有效改變神經(jīng)元的活性與狀態(tài)；5.本產(chǎn)品的本質(zhì)是一段氨基酸序列，便于降解，而不會造成身體器官的負(fù)荷。

附圖說明

圖1：本發(fā)明多肽TAT-PBD對神經(jīng)元的樹突棘數(shù)目的影響；

圖2：本發(fā)明多肽TAT-PBD對急性腦切片中LTP的影響；

圖3：本發(fā)明多肽TAT-PBD對小鼠社交記憶的影響。

圖4：本發(fā)明多肽TAT-PBD產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)解決方案。

實(shí)施例1本發(fā)明多肽(TAT-PBD)的合成

多肽具體序列為：酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺--精氨酸-精氨酸-精氨酸-組氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-精氨酸-纈氨酸(YGRKKRRQRRRHSTTRV)

1.主要原料：Cl樹脂、氨基酸、DIEA(N,N-二異丙基乙胺)、DIC(N,N-二異丙基碳二亞胺)、HOBT(1-羥基苯并三唑)、DMF(二甲基甲酰胺)、Piperidine(哌啶)、三氟乙酸、乙二硫醇、苯酚、茴香硫醚、甲醇和水。

2.合成思路：

樹脂：Cl-Resin

路線：固相Fmoc(9-芴甲氧羰基)

縮合：DIC+HOBT

去保護(hù)：Piperidine

儀器：全自動合成儀

3.具體步驟：

a.將第一個氨基酸(V纈氨酸)的-COOH用DIEA連接到Cl-Resin，然后將樹脂上未反應(yīng)完的功能團(tuán)用甲醇封閉；

b.用DMF洗滌；

c.用Piperidine去除第一個氨基酸中-NH₂的保護(hù)基團(tuán)Fmoc，使-NH₂裸露；

d.用DMF洗滌；

e.將第二個氨基酸(精氨酸)的-COOH用DIC+HOBT活化，然后縮合至第一個氨基酸中的-NH₂上，形成酰胺鍵；

f.用DMF洗滌；

g.用Pip去除第二個氨基酸中-NH2的保護(hù)基團(tuán)Fmoc，使-NH₂裸露；

h.用DMF洗滌；

i.…重復(fù)e-h直到最后一個氨基酸(酪氨酸)的-NH₂裸露；

j.將多肽從樹脂上切割，并切除所有氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，切割試劑為：三氟乙酸+ 乙二硫醇+苯酚+茴香硫醚+水；

k.將切割液加入乙醚中，使多肽沉淀，離心即得到多肽粗品。

以上步驟中的反應(yīng)條件均為現(xiàn)有技術(shù)中常用條件，能達(dá)到每個步驟的目的即可。

4、純化

1.試劑及儀器：乙腈，甲醇，TFA(三氟乙酸)，純水，RP-HPLC儀器，C18制備/分析柱。

2.純化方法：梯度洗脫。

5、產(chǎn)物檢測

將所得產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測，結(jié)果如附圖4質(zhì)譜圖所示，該多肽受電子束沖擊后的最強(qiáng)離子流的質(zhì)荷比為561.45，帶有4個質(zhì)子，所以該多肽的相對分子質(zhì)量應(yīng)該是561.45*4-4＝2241.8，與預(yù)測值2241.58非常接近，故可認(rèn)為多肽合成成功。

實(shí)施例2

向體外培養(yǎng)20天的小鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)基中添加本產(chǎn)品(TAT-PBD)和對照多肽至終濃度為50微克每毫升，一小時后用4％多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，并進(jìn)行免疫染色，如附圖1所示，可以觀察到TAT-PBD處理過的神經(jīng)元的樹突棘數(shù)目顯著升高。

實(shí)施例3

制備野生型小鼠的急性腦切片，并在海馬區(qū)的CA3-CA1環(huán)路進(jìn)行全細(xì)胞電生理記錄，在細(xì)胞內(nèi)液中加入TAT-PBD多肽(50毫克每毫升)。結(jié)果顯示(如附圖2所示)，與對照組相比，PBD能顯著增加LTP的幅度。

實(shí)施例4

按10毫克/千克的劑量向?qū)嶒?yàn)小鼠腹腔或尾靜脈注射本產(chǎn)品，一小時后通過行為學(xué)檢測，結(jié)果如附圖3所示，與對照組相比，處理組小鼠的社交記憶明顯提高，并且能在社交記憶缺陷的小鼠模型(Neuroligin1敲除鼠)中觀察到挽救(rescue)現(xiàn)象。

SEQUENCE LISTING

<110> 東南大學(xué)

<120> 一種神經(jīng)肽及其合成方法和應(yīng)用

<130> 2017.02.09

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg His Ser Thr Thr Arg

1 5 10 15

Val