本發(fā)明涉及一種重組人顆粒細(xì)胞酶溶液及其制備方法，屬于人工輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)是能使透明質(zhì)酸產(chǎn)生低分子化作用酶的總稱，一種能夠降低體內(nèi)透明質(zhì)酸的活性，從而提高組織中液體滲透能力的酶。透明質(zhì)酸酶可以有效地消化顆粒細(xì)胞間的透明質(zhì)酸，以便通過剝卵吸管(針)機(jī)械地去除卵子周圍的顆粒細(xì)胞，隨后實(shí)施單精子注射或者卵子冷凍技術(shù)。
現(xiàn)有技術(shù)中，常規(guī)的透明質(zhì)酸酶主要來源于動(dòng)物的睪丸組織，如牛、羊等，存在著潛在的動(dòng)物源性病原體及毒素的風(fēng)險(xiǎn)，為輔助生殖技術(shù)帶來安全性問題。
我國輔助生殖技術(shù)中的透明質(zhì)酸酶溶液幾乎完全依賴進(jìn)口成品，不僅成本高且溶液經(jīng)長途運(yùn)輸和海關(guān)檢查后，其有效性受到不同程度的影響，甚至變質(zhì)，如果使用變質(zhì)的溶液，將對輔助生殖的治療帶來不可逆轉(zhuǎn)的后果和風(fēng)險(xiǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)達(dá)到體外受精培養(yǎng)液標(biāo)準(zhǔn)，使用安全、無病原體和內(nèi)毒素的消化、去除卵子周圍顆粒細(xì)胞的重組人顆粒細(xì)胞酶溶液及其制備方法。
為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
一種重組人顆粒細(xì)胞酶溶液，其特征在于：采用對卵子進(jìn)行處理的重組人顆粒細(xì)胞酶干粉溶解于含有抗菌素和指示劑的鹽溶液中配制而成。
進(jìn)一步地說，所述抗菌素為慶大霉素，濃度為5-11μg/ml。
再進(jìn)一步說，所述指示劑為為酚紅，濃度9.0-10.0μg/ml；
更進(jìn)一步說，所述鹽溶液是以hepes或者mops為緩沖劑，以鈉、鉀、鎂、鈣離子為基礎(chǔ)，并以葡萄糖、丙酮酸鈉、乳酸鈉、白蛋白為能量物質(zhì)的化合物溶液；其中包含：氯化鈉98.11-102.00mmol/l、氯化鉀4.55-4.70mmol/l、硫酸鎂0.18-0.22mmol/l、氯化鈣1.92-2.12mmol/l、碳酸氫鈉3.90-4.10mmol/l、緩沖劑19.99-22.00mmol/l、葡萄糖2.68-2.88mmol/l、丙酮酸鈉0.31-0.33mmol/l、乳酸鈉21.11-21.66mmol/l、磷酸二氫鉀0.36-0.39mmol/l；
所述白蛋白為重組人血清白蛋白，是采用醫(yī)療級(jí)原材料的重組人血清白蛋白干粉溶解于在鹽水溶液中制備而成，終濃度為5mg/ml。
本發(fā)明所述重組人顆粒細(xì)胞酶溶液的制備方法，包括以下步驟：
1、稱量好各種組分，備用；
2、稱量好的組分中，除了抗菌素、指示劑、碳酸氫鈉以外的各組分溶于超純注射級(jí)用水中，溶解過程中遵循先固體后液體的原則；所述超純注射級(jí)用水經(jīng)0.1-0.μm濾膜過濾的，內(nèi)毒素＜0.5eu/ml；
3、向步驟2制得的鹽溶液中依次加入稱量好的抗菌素、指示劑、碳酸氫鈉；
4、檢測步驟3所得鹽溶液的滲透壓和ph值，并記錄最終滲透壓和ph值；所述滲透壓保持為250-275mosm/kg，所述ph值保持為7.0-7.4；
5、按照預(yù)配置的容量，將終濃度為5mg/ml的重組人血清白蛋白補(bǔ)充到鹽溶液中；
6、將重組人顆粒細(xì)胞酶干粉以30-100單位/毫升的濃度溶解于步驟5制得的鹽溶液中，到充分溶解止，制得酶溶液；
7、將步驟6所得酶溶液經(jīng)過0.2μm濾膜過濾滅菌后，取樣測試；測試參數(shù)：
a、30-37℃條件下ph值：7.1-7.4；
b、滲透壓：270-290mosm/kg；
c、內(nèi)毒素：＜1.0eu/ml；
d.一細(xì)胞鼠胚培養(yǎng)到96小時(shí)：≥80％的囊胚形成率；
8、將配置好的酶溶液在百級(jí)gmp車間進(jìn)行無菌分裝和標(biāo)簽。
有益效果：本發(fā)明是利用非動(dòng)物源性重組的生物工程高科技透明質(zhì)酸酶(又稱重組人顆粒細(xì)胞酶)干粉配制的80單位(i.u.)和功能可行濃度的生理工作液，不僅能有效地消化卵子周圍的顆粒細(xì)胞，以利于卵子的單精子注射(icsi)技術(shù)，而且，能有效地排除動(dòng)物源性病原體及毒素的可能性，從而大大地提高輔助生殖的安全性。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
本發(fā)明所述重組人顆粒細(xì)胞酶溶液，采用對卵子進(jìn)行處理的重組人顆粒細(xì)胞酶干粉溶解于含有抗菌素和指示劑的鹽溶液中配制而成。
所述抗菌素為慶大霉素，濃度為5-11μg/ml；所述指示劑為為酚紅，濃度9.0-10.0μg/ml。
所述鹽溶液是以hepes或者mops為緩沖劑，以鈉、鉀、鎂、鈣離子為基礎(chǔ)，并以葡萄糖、丙酮酸鈉、乳酸鈉、白蛋白為能量物質(zhì)的化合物溶液；其中包含：氯化鈉98.11-102.00mmol/l、氯化鉀4.55-4.70mmol/l、硫酸鎂0.18-0.22mmol/l、氯化鈣1.92-2.12mmol/l、碳酸氫鈉3.90-4.10mmol/l、緩沖劑19.99-22.00mmol/l、葡萄糖2.68-2.88mmol/l、丙酮酸鈉0.31-0.33mmol/l、乳酸鈉21.11-21.66mmol/l、磷酸二氫鉀0.36-0.39mmol/l。
所述白蛋白為重組人血清白蛋白，是采用醫(yī)療級(jí)原材料的重組人血清白蛋白干粉溶解于在鹽水溶液中制備而成，終濃度為5mg/ml。
所述重組人顆粒細(xì)胞酶溶液的制備方法，包括以下步驟：
1、稱量好各種組分，備用；
2、稱量好的組分中，除了抗菌素、指示劑、碳酸氫鈉以外的各組分溶于超純注射級(jí)用水中，溶解過程中遵循先固體后液體的原則；所述超純注射級(jí)用水經(jīng)0.1-0.μm濾膜過濾的，內(nèi)毒素＜0.5eu/ml；
3、向步驟2制得的鹽溶液中依次加入稱量好的抗菌素、指示劑、碳酸氫鈉；
4、檢測步驟3所得鹽溶液的滲透壓和ph值，并記錄最終滲透壓和ph值；所述滲透壓保持為250-275mosm/kg，所述ph值保持為7.0-7.4；
5、按照預(yù)配置的容量，將終濃度為5mg/ml的重組人血清白蛋白補(bǔ)充到鹽溶液中；
6、將重組人顆粒細(xì)胞酶干粉以30-100單位/毫升的濃度(優(yōu)選的溶解濃度為80單位/毫升)溶解于步驟5制得的鹽溶液中，到充分溶解止，制得酶溶液；
7、將步驟6所得酶溶液經(jīng)過0.2μm濾膜過濾滅菌后，取樣測試；測試參數(shù)：
a、30-37℃條件下ph值：7.1-7.4；
b、滲透壓：270-290mosm/kg；
c、內(nèi)毒素：＜1.0eu/ml；
d.一細(xì)胞鼠胚培養(yǎng)到96小時(shí)：≥80％的囊胚形成率；
8、將配置好的酶溶液在百級(jí)gmp車間進(jìn)行無菌分裝和標(biāo)簽。
【存儲(chǔ)說明和穩(wěn)定性】
將分裝好的酶溶液存放于2℃～8℃溫度條件下；使用前，溫?zé)嶂僚囵B(yǎng)箱(至37℃)；應(yīng)盡可能減少液體暴露于co2，以避免7.0或更低的ph水平。還要避免暴露在高于39℃的溫度下。產(chǎn)品穩(wěn)定性可以直到標(biāo)簽上顯示的到期日期。使用無菌程序除去所需體積的產(chǎn)品，一旦移除，不要將任何量的產(chǎn)品返回原始容器；如果產(chǎn)品變色，渾濁或有微生物污染跡象，請勿使用。為避免污染問題，使用無菌技術(shù)進(jìn)行處理，并在完成操作后丟棄瓶子或小瓶中剩余的任何多余產(chǎn)品。
【具體使用方法】
在實(shí)驗(yàn)室里，將重組顆粒細(xì)胞酶溶液在37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱至少1-2小時(shí)，然后，將卵子置于含有酶溶液的皿內(nèi)；在37℃的環(huán)境下，通過顯微鏡觀察，用剝卵吸管(針)機(jī)械的去除卵子周圍的顆粒細(xì)胞，然后，洗滌剝除顆粒細(xì)胞的卵子，并移到37℃的co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，為單精子注射或者卵子冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>