本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人母乳干細胞的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干細胞是指那些具有自我復(fù)制和多向分化能力的細胞，它們可以不斷地自我更新，并在特定條件下分化成為一種或多種構(gòu)成人體組織或器官的細胞。利用干細胞移植受損組織，可使組織恢復(fù)再生能力，修復(fù)其功能，干細胞替代療法為治療各種疾病和組織損傷帶來了巨大的希望。干細胞存在于胚胎、成熟機體組織、血液中，近年來研究發(fā)現(xiàn)，人母乳中也含有干細胞成分，母乳干細胞表現(xiàn)出類似人胚胎干細胞的多向分化潛能，可表達多種多能性基因，如OCT4、SOX2、NANOG等，這些基因?qū)τ诰S持細胞未分化狀態(tài)和多能性有著非常重要的作用。人母乳干細胞具有很多天然優(yōu)勢：可通過無創(chuàng)方式獲取，哺乳期女性均可提供，來源豐富。因此，人母乳干細胞可作為細胞替代療法穩(wěn)定且豐富的來源。
目前關(guān)于人母乳干細胞制備方法的文獻資料較少，尚未有公知的獲得認可的標準化制備方法。根據(jù)目前的文獻報道，人母乳干細胞的培養(yǎng)多采用添加10%-20%胎牛血清的DMEM或RPMI培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上，有些研究學(xué)者添加了胰島素、表皮生長因子等物質(zhì)，有些研究學(xué)者添加了飼養(yǎng)層細胞。然而，胰島素、表皮生長因子等物質(zhì)對于維持人母乳干細胞的未分化狀態(tài)沒有起到非常好的效果，飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)較前者而言可以稍好地維持人母乳干細胞的未分化狀態(tài)，但是實驗步驟較為繁瑣且需要花費較多的時間。因此，急需尋找一種操作簡便且能較好地維持人母乳干細胞未分化狀態(tài)的制備方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種人母乳干細胞的制備方法及其應(yīng)用，操作簡便，無需采用飼養(yǎng)層細胞共培養(yǎng)。
對此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
一種人母乳干細胞的制備方法，其包括以下步驟：
步驟S1：采集母乳；
步驟S2：分離人母乳細胞，得到純化后的母乳細胞懸液；
步驟S3：將純化后的母乳細胞懸液轉(zhuǎn)移到包被體積百分比為0.01-0.05% 的明膠的培養(yǎng)板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次，第6天分離單個細胞克隆并接種到新的培養(yǎng)板中，促進克隆形成；優(yōu)選的，所述培養(yǎng)板為市售的超低粘附培養(yǎng)板；
步驟S4：當細胞融合至80%（細胞融合數(shù)量的百分數(shù)）以上時，添加胰蛋白酶，胰蛋白酶覆蓋細胞表面即可，37℃消化5min，用2倍體積含10%（體積百分比）胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心10min，收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌1次，1000rpm離心10min，用新鮮的細胞培養(yǎng)液重懸細胞，按1:3傳代。
作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S4中，所述細胞培養(yǎng)液的成分為：含10%（體積百分比，下同）KOSR（knockout serum replacement，血清替代物）、10 -20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、10-20 ng/mL 表皮細胞生長因子、100-300 U/mL白血病抑制因子、含有0.1-0.5μmol/mL視黃醇的DMEM/F12培養(yǎng)基。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述細胞培養(yǎng)液的成分為：含10%KOSR、12-15ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、12-18 ng/mL 表皮細胞生長因子、150-250 U/mL白血病抑制因子、含有0.2-0.4μmol/mL視黃醇的DMEM/F12培養(yǎng)基。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述細胞培養(yǎng)液的成分為：含10%KOSR、10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、20 ng/mL 表皮細胞生長因子、100 U/mL白血病抑制因子、含有0.5μmol/mL視黃醇的DMEM/F12培養(yǎng)基。
作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S1中，在采集母乳之前，檢測供者ABO/Rh血型、HLA分型及梅毒、HIV、HBV、HCV，然后在無菌條件下采集供者的母乳5-200mL。
作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S2中，所述分離人母乳細胞包括：將母乳和等體積的PBS緩沖液混合，4℃下1500-2000rpm下進行離心分離，吸除脂肪層和脫脂母乳成分。
作為本發(fā)明的進一步改進，余下的細胞沉淀用PBS緩沖液洗滌3次，每次1000-2000rpm離心5-15min，用新鮮培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，得到純化后的母乳細胞懸液。其中，所述新鮮培養(yǎng)液為新鮮配置的培養(yǎng)液，可以為本領(lǐng)域常用的培養(yǎng)液。所述新鮮培養(yǎng)液可以為含10% （體積百分比）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述將母乳和等體積的PBS緩沖液混合，4℃下于2000rpm下進行離心分離20min，吸除脂肪層和脫脂母乳成分。
作為本發(fā)明的進一步改進，余下的細胞沉淀用PBS緩沖液洗滌3次，每次1500rpm離心10min，用新鮮培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，得到純化后的母乳細胞懸液。其中，所述新鮮培養(yǎng)液為新鮮配置的培養(yǎng)液，可以為本領(lǐng)域常用的培養(yǎng)液。所述新鮮培養(yǎng)液可以為含10% （體積百分比）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
作為本發(fā)明的進一步改進，將純化后的母乳細胞懸液轉(zhuǎn)移到包被0.01-0.05% 明膠培養(yǎng)板前，所述明膠培養(yǎng)板提前包被1h，并用細胞培養(yǎng)前用PBS洗滌至少2次。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述明膠培養(yǎng)板的包被明膠的體積百分比為 0.01%。
本發(fā)明還公開了一種人母乳干細胞的應(yīng)用，所述人母乳干細胞采用如上任意一項所述的人母乳干細胞的制備方法制備得到，其應(yīng)用于細胞替代治療，促進人體組織修復(fù)中。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
采用本發(fā)明的技術(shù)方案，操作簡便，無需采用飼養(yǎng)層細胞共培養(yǎng)，而且可以更好的維持人母乳干細胞未分化狀態(tài)，且獲得的人母乳干細胞數(shù)量更多。
附圖說明
圖1是本發(fā)明實施例1培養(yǎng)第20天的人母乳干細胞經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定的結(jié)果。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的較優(yōu)的實施例作進一步的詳細說明。應(yīng)當理解，以下所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例1
一種人母乳干細胞的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟：
1. 采集母乳
人母乳的采集：采集母乳之前，檢測供者ABO/Rh血型、HLA分型及梅毒、HIV、HBV、HCV，然后在無菌條件下采集供者的母乳5-200mL，立即送往實驗室進行人母乳干細胞的制備。
2.分離人母乳細胞
將母乳和等體積的PBS緩沖液混合，4℃下2000rpm離心20min，吸除脂肪層和脫脂母乳成分，余下的細胞沉淀用PBS緩沖液洗滌3次，每次1500rpm離心10min，用新鮮的培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，收獲純化后的母乳細胞懸液。
3.培養(yǎng)人母乳干細胞
將純化后的母乳細胞懸液轉(zhuǎn)移到包被0.01%明膠的培養(yǎng)板中，所述包被0.01%明膠的培養(yǎng)板提前包被1h，細胞培養(yǎng)前用PBS洗滌2次；然后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次，第6天分離單個細胞克隆并接種到新的超低粘附培養(yǎng)板中，促進克隆形成。當細胞融合至80%以上時，添加適量0.25%胰蛋白酶，胰蛋白酶覆蓋細胞表面即可，37℃消化5min，用2倍體積含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心10min，收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌1次，1000rpm離心10min，用新鮮細胞培養(yǎng)液重懸細胞，按1:3傳代。
所述細胞培養(yǎng)液為含10%KOSR、10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、20ng/mL 表皮細胞生長因子（EGF）、100U/mL白血病抑制因子(LIF)、0.5μmol/mL視黃醇的DMEM/F12培養(yǎng)基。
經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定培養(yǎng)第20天的人母乳干細胞，如圖1所示，結(jié)果顯示SOX2、NANOG、OCT4呈高表達，陽性比例分別為72%、70%、53%。說明采用本專利方法培養(yǎng)的人母乳干細胞純度高。
實施例2
在實施例1的基礎(chǔ)上，所述培養(yǎng)人母乳干細胞的步驟有所不同，具體如下：
將純化后的母乳細胞懸液轉(zhuǎn)移到包被0.01%明膠的培養(yǎng)板中，所述包被0.01%明膠的培養(yǎng)板提前包被1h，細胞培養(yǎng)前用PBS洗滌2次，然后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次，第6天分離單個細胞克隆并接種到新的超低粘附培養(yǎng)板中，促進克隆形成。當細胞融合至80%以上時，添加適量0.25%胰蛋白酶，胰蛋白酶覆蓋細胞表面即可，37℃消化5min，用2倍體積含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心10min，收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌1次，1000rpm離心10min，用新鮮細胞培養(yǎng)液重懸細胞，按1:3傳代。
所述細胞培養(yǎng)液為含10%KOSR、20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、10ng/mL 表皮細胞生長因子（EGF）、300 U/mL白血病抑制因子(LIF)、0.1μmol/mL視黃醇的DMEM/F12培養(yǎng)基。
經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定培養(yǎng)第20天的人母乳干細胞，結(jié)果顯示SOX2、NANOG、OCT4呈高表達，陽性比例分別為65%、66%、42%。說明采用本專利方法培養(yǎng)的人母乳干細胞純度高。
對比例1
本例與實施例的不同在于，所述培養(yǎng)人母乳干細胞的步驟有所不同，其采用常規(guī)方法，具體如下：
將純化后的母乳細胞懸液以5×104/cm2的細胞密度轉(zhuǎn)移到鋪有鼠胚胎成纖維細胞(MEFs，接種密度5×104/cm2)的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天半量換液1次，1周后每天換液1次，當細胞融合至80%以上時，添加適量0.25%胰蛋白酶，胰蛋白酶覆蓋細胞表面即可，37℃消化5min，用2倍體積含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心10min，收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌1次，1000rpm離心10min，用新鮮細胞培養(yǎng)液重懸細胞，按1:3傳代。
所述細胞培養(yǎng)液為含10%自體血漿或胎牛血清、20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、10ng/mL 表皮細胞生長因子（EGF）、5μg/mL胰島素RPMI1640培養(yǎng)基。
經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定培養(yǎng)第20天的人母乳干細胞，結(jié)果顯示SOX2、NANOG、OCT4陽性比例分別為55%、62%、40%。與實施例1和實施例2對比可見，采用實施例1和實施例2的方法得到的人母乳干細胞人母乳干細胞的純度更高，可以更好的維持人母乳干細胞未分化狀態(tài)。
實施例3
對實施例1和對比實施例進行人母乳干細胞增殖活性測試，具體過程如下：
將實施例1和對比例1的人母乳干細胞在培養(yǎng)第20天時，在倒置顯微鏡下取6個視野(200×)，計數(shù)未分化細胞數(shù)量，實施例1的方法制備的人母乳干細胞數(shù)量為9.17±0.75，采用對比例1的方法制備的人母乳干細胞數(shù)量為4.17±0.75，所以，實施例1制備的人母乳干細胞數(shù)量明顯高于常規(guī)方法制備的母乳干細胞。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。