本發(fā)明涉及用于病毒檢測的引物和試劑盒，特別是涉及用于檢測鮭魚甲病毒的特異性的熒光定量PCR引物，本發(fā)明還涉及利用該引物和Eva Green熒光染料進行鮭魚甲病毒檢測的方法和試劑盒。本發(fā)明屬于病毒檢測技術領域。

背景技術：

鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus，SAV)隸屬于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒屬(Alphavirus)，主要感染大西洋鮭(salmo salar)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和褐鱒(Salmo trutta L.)等鮭科魚類引起胰臟病、心肌炎癥和昏睡等癥狀，致死率達1％～48％，并在水產(chǎn)養(yǎng)殖的各個階段均有爆發(fā)。1995年Nelson等在愛爾蘭首次從患胰臟病的大西洋鮭和虹鱒體內(nèi)分離出該病毒，1997年Castric等又在法國從患昏睡病的大西洋鮭和虹鱒體內(nèi)分離到SAV，目前該病廣泛流行于英格蘭、蘇格蘭、挪威、法國、波蘭、意大利和西班牙等歐洲國家，據(jù)統(tǒng)計從1995年至2007年發(fā)病率逐年增加高達90％，每年由此疫病造成巨大的經(jīng)濟損失。2013年鮭魚甲病毒感染被列入OIE水生動物疫病名錄中。雖然，我國目前尚未有文獻報道檢測到該病毒，但是，隨著近年我國對鮭科魚類進口和鮭科魚類卵引進的增加，該病傳入我國的風險也日益增大。因此，我國建立SAV快速診斷和測檢方法是緊迫的任務。

目前已發(fā)現(xiàn)六個基因型(SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV5、SAV 6)。其中，SAV 1、SAV 3、SAV 4、SAV 5、SAV 6可感染大西洋鮭引起胰腺病(Salmon pancreas disease，PD)；SAV 2可感染虹鱒引起睡病(Sleeping disease，SD)。SAV病毒粒子具有囊膜，大小為65nm。單股正鏈RNA病毒，基因組長11-12kb，且含有兩個開放閱讀框(ORF)?；蚪M的第二個ORF編碼26S子基因的mRNA，最終產(chǎn)生5個結構蛋白，即衣殼蛋白、E3、E2、6K、和E1共同構成了病毒的囊膜糖蛋白。E2在未成熟時，與E3相連，組成E2的前體，E3的作用相當于E2的信號肽。當E2成熟時，E2與E3分離，E2被轉運到病毒粒子表面。

近年來，我國一些地方，特別是北方地區(qū)，大規(guī)模發(fā)展了冷水魚類(如：虹鱒)養(yǎng)殖，且取得了巨大的經(jīng)濟效益。雖然我國目前尚未發(fā)現(xiàn)該病毒，但是隨著近年我國對鮭科魚類進口的增加，該病傳入我國的風險也日益增大，因此有必要盡早建立對鮭魚甲病毒快速靈敏的檢測方法，防止該病傳入我國，SAV的有效預報或者診斷是我們必須解決的問題。

核酸檢測技術因具有快速、靈敏、特異性強等特點，已成為鮭魚甲病毒的主要檢測技術，廣泛用于臨床樣品的檢測和分子流行病學調(diào)查。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠簡便、快速、靈敏、特異和高效地檢測鮭魚甲病毒的Eva Green熒光定量PCR試劑盒。

本發(fā)明的另一個目的在于提供檢測鮭魚甲病毒的熒光定量PCR方法。該方法檢測覆蓋鮭魚甲病毒六個基因型，是一種特異性強，準確性高、靈敏性高的檢測方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用了以下技術手段：

本發(fā)明對已知鮭魚甲病毒基因序列進行比對，篩選出鮭魚甲病毒六個基因型的保守區(qū)序列，即E2蛋白基因中的一段保守序列(9471-9668bp)。針對該序列本發(fā)明發(fā)明人經(jīng)反復篩選和驗證，得到一對用于檢測鮭魚甲病毒六個不同基因型的熒光定量PCR引物，擴增片段大小為197bp(SEQ ID NO.1所示)，所述引物的序列如下：

上游引物(TS1)：5’-GCAACATTGCCGATCTGAGGTGTGG-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物(TS2)：5’-CGTAACATGCAACGACAGCCAGTGC-3’(SEQ ID NO.3)

進一步的，本發(fā)明還提出了一種用于檢測鮭魚甲病毒的Eva Green熒光定量PCR試劑盒，含有用于檢測鮭魚甲病毒的熒光定量PCR引物對以及Eva Green熒光定量PCR擴增緩沖液，其中所述的引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

在本發(fā)明所述的試劑盒中，優(yōu)選的，所述Eva Green熒光定量PCR擴增緩沖液包括dNTPs、Mg²⁺、Eva Green、DNA聚合酶和RNA酶抑制劑。

在本發(fā)明所述的試劑盒中，優(yōu)選的，所述Eva Green熒光定量PCR擴增緩沖液為Golden HS EVA Green qPCR Mix。

在本發(fā)明所述的試劑盒中，優(yōu)選的，還包括陽性對照和陰性對照，所述的陽性對照為含有鮭魚甲病毒E2基因的重組質(zhì)粒標準品，所述的陰性對照為去離子水。

更進一步的，本發(fā)明還提出了使用本發(fā)明所述的Eva Green熒光定量PCR試劑盒檢測鮭魚甲病毒時，包括以下步驟：

(1)將待測樣本勻漿，離心，取上清進行總RNA提?。?/p>

(2)以步驟(1)得到的總RNA為模板，反轉錄合成總cDNA，總cDNA樣品保存至-80℃，備用；

(3)以步驟(2)得到的總cDNA、陽性對照品和陰性對照品分別為模板，在熒光定量PCR儀上進行PCR擴增；

(4)PCR反應結束后，記錄樣品的Ct值和起始DNA拷貝數(shù)。

其中，優(yōu)選的，PCR擴增反應體系為：5×Golden HS EVA Green qPCR Mix 4μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，濃度為0.3μM的上游引物及下游引物各0.5μl，模板1μl，最后用滅菌的去離子水補至20μl。

其中，優(yōu)選的，實時熒光定量PCR的反應程序為：(1)95℃預變性15min；(2)95℃變性10s、60℃退火30s，共40個循環(huán)。

其中，優(yōu)選的，在檢測中兩種對照為有效擴增時，樣本結果判斷標準如下：Ct值≤40.0時樣品結果為陽性；Ct值＞40.0的樣品結果為陰性。

再進一步的，本發(fā)明還提出了所述的Eva Green熒光定量PCR試劑盒在制備檢測鮭魚甲病毒的試劑中的應用。

其中，所述的鮭魚甲病毒包括以下六個基因型：SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV5以及SAV 6。

相較于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明參考多種鮭魚甲病毒六個基因型毒株，基于E2基因，設計合成可以用于Eva Green熒光定量PCR檢測的特異性引物；

2、本發(fā)明成功建立了Eva Green熒光定量PCR檢測方法，優(yōu)選采用Golden HS EVA Green為熒光試劑，成本低，定量PCR反應液配制簡單，可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標準曲線，對靶基因進行準確定量、定性檢測，重復性好，可信度高，可適用于各熒光定量PCR擴增儀；

3、本發(fā)明定量檢測方法具有較好的特異性、敏感性和重復性，可用于所有鮭魚甲病毒六個基因型毒株的快速檢測。

附圖說明

圖1為鮭魚甲病毒Eva Green熒光定量PCR擴增動力學曲線；

圖2為鮭魚甲病毒Eva Green熒光定量PCR標準曲線；

圖3為鮭魚甲病毒Eva Green熒光定量PCR擴增產(chǎn)物溶解曲線；

圖4為普通PCR方法檢測本發(fā)明建立引物的靈敏性核酸電泳圖；

圖5為普通PCR方法檢測OIE批準的用于檢測鮭魚甲病毒引物的靈敏性核酸電泳圖；

圖6為鮭魚甲病毒Eva Green熒光定量PCR的特異性試驗擴增動力學曲線。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1鮭魚甲病毒六個基因型特異性引物的設計

根據(jù)Genebank中發(fā)表的鮭魚甲病毒(SAV)E2基因序列(JX163854)，比較SAV的6個基因型不同毒株的E2基因序列，篩選出一段保守序列(9471-9668bp)。設計引物時，注意避開序列的突變點，經(jīng)反復篩選和驗證，得到一對用于檢測鮭魚甲病毒六個不同基因型的Eva Green熒光定量PCR引物：

上游引物(TS1)：5’-GCAACATTGCCGATCTGAGGTGTGG-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物(TS2)：5’-CGTAACATGCAACGACAGCCAGTGC-3’(SEQ ID NO.3)

擴增鮭魚甲病毒六個基因型的E2基因，片段大小為197bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

實施例2檢測鮭魚甲病毒的Eva Green熒光定量PCR檢測方法的建立

1、鮭魚甲病毒E2基因重組質(zhì)粒標準品的制備：

按照總RNA提取說明書提取鮭魚甲病毒SAV 4640的總RNA，參照TOYOBO反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，將反轉錄所得cDNA用擴增鮭魚甲病毒E2全長基因的引物進行常規(guī)PCR擴增，所述引物序列為：

上游引物序列：PF:5’-AGCTTCTTGCCGTCACCACCT-3’(SEQ ID NO.4)；

下游引物序列：PR:5’-GCGGCCGCTTGGTCCACAAGTAG-3’(SEQ ID NO.5)

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增E2全長為1375bp，用膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物，將回收片段與pET32a載體連接，轉化感受態(tài)細胞，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將測序正確的陽性質(zhì)粒命名為pET 32a-SAV E2，并作為DNA標準品，用分光光度儀測定濃度后進行10倍系列稀釋，用于構建標準曲線。并根據(jù)標準質(zhì)粒的濃度進行分析，根據(jù)公式計算出每微升質(zhì)粒液體中含有的質(zhì)?？截悢?shù)。

經(jīng)計算得pET32a-SAV E2濃度為119ng/μl，根據(jù)得到的結果，將重組質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋，得到的濃度為1.5×10¹⁰、1.5×10⁹、1.5×10⁸、1.5×10⁷、1.5×10⁶、1.5×10⁵、1.5×10⁴、1.5×10³，1.5×10²、1.5×10¹copies/μl的重組質(zhì)粒，將其作為標準品模板。樣品都設立1個陽性對照樣品和陰性對照樣品。陽性對照樣品為上述重組質(zhì)粒；陰性對照樣品為去離子水。

2、Eva Green熒光定量PCR檢測

分別取濃度為1.5×10¹⁰、1.5×10⁹、1.5×10⁸、1.5×10⁷、1.5×10⁶copies/μl的重組質(zhì)粒pET32a-SAV E2為模板進行Eva Green熒光定量PCR的擴增，得到擴增動力學曲線和標準曲線，如圖1及圖2所示，標準曲線的相關系數(shù)為0.99，斜率為-3.1，由此可看出線性關系良好。

其中PCR擴增反應體系為：5×Golden HS EVA Green qPCR Mix 4μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，濃度為0.3μM引物TS1、TS2各0.5μl，模板1μl，最后用滅菌的去離子水補至20μl。

PCR擴增反應程序為：

(1)95℃預變性15min；

(2)95℃變性10s、60℃退火30s，此步為一個循環(huán)，共40個循環(huán)。

當反應結束后，確認熒光定量PCR的溶解曲線，如圖3所示，僅有單一套峰，引物特異性強，擴增效率最高，標準品的溶解溫度都在87.2℃。

4、反應結束后，根據(jù)熒光定量PCR儀顯示圖片判斷檢測結果：

陰性樣品沒有擴增曲線出現(xiàn)，陽性樣品有明顯擴增曲線，且Ct值小于25。此時陰性對照和陽性對照都成立，可以對待測樣品起對照作用；若待測樣品擴增曲線Ct值小于或等于40，則說明樣品為SAV核酸陽性；若待測樣品無擴增曲線，或擴增曲線Ct值大于40，則樣品為SAV核酸陰性。

實施例3鮭魚甲病毒Eva Green熒光定量PCR檢測方法的特性評價

1、靈敏度評價，即real-time PCR的最低檢測限。

陽性參考DNA原液濃度為1.5×10¹⁰copies/μl。先將其10倍梯度稀釋至1.5×10¹copies/μl，再分別以每個稀釋度的溶液為模板，采用本發(fā)明實施例2建立的熒光定量PCR方法進行擴增，確定該方法最低可以檢測到的模板量。根據(jù)檢測結果，該熒光定量PCR方法最低可檢測量為1.5×10¹copies/μl，說明本發(fā)明檢測方法靈敏度高。

為了比較本發(fā)明建立的Eva Green熒光定量PCR引物與OIE認可的用于檢測鮭魚甲病毒普通RT-PCR引物(E2F/E2R)的靈敏性，用普通PCR檢測同一模板來評價引物的最低檢測限。OIE批準用于檢測SAV的普通PCR引物序列為：

E2F:5’-CCGTTGCGGCCACACTGGATG-3’(SEQ ID NO.6)

E2R:5’-CCTCATAGGTGATCGACGGCAG-3’(SEQ ID NO.7)

該引物特異性擴增鮭魚甲病毒E2基因，擴增目的片段大小為516bp。因此選用本發(fā)明建立的標準品質(zhì)粒pET32a-SAV E2用滅菌的去離子水進行10倍梯度稀釋，稀釋質(zhì)粒濃度為1.5×10¹⁰copies/μl至1.5×10¹copies/μl，再以每個稀釋度的溶液為模板，分別用本研究建立的Eva Green熒光定量PCR引物和OIE認可的鑒定鮭魚甲病毒引物(E2F/E2R)進行普通PCR，用去離子水作為陰性對照，檢測同一模板來評價引物的最低檢測限。

檢測鮭魚甲病毒的普通PCR反應體系見表1：

表1檢測鮭魚甲病毒普通PCR反應體系

本發(fā)明建立的熒光定量引物的PCR條件為：

95℃5min；94℃30s，58.8℃30s，72℃30s，共進行30個循環(huán)；72℃10m in。

引物E2F/E2R的PCR條件為：

95℃5min；94℃30s，57.5℃30s，72℃30s，共進行30個循環(huán)；72℃10m in。

將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5％核酸膠電泳，如圖4和圖5所示。圖4顯示本發(fā)明建立的Eva Green熒光定量所設計的引物最低質(zhì)粒檢出濃度為1.5×10⁶copies/μl，擴增片段大小為197bp；E2F/E2R引物最低質(zhì)粒檢測濃度為1.5×10⁷copies/μl，擴增片段大小為516bp(圖5)。由此可見本發(fā)明建立的Eva Green熒光定量PCR的引物敏感性是OIE認定的鑒定鮭魚甲病毒所用的普通PCR引物的10倍；本發(fā)明建立的熒光定量PCR方法最低可檢測量為1.5×10¹copies/μl，其靈敏性遠遠高于普通PCR方法檢測鮭魚甲病毒，說明該發(fā)明檢測方法靈敏度高。

2、特異度評價

利用本發(fā)明建立的EVA Green熒光定量PCR檢測方法，在體系中分別加入了傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)、傳染性胰腺壞死病毒(IPNV)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、禽傳染性法氏囊病毒(IBDV)、牛輪狀病毒(BRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)核酸作為陽性對照，同時以滅菌去離子水作為陰性對照，驗證此方法的特異性。試驗結果如圖6顯示，陽性對照及陰性對照均無S型曲線，只有以重組質(zhì)粒pET32a-SAV E2為模板的PCR擴增，有S型曲線，說明具有很好的特異性。

3、重復性評價

采用構建好的陽性質(zhì)粒pET32a-SAV E2模板，選取3個稀釋度，分別作為模板在同等條件下進行擴增，每個稀釋度做3個平行試驗，計算Cq值的變異系數(shù)；同時，將上述所用樣品保存，每周檢查1次，連續(xù)檢測2周，計算不同批次間Cq值的變異系數(shù)。結果顯示批內(nèi)變異系數(shù)在1％左右，批間變異系數(shù)均在1％以內(nèi)，說明該方法具有較好的重復性(見下表2)；

表2本發(fā)明重復性試驗結果

實施例4檢測鮭魚甲病毒的臨床應用及靈敏性評價

由于我國目前尚未發(fā)現(xiàn)鮭魚甲病毒的感染，因此采用人工感染SAV的魚苗作為待檢病料，來評價本發(fā)明建立的檢測SAV的Eva Green熒光定量PCR方法。利用SAV1(V4640)和SAV2(V4583)細胞培養(yǎng)病毒感染健康的虹鱒幼魚制備病料進行檢測。

按照總RNA提取說明書提取各組魚苗組織病料的總RNA，參照TOYOBO反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，獲得cDNA并保存至-80℃?zhèn)溆?。為了與已發(fā)表的同樣檢測SAV針對E1基因設計的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法的靈敏性進行對比，將獲得的cDNA用滅菌的去離子水進行10倍比稀釋，分別用這兩種方法檢測同一模板來評價引物的最低檢測限，每組樣品做三個平行。

1、采用已發(fā)表的引物分別進行SYBR GreenⅠ和EVA Green熒光定量PCR反應的體系及程序

已發(fā)表的針對E1基因設計的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR引物序列為：

227-F：5’-GACTGGCCTCCTTACGGGG-3’(SEQ ID NO.8)

227-R：5’-TTACAACCGTGCGGTGCTGT-3’(SEQ ID NO.9)

SYBR GreenⅠ熒光定量PCR擴增反應體系為20μl，反應體系如下：

THUNDERBIRD qPCR Mix10μl，上、下游引物(0.3μM)各1μl，cDNA模板3μl，ddH₂O 5μl。

PCR擴增反應程序為：

(1)95℃預變性30s；

(2)95℃變性3s、60℃退火30s，共40個循環(huán)；

EVA Green熒光定量PCR擴增反應體系為20μl，反應體系如下：

5×Golden HS EVA Green qPCR Mix 4μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，濃度為0.3μM引物TS1,TS2各0.5μl，模板1μl，最后用滅菌的去離子水補至20μl。

PCR擴增反應程序為：

(1)95℃預變性15min；

(2)95℃變性10s、60℃退火30s，此步為一個循環(huán)，共40個循環(huán)；

2、采用本發(fā)明的引物進行檢測的體系及反應程序

引物序列分別如SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。

PCR擴增反應體系為20μl，反應體系如下：

5×Golden HS EVA Green qPCR Mix 4μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，濃度為0.3μM引物TS1，TS2各0.5μl，模板1μl，最后用滅菌的去離子水補至20μl。

PCR擴增反應程序為：

(1)95℃預變性15min；

(2)95℃變性10s、60℃退火30s，此步為一個循環(huán)，共40個循環(huán)；

試驗結果如表3顯示，本發(fā)明對感染SAV1(V4640)組織病料的cDNA可檢測的最低稀釋度為10^-6，其靈敏度是已發(fā)表引物進行Eva green熒光定量檢測方法的1000倍，是已發(fā)表引物進行SYBR GreenⅠ熒光定量檢測方法的100倍；對感染SAV2(V4583)組織病料的cDNA可檢測的最低稀釋度為10^-5，其靈敏度是已發(fā)表的引物用兩種熒光定量檢測方法的10倍。由此可見，本發(fā)明建立的針對SAV的Eva Green熒光定量PCR檢測方法對于鮭魚甲病毒臨床樣品的檢測具有較高的靈敏性。

表3兩種方法對感染SAV的臨床樣品檢測的靈敏性比對

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110> 東北農(nóng)業(yè)大學

<120> 一種檢測鮭魚甲病毒的Eva Green熒光定量PCR試劑盒及其應用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 197

<212> DNA

<213> SAV

<400> 1

gcaacattgc cgatctgagg tgtggcttgc cctgggtgat actggcagcc gttaggactg 60

gctcctcaca cgtaaacgtc tgggagtcgc tggtgaaagt gacggttgcc aagtcagcgc 120

tcttgcattt cttgtcgaat ttcactgtgg taccaggtgg caccctcact gtgcactggc 180

tgtcgttgca tgttacg 197

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaacattgc cgatctgagg tgtgg 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgtaacatgc aacgacagcc agtgc 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcttcttgc cgtcaccacc t 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcggccgctt ggtccacaag tag 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgttgcggc cacactggat g 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctcataggt gatcgacggc ag 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gactggcctc cttacgggg 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttacaaccgt gcggtgctgt 20