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一種檢測鮭魚甲病毒的TaqMan熒光定量PCR試劑盒及其應用的制作方法

文檔序號:12413218閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種用于檢測鮭魚甲病毒的TaqMan熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2~3所示的引物以及核苷酸序列為SEQ ID NO:4所示的探針,所述探針序列的5’端標記有報告熒光基團,3’端標記有淬滅基團。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,所述報告熒光基團為FAM,所述淬滅基團為BHQ1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,所述試劑盒還包括TaqMan熒光定量PCR擴增緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,所述TaqMan熒光定量PCR擴增緩沖液為Premix Ex Taq Master Mix。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,所述的試劑盒中還包括總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、陽性對照和陰性對照,所述的陽性對照為含有鮭魚甲病毒E2基因的重組質(zhì)粒標準品,所述的陰性對照為去離子水。

6.如權(quán)利要求1-5任一項所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,用于檢測鮭魚甲病毒時,包括以下步驟:

(1)將待測樣本勻漿,離心,取上清進行總RNA提??;

(2)以步驟(1)得到的總RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA,總cDNA樣品保存至-80℃,備用;

(3)以步驟(2)得到的總cDNA、陽性對照品和陰性對照品分別為模板,在熒光定量PCR儀上進行PCR擴增;

(4)PCR反應結(jié)束后,根據(jù)擴增動力學曲線判斷結(jié)果。

7.如權(quán)利要求6所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,PCR擴增反應體系為:2×Premix Ex Taq Master Mix 12.5μl,濃度為10μM的上游引物及下游引物各0.5μl,探針1μl,模板2μl,去離子水8.5μl。

8.如權(quán)利要求6所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,實時熒光定量PCR的反應程序為:(1)95℃預變性30s;(2)95℃變性5s、60℃退火30s,共40個循環(huán)。

9.如權(quán)利要求6所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,在檢測中兩種對照為有效擴增時,樣本結(jié)果判斷標準如下:Ct值≤40.0時樣品結(jié)果為陽性;Ct值>40.0的樣品結(jié)果為陰性。

10.權(quán)利要求1-9任一項所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒在制備檢測鮭魚甲病毒的試劑中的應用,其中,優(yōu)選的,所述的鮭魚甲病毒包括以下六個基因型:SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV 5以及SAV 6。

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