本發(fā)明涉及組織工程關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)治療領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種接種自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原膜的制備方法。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨缺損在臨床較為常見，目前治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的主要方法均有明顯缺陷,軟骨損傷目前的治療方法包括軟骨成形術(shù)、骨髓刺激技術(shù)（即微裂縫），自體骨軟骨移植、自體軟骨細(xì)胞移植療法等。
骨髓刺激技術(shù)臨床上一般用于年輕患者較小的病變，其也顯示出巨大的成功,自體骨軟骨移植通常是用于給患者較小的病變,骨軟骨移植也被用于較大的軟骨損傷的治療，但這種技術(shù)的使用受移植物來(lái)源的限制，造成供體部位的額外損傷，修復(fù)后過(guò)度生長(zhǎng)，骨膜增生，同時(shí)有疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。
第一代的細(xì)胞療法即自體軟骨細(xì)胞移植（autologouschondrocyteimplantation,aci），將自體軟骨細(xì)胞懸液注入缺損中以修復(fù)損傷。大量的研究表明，aci技術(shù)可顯著改善運(yùn)動(dòng)功能，減輕癥狀，產(chǎn)生透明樣軟骨。但是這種技術(shù)需取健康的骨膜縫合固定，對(duì)健康組織產(chǎn)生影響，且技術(shù)復(fù)雜，手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)，存在修復(fù)后過(guò)度生長(zhǎng)，骨膜增生，骨膜脫落，細(xì)胞流失等風(fēng)險(xiǎn)，限制了這種技術(shù)的應(yīng)用。第二代細(xì)胞療法采用一種可吸收的膠原膜覆蓋軟骨缺損，替代自體健康骨膜組織，這種技術(shù)與第一代的細(xì)胞療法具有類似的療效，減少了對(duì)健康組織的損害。但其仍需兩次手術(shù)，仍需縫合，技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，細(xì)胞分布不均衡，存在細(xì)胞流失的風(fēng)險(xiǎn)。
第三代細(xì)胞療法將培養(yǎng)的自體軟骨細(xì)胞種植在可吸收的膠原膜上，通過(guò)纖維蛋白膠固定于損傷處,無(wú)需縫合，手術(shù)時(shí)間顯著縮短，療效顯著，不受損傷面積的限制，臨床效果持久，克服了第一、第二代aci技術(shù)的缺點(diǎn)。但是仍需二次手術(shù)，治療費(fèi)用高昂。
另一方面，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞技術(shù)日益成熟，其在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用也越來(lái)越被關(guān)注,由于干細(xì)胞具有組織全能性，能分化成各種組織細(xì)胞，尤其是可分化成軟骨細(xì)胞，這使其在臨床上應(yīng)用于修復(fù)軟骨損傷成為可能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的治療效果差、成本高的缺陷，提供一種接種自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原膜的制備方法來(lái)解決上述問(wèn)題。
本發(fā)明公開了一種接種自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原膜的制備方法，具體步驟為：
（1）、在無(wú)菌條件下，用內(nèi)含1ml肝素鈉生理鹽水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去針頭后，加入含10mldmem高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，混勻后得到骨髓懸液，備用；
（2）、在無(wú)菌條件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封帶入實(shí)驗(yàn)室中，然后將外周血置于50ml離心管中，在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，再對(duì)上清離心30min，去沉淀，0.22μm孔徑過(guò)濾除菌，得到自體血清，分裝待用；
（3）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細(xì)胞分離液的離心管中，進(jìn)行梯度離心，即在2000rpm的條件下，離心20min；
（4）、吸取中間白膜層，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，得到的沉淀即為目的細(xì)胞；
（5）、向dmem高糖培養(yǎng)基中加入fgf-2、自體血清、慶大霉素，直至dmem高糖培養(yǎng)基中的fgf-2的質(zhì)量濃度為10ng/ml、自體血清的體積濃度為10%、慶大霉素的質(zhì)量濃度為45ug/ml為止，然后將目的細(xì)胞加入15ml含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml的dmem高糖培養(yǎng)基中，吹打計(jì)數(shù)，以5×105/cm2接種于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每三天更換一次dmem高糖培養(yǎng)基，該dmem高糖培養(yǎng)基同樣含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml；
（6）、細(xì)胞貼壁達(dá)到90%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（7）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入3-5ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（8）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，在1200rpm的條件下，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培養(yǎng)基中加入fgf-2、自體血清、慶大霉素，直至dmem高糖培養(yǎng)基中的fgf-2的質(zhì)量濃度為10ng/ml、自體血清的體積濃度為10%、慶大霉素的質(zhì)量濃度為45ug/ml為止，用含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml的高糖dmem培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108/l，將細(xì)胞接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；
（10）、細(xì)胞培養(yǎng)3-4周后，細(xì)胞傳代3次；
（11）、吸干培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入3-5ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（12）、將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，棄上清，再用生理鹽水洗滌細(xì)胞3次；
（13）、用0.3-1ml生理鹽水重懸細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液；
（14）、取無(wú)菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜并修剪成與軟骨損傷處一樣的形狀，置于無(wú)菌塑料平皿中，糙面朝上，光面朝下放置，再根據(jù)膜的面積，細(xì)胞數(shù)約2×106/cm2，用塑料套管緩慢滴加細(xì)胞懸液于準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面上，直至膠原膜達(dá)到濕飽和狀態(tài)；
（15）、待膠原膜吸附細(xì)胞10-15min后，即可。
作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的肝素鈉生理鹽水的濃度為1200u/ml。
作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中含有慶大霉素，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中的慶大霉素的濃度為45ug/ml。
所述的步驟（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。
作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的接種自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原膜的使用方法為：取本發(fā)明制得的接種自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原膜，使糙面朝向關(guān)節(jié)軟骨缺損處，光面朝向關(guān)節(jié)腔，固定于軟骨缺損處，以修復(fù)軟骨損傷。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明采用了一種豬腹膜源的ⅰ/ⅲ型膠原雙分子層膜結(jié)構(gòu)，其一面具有相對(duì)較高密度的膠原纖維，表面摩擦較低，細(xì)胞不通透，可阻止細(xì)胞向關(guān)節(jié)腔擴(kuò)散，另一面為粗糙的表面，上面空隙較大，有利于軟骨細(xì)胞附著其中，這種膜具有持久性、耐撕裂，其可承受切割、打孔、縫合等操作，其具有彈性，可修成不同形狀，不會(huì)隨著時(shí)間的推移而收縮,其具有可吸收性，移植2周后可被降解吸收,可作為極佳的組織工程支架材料,治療效果好，而且成本較低；
2、本技術(shù)通過(guò)對(duì)第二代aci技術(shù)的改進(jìn)，使比第三代技術(shù)更高密度、更均勻分布的細(xì)胞吸附于膠原膜上，其方案為取無(wú)菌干燥豬膠源ⅰ/ⅲ型膠原膜修剪成與軟骨損傷處相同的形狀，然后接種高濃度軟骨細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)約2×106/cm2使其達(dá)到飽和濕度，使膠原膜吸附細(xì)胞10-15min，細(xì)胞即可均勻吸附。該方案先修剪膠原膜為需要形狀，再接種細(xì)胞，可以避免因修剪和切割孵育了細(xì)胞的膜而引起的關(guān)鍵軟骨細(xì)胞的損失，本技術(shù)有利于細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)增和分布，同時(shí)可以縮短術(shù)后的康復(fù)時(shí)間，操作上也更簡(jiǎn)單化，同時(shí)也保留了第三代技術(shù)的療效和操作的簡(jiǎn)單性；
3、采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow–derivedmesenchymalstemcells，bmsc)作為種子細(xì)胞，其來(lái)源充足，通過(guò)簡(jiǎn)單的骨髓穿刺就可取材，不存在組織配型及免疫排斥反應(yīng)，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定，易于傳代擴(kuò)增，可克服體內(nèi)軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞來(lái)源有限、體外擴(kuò)增易導(dǎo)致種子細(xì)胞老化及生物學(xué)功能衰退的缺點(diǎn)，同時(shí)也減少了患者手術(shù)次數(shù)，降低治療費(fèi)用；
4、使用自體血清，避免了使用胎牛血清可能引起的免疫原性反應(yīng)；
5、本發(fā)明可用于治療3-20cm2的軟骨損傷面積，修復(fù)面大；
6、使用了10ng/ml的成纖維生長(zhǎng)因子-2（fgf-2）,其可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分裂增殖，縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，又有利于維持細(xì)胞的分化潛能，有利于細(xì)胞后期分化為為軟骨細(xì)胞。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
本發(fā)明公開了一種接種自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原膜的制備方法，具體步驟為：
（1）、在無(wú)菌條件下，用內(nèi)含1ml肝素鈉生理鹽水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去針頭后，加入含10mldmem高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，混勻后得到骨髓懸液，備用；
（2）、在無(wú)菌條件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封帶入實(shí)驗(yàn)室中，然后將外周血置于50ml離心管中，在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，再對(duì)上清離心30min，去沉淀，0.22μm孔徑過(guò)濾除菌，得到自體血清，分裝待用；
（3）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細(xì)胞分離液的離心管中，進(jìn)行梯度離心，即在2000rpm的條件下，離心20min；
（4）、吸取中間白膜層，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，得到的沉淀即為目的細(xì)胞；
（5）、向dmem高糖培養(yǎng)基中加入fgf-2、自體血清、慶大霉素，直至dmem高糖培養(yǎng)基中的fgf-2的質(zhì)量濃度為10ng/ml、自體血清的體積濃度為10%、慶大霉素的質(zhì)量濃度為45ug/ml為止，然后將目的細(xì)胞加入15ml含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml的dmem高糖培養(yǎng)基中，吹打計(jì)數(shù)，以5×105/cm2接種于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每三天更換一次dmem高糖培養(yǎng)基，該dmem高糖培養(yǎng)基同樣含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml；
（6）、細(xì)胞貼壁達(dá)到90%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（7）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入3-5ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（8）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，在1200rpm的條件下，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培養(yǎng)基中加入fgf-2、自體血清、慶大霉素，直至dmem高糖培養(yǎng)基中的fgf-2的質(zhì)量濃度為10ng/ml、自體血清的體積濃度為10%、慶大霉素的質(zhì)量濃度為45ug/ml為止，用含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml的高糖dmem培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108/l，將細(xì)胞接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；
（10）、細(xì)胞培養(yǎng)3-4周后，細(xì)胞傳代3次；
（11）、吸干培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入3-5ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（12）、將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，棄上清，再用生理鹽水洗滌細(xì)胞3次；
（13）、用0.3-1ml生理鹽水重懸細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液；
（14）、取無(wú)菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜并修剪成與軟骨損傷處一樣的形狀，置于無(wú)菌塑料平皿中，糙面朝上，光面朝下放置，再根據(jù)膜的面積，細(xì)胞數(shù)約2×106/cm2，用塑料套管緩慢滴加細(xì)胞懸液于準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面上，直至膠原膜達(dá)到濕飽和狀態(tài)；
（15）、待膠原膜吸附細(xì)胞10-15min后，即可。
作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的肝素鈉生理鹽水的濃度為1200u/ml。
作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中含有慶大霉素，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中的慶大霉素的濃度為45ug/ml。
所述的步驟（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。
作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的接種自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原膜的使用方法為：取本發(fā)明制得的接種自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原膜，使糙面朝向關(guān)節(jié)軟骨缺損處，光面朝向關(guān)節(jié)腔，固定于軟骨缺損處，以修復(fù)軟骨損傷。
實(shí)施例1
本發(fā)明公開了一種接種自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原膜的制備方法，具體步驟為：
（1）、在無(wú)菌條件下，用內(nèi)含1ml肝素鈉生理鹽水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去針頭后，加入含10mldmem高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，混勻后得到骨髓懸液，備用；
（2）、在無(wú)菌條件下，取患者外周血150ml，置于血袋中，密封帶入實(shí)驗(yàn)室中，然后將外周血置于50ml離心管中，在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，再對(duì)上清離心30min，去沉淀，0.22μm孔徑過(guò)濾除菌，得到自體血清，分裝待用；
（3）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細(xì)胞分離液的離心管中，進(jìn)行梯度離心，即在2000rpm的條件下，離心20min；
（4）、吸取中間白膜層，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，得到的沉淀即為目的細(xì)胞；
（5）、向dmem高糖培養(yǎng)基中加入fgf-2、自體血清、慶大霉素，直至dmem高糖培養(yǎng)基中的fgf-2的質(zhì)量濃度為10ng/ml、自體血清的體積濃度為10%、慶大霉素的質(zhì)量濃度為45ug/ml為止，然后將目的細(xì)胞加入15ml含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml的dmem高糖培養(yǎng)基中，吹打計(jì)數(shù)，以5×105/cm2接種于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每三天更換一次dmem高糖培養(yǎng)基，該dmem高糖培養(yǎng)基同樣含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml；
（6）、細(xì)胞貼壁達(dá)到90%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（7）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入4ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（8）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，在1200rpm的條件下，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培養(yǎng)基中加入fgf-2、自體血清、慶大霉素，直至dmem高糖培養(yǎng)基中的fgf-2的質(zhì)量濃度為10ng/ml、自體血清的體積濃度為10%、慶大霉素的質(zhì)量濃度為45ug/ml為止，用含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml的高糖dmem培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108/l，將細(xì)胞接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；
（10）、細(xì)胞培養(yǎng)3周后，細(xì)胞傳代3次；
（11）、吸干培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于溫箱2min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入4ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（12）、將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，棄上清，再用生理鹽水洗滌細(xì)胞3次；
（13）、用0.3-1ml生理鹽水重懸細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液；
（14）、取無(wú)菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜并修剪成與軟骨損傷處一樣的形狀，置于無(wú)菌塑料平皿中，糙面朝上，光面朝下放置，再根據(jù)膜的面積，細(xì)胞數(shù)約2×106/cm2，用塑料套管緩慢滴加細(xì)胞懸液于準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面上，直至膠原膜達(dá)到濕飽和狀態(tài)；
（15）、待膠原膜吸附細(xì)胞14min后，即可。
作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的肝素鈉生理鹽水的濃度為1200u/ml。
作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中含有慶大霉素，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中的慶大霉素的濃度為45ug/ml。
所述的步驟（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。
實(shí)施例2
本發(fā)明公開了一種接種自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原膜的制備方法，具體步驟為：
（1）、在無(wú)菌條件下，用內(nèi)含1ml肝素鈉生理鹽水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去針頭后，加入含10mldmem高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，混勻后得到骨髓懸液，備用；
（2）、在無(wú)菌條件下，取患者外周血180ml，置于血袋中，密封帶入實(shí)驗(yàn)室中，然后將外周血置于50ml離心管中，在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，再對(duì)上清離心30min，去沉淀，0.22μm孔徑過(guò)濾除菌，得到自體血清，分裝待用；
（3）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細(xì)胞分離液的離心管中，進(jìn)行梯度離心，即在2000rpm的條件下，離心20min；
（4）、吸取中間白膜層，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50mlpbs吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，得到的沉淀即為目的細(xì)胞；
（5）、向dmem高糖培養(yǎng)基中加入fgf-2、自體血清、慶大霉素，直至dmem高糖培養(yǎng)基中的fgf-2的質(zhì)量濃度為10ng/ml、自體血清的體積濃度為10%、慶大霉素的質(zhì)量濃度為45ug/ml為止，然后將目的細(xì)胞加入15ml含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml的dmem高糖培養(yǎng)基中，吹打計(jì)數(shù)，以5×105/cm2接種于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每三天更換一次dmem高糖培養(yǎng)基，該dmem高糖培養(yǎng)基同樣含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml；
（6）、細(xì)胞貼壁達(dá)到90%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（7）、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入5ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（8）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，在1200rpm的條件下，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培養(yǎng)基中加入fgf-2、自體血清、慶大霉素，直至dmem高糖培養(yǎng)基中的fgf-2的質(zhì)量濃度為10ng/ml、自體血清的體積濃度為10%、慶大霉素的質(zhì)量濃度為45ug/ml為止，用含10ng/mlfgf-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml的高糖dmem培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108/l，將細(xì)胞接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；
（10）、細(xì)胞培養(yǎng)3周后，細(xì)胞傳代3次；
（11）、吸干培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的質(zhì)量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于溫箱2min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入3ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（12）、將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，棄上清，再用生理鹽水洗滌細(xì)胞3次；
（13）、用0.3ml生理鹽水重懸細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液；
（14）、取無(wú)菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜并修剪成與軟骨損傷處一樣的形狀，置于無(wú)菌塑料平皿中，糙面朝上，光面朝下放置，再根據(jù)膜的面積，細(xì)胞數(shù)約2×106/cm2，用塑料套管緩慢滴加細(xì)胞懸液于準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面上，直至膠原膜達(dá)到濕飽和狀態(tài)；
（15）、待膠原膜吸附細(xì)胞15min后，即可。
作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的肝素鈉生理鹽水的濃度為1200u/ml。
作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中含有慶大霉素，所述的dmem高糖培養(yǎng)基中的慶大霉素的濃度為45ug/ml。
所述的步驟（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。