本發(fā)明涉及一種新骨架倍半萜化合物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

廣藿香為唇形科(lamiaceae)刺蕊草屬(pogostemon)植物廣藿香pogostemoncablin(blanco)benth.的干燥地上部分，為廣東道地藥材，也是著名的“十大南藥”之一。國(guó)內(nèi)外已對(duì)廣藿香進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的生物活性，在抗菌、抗真菌、調(diào)節(jié)胃腸道、抗炎、鎮(zhèn)痛等方面顯示出潛在的藥用價(jià)值，并已成為40余種中成藥如“藿香正氣丸(水)”、“藿香清胃片”、“藿香祛暑軟膠囊”等的重要組成成分。此外，廣藿香油還是諸多日常生活用品如化妝品、殺蟲(chóng)劑和定香劑等的生產(chǎn)配料，為重要的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外研究者已從廣藿香中分離得到140余個(gè)單體化合物，其主要的結(jié)構(gòu)類型包括黃酮類、苯丙素類、萜類(單萜、倍半萜、二萜等)、甾體類、生物堿類以及脂肪酸類等。其中倍半萜類化合物種類繁多，含量豐富。

因此，從廣藿香藥材中分離提取出新的化合物并且以此為基礎(chǔ)進(jìn)行衍生，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了式(a)所示的化合物、或其晶型、或其立體異構(gòu)體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其溶劑合物、或其前體藥物、或其代謝產(chǎn)物，

其中，r1～r12分別獨(dú)立地選自氫、鹵素、羥基、氨基、c1～c6的烷基或c1～c6的烷氧基。

進(jìn)一步地，r12選自羥基或c1～c6的烷氧基。

進(jìn)一步地，r2～r8均為氫。

進(jìn)一步地，所述式(a)化合物如式(b)所示：

進(jìn)一步地，r1、r9、r10、r11分別獨(dú)立地選自c1～c4的烷基。

進(jìn)一步地，所述化合物如式ⅱ所示：

本發(fā)明還提供了一種制備前述式ⅱ化合物的方法，其特征在于：包括以下步驟：

a、取廣藿香藥材，水蒸氣蒸餾提取，干燥除水，得到廣藿香揮發(fā)油；

b、取步驟a所得廣藿香油，采用硅膠柱色譜，依次以石油醚：乙酸乙酯＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、3:1、0:100為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到石油醚：乙酸乙酯＝10:1時(shí)的洗脫液f28；

c、取步驟b所得洗脫液f28上反相中壓柱色譜，依次以甲醇：水＝50：50、65：35、80：20、90：10、100：0為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜檢視，合并相似組分，得到甲醇：水＝65：35時(shí)的洗脫液f28-b；

d、取步驟c所得洗脫液f28-b，經(jīng)正相柱色譜，以石油醚-三氯甲烷-甲醇＝5:5:1為洗脫劑洗脫后，根據(jù)薄層色譜法合并相似組分，回收溶劑，得到3個(gè)亞組分f28-b-1－f28-b-3；

e、取步驟d所得洗脫液f28-b-2經(jīng)制備薄層色譜法以及反相半制備液相色譜，以65％甲醇水洗脫，分離得到目標(biāo)化合物，即得式ⅱ所示化合物。

進(jìn)一步地，步驟a中，所述水蒸氣蒸餾提取的時(shí)間為16～20h；；

步驟b中，梯度洗脫的條件如下：

步驟c中，梯度洗脫的條件如下：

步驟d中，所述正相柱色譜為正相sephadexlh-20柱色譜，洗脫劑石油醚-三氯甲烷-甲醇＝5:5:1的體積為0.52l；

步驟e中，制備薄層色譜的展開(kāi)劑為正己烷-丙酮＝5:1，反相液相制備色譜的洗脫劑為65％甲醇水。

本發(fā)明還提供了前述的化合物、或其晶型、或其立體異構(gòu)體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其溶劑合物、或其前體藥物、或其代謝產(chǎn)物在制備舒張血管藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選的，所述

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它是前述的化合物、或其晶型、或其立體異構(gòu)體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其溶劑合物、或其前體藥物、或其代謝產(chǎn)物，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。

試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明化合物具有較好的舒張血管作用，為臨床上篩選和/或制備舒張血管藥物提供了一種新的選擇。

本發(fā)明中：

所述c1～c4的烷基是指c1、c2、c3、c4的烷基，即具有1～4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基等等。

所述c1～c6的烷基是指c1、c2、c3、c4、c5、c6的烷基，即具有1～6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、己基等等。

本發(fā)明的一種或多種化合物可以彼此聯(lián)合使用，也可選擇將本發(fā)明的化合物與任何其它的活性試劑結(jié)合使用，。如果使用的是一組化合物，則可將這些化合物同時(shí)、分別或有序地對(duì)受試對(duì)象進(jìn)行給藥。

本發(fā)明所述藥學(xué)上可接受的輔料，是指除活性成分以外包含在劑型中的物質(zhì)。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明式ⅱ化合物的hresims圖。

圖2為本發(fā)明式ⅱ化合物的紅外光譜圖(ir)。

圖3為本發(fā)明式ⅱ化合物的¹h-nmr圖。

圖4為本發(fā)明式ⅱ化合物的¹³c-nmr圖。

圖5為本發(fā)明式ⅱ化合物的hmbc、cosy和noesy信號(hào)圖。

圖6為本發(fā)明式ⅱ化合物的x單晶圖。

圖7為本發(fā)明式ⅱ化合物對(duì)大鼠主動(dòng)脈的舒張作用圖：其中，橫坐標(biāo)為濃度的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為收縮率(％)，廣藿香半縮酮c(pocahemiketalc)是指本發(fā)明目標(biāo)化合物。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明具體實(shí)施方式中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過(guò)購(gòu)買市售產(chǎn)品獲得。

實(shí)施例1本發(fā)明化合物的制備

(1)實(shí)驗(yàn)材料：

①藥材

廣藿香藥材于2012年11月采自廣東省陽(yáng)春縣廣藿香種植基地，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室龍飛博士鑒定為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香(pogostemoncablin(blanco)benth.)的全草。

②試劑和填料

柱層析硅膠，200～300目(試劑級(jí))，購(gòu)于青島海洋硅膠干燥劑廠；

薄層層析硅膠g、gf254和h(化學(xué)純)，購(gòu)于青島海洋硅膠干燥劑廠；

中壓液相色譜儀：búchigradientformerb-687，rpc18，43-60μm；

agilentzorbaxsb-c18(9.4×250mm，5μm)半制備型柱；

sephadexlh-20葡聚糖凝膠，購(gòu)于瑞典amersham公司；

gf254硅膠制備薄層，購(gòu)于煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司；

石油醚、正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等分析純?cè)噭?，?gòu)于成都科龍化工試劑廠。

③實(shí)驗(yàn)儀器

agilent1220高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫)；

waterssynaptg2hdms高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜(美國(guó)waters)；

bruker-aviiihd-600核磁共振儀(瑞士bruker)；

傅里葉變換紅外光譜儀：nicolet5700紅外光譜儀(美國(guó)thermo公司)；

x-單晶衍射儀：brukerapexⅱduo雙光源單晶衍射儀；

shimadzuuv-260紫外-可見(jiàn)分光光度儀(日本shimadzu)；

安東帕mcp200旋光測(cè)定儀(奧地利安東帕)；

bp211d十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士sartorius)；

r-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士buchi)；

dzg-6050型真空干燥箱(上海森信)。

(2)成分的分離純化：

①、藥材的提?。喝「稍锏膹V藿香藥材地上部分40kg，采用大型的改良水蒸氣蒸餾裝置進(jìn)行提取，收集得到揮發(fā)油，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥除水，最終得到廣藿香揮發(fā)油215g；

②、采用硅膠柱色譜(100－200目，5kg，20×150cm)對(duì)廣藿香揮發(fā)油(215g)進(jìn)行色譜分離，以石油醚－乙酸乙酯(100:0－0:100)為流動(dòng)相按照表1進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測(cè)，合并組成相似的流份，回收溶劑得到31個(gè)洗脫部分(f1－f31)。

③、f28(10.8g)通過(guò)反相中壓液相色譜以50－100％甲醇溶液按照表2進(jìn)行梯度洗脫，得到f28-a－f28-f共6分洗脫部分；f28-b部分經(jīng)正相sephadexlh-20柱色譜，以石油醚-三氯甲烷-甲醇5:5:1為洗脫劑，根據(jù)薄層追蹤，分離得到3個(gè)亞組分(f28-b-1－f28-b-3)；f28-b-2經(jīng)制備薄層色譜法(展開(kāi)劑：正己烷∶丙酮＝5∶1)以及反相半制備液相色譜，以65％甲醇水洗脫，分離得到目標(biāo)物(8.4mg,tr＝55.4min)。

表1硅膠柱色譜的洗脫條件

表2反相中壓液相色譜的洗脫條件

(4)目標(biāo)化合物的鑒定：

無(wú)色晶體(甲醇)；無(wú)暗斑，碘顯黃色，噴10％硫酸乙醇溶液在105℃下顯紫紅色；由hresimsm/z259.1317[m+na]⁺可確定分子式為c14h20o3(見(jiàn)圖1)。

紅外光譜中(見(jiàn)圖2)可以看出具有明顯的oh信號(hào)(3306.3cm^-1)和羰基信號(hào)(1717.2cm^-1)。

化合物的¹hnmr譜(見(jiàn)圖3)中可以看出有四個(gè)單峰甲基信號(hào)(δ0.90,0.97,1.26,1.54)和1個(gè)活潑oh質(zhì)子信號(hào)(δ6.06)；化合物的¹³cnmr譜(見(jiàn)圖4)給出14個(gè)碳信號(hào)，dept譜顯示這些碳信號(hào)分別為4個(gè)甲基、3個(gè)亞甲基、1個(gè)次甲基和6個(gè)季碳(含1個(gè)酯羰基δc169.5、2個(gè)雙鍵季碳δc135.1,162.0、1個(gè)雙連氧季碳δc104.0、以及2個(gè)脂肪族季碳δc45.2和44.7)。表明該化合物為一個(gè)降碳的倍半萜衍生物。在hmbc譜(圖5)中，h2-4、h2-7和h3-12與一個(gè)雙鍵季碳(δc135.1)相關(guān)；h2-4和h-5與另一個(gè)雙鍵季碳(δc162.0)相關(guān)，表明在雙環(huán)[3.2.1]辛烷片段中，存在c-2＝c-3四取代雙鍵。此外，結(jié)合h3-11與c-3、c-10的hmbc相關(guān)信號(hào)和c-10的化學(xué)位移(δc104.0)，推斷c-10為一個(gè)半縮酮季碳，連接c-3和甲基c-11。雖然羰基(c-9)沒(méi)有顯示任何相關(guān)hmbc信號(hào)，但根據(jù)分子式和不飽和度可知，化合物c-9為一個(gè)酯羰基，與c-2＝c-3四取代雙鍵以及半縮酮季碳c-10共同組成一個(gè)半縮酮-α,β-不飽和-γ-內(nèi)酯。化合物的noesy(圖5)顯示h3-11和h3-13與h-4a相關(guān)，表明h3-11與“c-1–c-8–c-5”橋處于環(huán)庚烷的同側(cè)。進(jìn)一步通過(guò)x-射線單晶衍射(圖6)確定化合物的絕對(duì)構(gòu)型為1r,5r,10r[flackparameter＝0.17(15)]，命名為廣藿香半縮酮c(pocahemiketalc)。因此，本發(fā)明新化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，包括絕對(duì)構(gòu)型得到了確定，如式ⅱ所示：

(5)核磁共振氫譜(¹h-nmr)：bruker-aviiihd-600spectrometer測(cè)定，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

(6)核磁共振碳譜(¹³c-nmr)：bruker-aviiihd-600spectrometer測(cè)定，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3化合物的¹hnmr(600mhz)、¹³cnmr(150mhz)核磁數(shù)據(jù)(測(cè)定溶劑：acetone-d6；δ：ppm；j：hz)

(7)x-單晶：brukerapexⅱduo雙光源單晶衍射儀測(cè)定，數(shù)據(jù)如下：

分子式：c14h20o3,m＝236.30,單斜晶系,α＝90.00°,β＝91.8600(10)°,γ＝90.00°,t＝100(2)k,空間群p21,z＝4,μ(cukα)＝0.685mm^-1,11736reflectionsmeasured,4084independentreflections(rint＝0.0472).thefinalr1valueswere0.0398(i>2σ(i)).thefinalwr(f²)valueswere0.1046(i>2σ(i)).thefinalr1valueswere0.0406(alldata).thefinalwr(f²)valueswere0.1059(alldata).thegoodnessoffitonf²was1.051.flackparameter＝0.17(15).

為了說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明提供以下試驗(yàn)例。

試驗(yàn)例1舒張血管試驗(yàn)

(1)實(shí)驗(yàn)材料：

①藥物

受試化合物用dmso配置成1×10^-2mol/l的貯備液，-10℃保存。陽(yáng)性藥物(甲磺酸酚妥拉明)用生理鹽水配置。

②動(dòng)物

sd大鼠，清潔級(jí)，雌雄不拘，體重200～240g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。生產(chǎn)質(zhì)量合格證號(hào)：scxk(川)2008-11。

③試劑

甲磺酸酚妥拉明，中國(guó)藥品食品檢定研究院。

krebs-henselei營(yíng)養(yǎng)液(k-h液)：組成(mm):nacl,120；kcl,4.6；kh2po4,1.2；mgso4,1.2；nahco3,25；glucose,10；cacl2,2.5，ph4.8。

二甲基亞砜(dmso)，分析純，500ml/瓶，購(gòu)于成都科龍化工試劑廠。

④實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平(esj120-4型，沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司)；

肌張力傳感器(jh-2型，中國(guó)北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所)；

生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)(bl-420f型，成都泰盟科技有限公司)；

離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)(hv-4型，成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品)。

(2)實(shí)驗(yàn)方法：

①血管環(huán)的制備

sd大鼠脫臼處死后迅速開(kāi)胸，剪下胸主動(dòng)脈降支，置于盛有4℃充有混合氧氣(95％o2和5％co2)的k-h液體中，沖洗血管血跡，剔除周圍脂肪和結(jié)締組織，用手術(shù)刀切成3～4mm長(zhǎng)的血管環(huán)。標(biāo)本的端用不銹鋼鉤垂直懸吊于血管平滑肌浴槽中，另一端與肌張力換能器連接，使用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄血管環(huán)張力的變化。浴槽中k-h液保持37℃，持續(xù)通以95％o2和5％co2混合氣體，給予標(biāo)本張力1g平衡1.5～2h，每15min換液一次。

②化合物對(duì)苯腎上腺素(phe)所致的主動(dòng)脈環(huán)收縮反應(yīng)的影響

在主動(dòng)脈血管環(huán)穩(wěn)定后，加入phe(1μm)，待血管穩(wěn)定收縮后，加入不同劑量的化合物，以甲磺酸酚妥拉明為陽(yáng)性對(duì)照，加入藥物達(dá)到坪值后的血管張力幅度與phe誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮之間的比率反應(yīng)血管張力的變化。

③實(shí)驗(yàn)結(jié)果和評(píng)價(jià)：

通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中主要觀察記錄了藥物濃度分別為1×10^-6mol/l,3×10^-6mol/l,10^-5mol/l,3×10^-5mol/l和10^-4mol/l時(shí)的張力變化，可以觀察到化合物對(duì)phe誘發(fā)的主動(dòng)脈血管收縮有明顯的舒張作用，經(jīng)過(guò)graphpadprism5統(tǒng)計(jì)分析，本發(fā)明化合物的ec50值分別為16.32μm，其結(jié)果見(jiàn)圖7，陽(yáng)性藥的ec50值為66.02nm。

ec50，半最大效應(yīng)濃度(concentrationfor50％ofmaximaleffect，ec50)是指能引起50％最大效應(yīng)的濃度；ec50是評(píng)價(jià)藥物安全的重要指標(biāo)，其中l(wèi)d50/ed50、td50/ed50、tc50/ec50等統(tǒng)稱為治療指數(shù)，在評(píng)價(jià)藥物的安全性時(shí)，通常其值越大越安全。

試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明化合物具有較好的舒張血管作用，為臨床上篩選和/或制備舒張血管藥物提供了一種新的選擇。