本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及pdcd4作為抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物治療靶點(diǎn)的應(yīng)用，尤其涉及pdcd4作為治療靶點(diǎn)在篩選抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物中的應(yīng)用和方法，以及pdcd4作為靶點(diǎn)在制備抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物中的用途。

背景技術(shù)：

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告指出，預(yù)計(jì)到2020年，抑郁癥將成為全球范圍內(nèi)第二大致殘疾病。目前來(lái)說(shuō)，全球有3.5億抑郁癥患者，我國(guó)抑郁癥人群約9000萬(wàn)，每年有20萬(wàn)人因抑郁癥自殺。抑郁癥的產(chǎn)生不僅大大降低了人的生活質(zhì)量，而且日益提高的發(fā)病率和致死率將來(lái)會(huì)為社會(huì)和家庭帶來(lái)更大的負(fù)擔(dān)。因此，明確抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和研究治療方法已成為科學(xué)家長(zhǎng)期致力的方向。

抑郁癥(depression)是指以情緒低落、思維遲緩并伴有興趣減低、主動(dòng)性下降等精神運(yùn)動(dòng)性遲滯癥狀為主要表現(xiàn)的一類心境障礙綜合癥。焦慮癥和抑郁癥在醫(yī)學(xué)上雖然被分成兩種精神疾病，但在臨床上兩者經(jīng)常合并存在，有時(shí)難以鑒別，因此很多學(xué)者建議二者合并治療。

目前在市面上已經(jīng)出現(xiàn)很多種類抗抑郁藥物，主要包含：?jiǎn)伟费趸割愐种苿?、三環(huán)類藥物和選擇性五羥色胺再攝取抑制劑。但是，這些藥物都普遍存在見(jiàn)效時(shí)間長(zhǎng)，副作用強(qiáng)以及人群藥物敏感性差異等問(wèn)題。分析其原因，可能在于疾病的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜以及藥物針對(duì)的靶點(diǎn)特異性不強(qiáng)。解決此類問(wèn)題關(guān)鍵在于在揭示抑郁癥機(jī)制的基礎(chǔ)上找到確切的藥物靶點(diǎn)。

抑郁癥的發(fā)病主要是生理易感性基礎(chǔ)與外界環(huán)境的相互作用。但從基因上講，遺傳因素在抑郁癥中占到30％，大量的研究發(fā)現(xiàn)，某些基因突變、單核苷酸多態(tài)性(snp)都可增加疾病的易感性。因此，深入發(fā)掘與抑郁癥相關(guān)的易感基因，并以其為靶點(diǎn)尋找新型抗抑郁癥的藥物已經(jīng)成為一種方法。

程序性細(xì)胞死亡因子4(programmedcelldeathfactor4，pdcd4)分子是作為腫瘤抑制分子首先在小鼠中被發(fā)現(xiàn)的。已知pdcd4在小鼠和人全身多個(gè)臟器高表達(dá)，例如，脾臟，肝臟，肺和腎，而在腫瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)或是不表達(dá)。在腦組織中，pdcd4高表達(dá)，并且抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生，遷移和增殖，并且有報(bào)道pdcd4可以作為膠質(zhì)瘤的生物檢驗(yàn)標(biāo)記物，說(shuō)明pdcd4在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)pdcd4也是一種應(yīng)激蛋白，在給予紫外或是過(guò)氧化物刺激后，細(xì)胞中的pdcd4分子均會(huì)高表達(dá)，對(duì)于腦中的神經(jīng)元實(shí)施酒精暴露也會(huì)導(dǎo)致pdcd4表達(dá)水平提高，這提示pdcd4可能是一種應(yīng)激敏感蛋白。因此，可以利用在刺激中pdcd4表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化作為藥物的基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)以pdcd4為靶點(diǎn)，抑制其參與的功能，并且不影響正常生理功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人在前期研究pdcd4在腫瘤和代謝相關(guān)疾病的基礎(chǔ)上，意外發(fā)現(xiàn)pdcd4敲除或沉默表達(dá)可完全逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣和/焦慮樣癥狀，可作為抗抑郁藥的良好靶點(diǎn)。

針對(duì)抑郁癥和/焦慮癥的治療，本發(fā)現(xiàn)的目的是提供一個(gè)新的抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物治療靶點(diǎn)-pdcd4，沉默其表達(dá)或抑制其功能抵抗抑郁疾病的發(fā)生。

具體的，涉及以下技術(shù)方案：

本發(fā)明公開(kāi)了pdcd4作為靶點(diǎn)在制備抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物中的用途，所述藥物干擾或抑制pdcd4基因的表達(dá)，或者抑制和拮抗pdcd4的蛋白功能。

所述藥物是通過(guò)直接作用于pdcd4基因或其蛋白，影響pdcd4基因的表達(dá)或蛋白功能的發(fā)揮。

優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，干擾或抑制pdcd4基因的表達(dá)通過(guò)pdcd4基因敲除實(shí)現(xiàn)。

優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，干擾或抑制pdcd4基因的表達(dá)通過(guò)pdcd4基因rna干擾或基因沉默實(shí)現(xiàn)，包括但不限于使用sirna、shrna、microrna以及可產(chǎn)生出sirna、shrna的干擾質(zhì)粒等。

本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，抑制和拮抗pdcd4的蛋白功能的藥物，包括但不限于pdcd4蛋白的抗體、pdcd4蛋白的特異性拮抗劑等。例如pdcd4蛋白的特異性拮抗劑包括但不限于pdcd4蛋白的突變體蛋白或多肽、以及產(chǎn)生pdcd4蛋白的突變體蛋白或多肽的表達(dá)基因或質(zhì)粒等。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種抗抑郁癥和/或抗焦慮癥藥物，其含有有效劑量的干擾或抑制pdcd4基因表達(dá)的藥物或者抑制和拮抗pdcd4蛋白功能的藥物，和藥學(xué)上可以接受的載體。

所述的抗抑郁癥和/或抗焦慮癥藥物，其劑型可以為液體劑型或固體劑型。

所述的液體劑型可以為注射劑、溶液劑、混懸劑、乳劑或氣霧劑。

所述的固體劑型為片劑、膠囊、丸劑、粉針劑、緩釋制劑或各種微粒給藥系統(tǒng)。

針對(duì)抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物的篩選，本發(fā)現(xiàn)的目的是提供一個(gè)新的藥物篩選方式，以pdcd4作為治療靶點(diǎn)來(lái)篩選抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物。

具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：

本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物的方法，其包括pdcd4作為治療靶點(diǎn)來(lái)篩選的步驟。

pdcd4作為治療靶點(diǎn)來(lái)篩選抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物，以pdcd4基因表達(dá)水平的下降或缺失，或者pdcd4的蛋白功能的抑制或缺失，為篩選指標(biāo)。

優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，所述篩選抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物的方法，采用動(dòng)物體內(nèi)抑郁癥的模型來(lái)篩選，尤其是采用慢性長(zhǎng)期應(yīng)激(chronicresistantstress，crs)小鼠模型，檢測(cè)crs小鼠的海馬腦區(qū)的pdcd4mrna水平和/蛋白水平。

此外，本發(fā)明的目的還包括將pdcd4作為靶點(diǎn)在篩選抑郁癥和/或焦慮癥的早期預(yù)警以及臨床診斷試劑中的應(yīng)用。

所述診斷試劑用于檢驗(yàn)pdcd4基因表達(dá)水平或者pdcd4的蛋白功能水平。本發(fā)明的研究結(jié)論和有益效果如下：

1.本發(fā)明確定了pdcd4在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的腦組織區(qū)域和細(xì)胞類型：首先，利用分腦區(qū)取材方法明確pdcd4在腦中具體區(qū)域的分布，之后，通過(guò)與腦中各類型的細(xì)胞的標(biāo)記物進(jìn)行共染明確pdcd4表達(dá)的細(xì)胞類型差異；說(shuō)明，pdcd4在腦中存在并且提示可能具有一定功能。

2.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)抑郁癥小鼠海馬區(qū)pdcd4表達(dá)升高：目前公認(rèn)的動(dòng)物體內(nèi)抑郁癥的模型有三種：socialdefeat,chronicunpredictedstress(cus)和chronicresistantstress(crs)，本發(fā)明采用crs模型模擬人應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁行為，研究發(fā)現(xiàn)了進(jìn)行crs的小鼠的海馬腦區(qū)的pdcd4mrna和蛋白都有明顯升高。

3.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)人的抑郁癥患者腦組織中pdcd4也有升高情況。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，將現(xiàn)有的精神疾病患者腦組織的芯片數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)在抑郁癥和雙向情感障礙的人群中pdcd4有高表達(dá)的趨勢(shì)。

4.本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)pdcd4敲除可完全逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣和焦慮樣癥狀參與抑郁癥發(fā)生，說(shuō)明內(nèi)源性pdcd4的升高可促進(jìn)抑郁樣行為的產(chǎn)生。pdcd4全身敲除小鼠在正常情況下沒(méi)有焦慮和抑郁行為，但是，有趣的是pdcd4全身敲除小鼠進(jìn)行crs造模，通過(guò)行為學(xué)模型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠不表現(xiàn)出應(yīng)激引起的焦慮和抑郁樣行為。

5.本發(fā)明采用用小干擾sirna沉默海馬腦區(qū)表達(dá)pdcd4的表達(dá)，可完全逆轉(zhuǎn)應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠的焦慮和抑郁的行為，說(shuō)明pdcd4是抗抑郁癥很好藥物靶點(diǎn)，抑制表達(dá)或其功能可達(dá)到抗抑郁癥的作用

6.本發(fā)明研究證明在應(yīng)激發(fā)生過(guò)程中pdcd4的升高是導(dǎo)致抑郁產(chǎn)生的一個(gè)重要因素；pdcd4作為靶點(diǎn)抑制其蛋白和功能都能起到很好的抗抑郁的作用，并且對(duì)正常生理狀態(tài)沒(méi)有影響。

附圖說(shuō)明：

圖1為pdcd4在小鼠腦組織中的各個(gè)腦區(qū)的表達(dá)情況

圖2為pdcd4在腦細(xì)胞的分布類型

圖3為造crs模型的小鼠腦組織中pdcd4的表達(dá)情況，a為pcr結(jié)果，b為westernblot圖片，c為westernblot蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖4為pdcd4敲除小鼠造crs模型后抑郁樣行為學(xué)表現(xiàn)，a為懸尾試驗(yàn)結(jié)果，b為強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，c為蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5為pdcd4敲除小鼠造crs模型后焦慮樣行為學(xué)表現(xiàn)，a曠場(chǎng)試驗(yàn)小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡圖，b為曠場(chǎng)試驗(yàn)小鼠運(yùn)動(dòng)能力結(jié)果，c為曠場(chǎng)試驗(yàn)中央?yún)^(qū)探索時(shí)間結(jié)果，d為高架十字迷宮小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡圖，e為高架十字迷宮探索時(shí)間結(jié)果

圖6為海馬腦區(qū)定點(diǎn)注射包裝pdcd4sirna的慢病毒并檢測(cè)小鼠的抑郁樣行為表現(xiàn)a病毒擴(kuò)散圖，b體內(nèi)干擾效率檢測(cè)，c為懸尾試驗(yàn)結(jié)果，d為強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，e為蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖7為海馬腦區(qū)定點(diǎn)注射包裝pdcd4sirna的慢病毒并檢測(cè)小鼠的焦慮樣行為表現(xiàn)a曠場(chǎng)試驗(yàn)小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡圖，b為曠場(chǎng)試驗(yàn)小鼠運(yùn)動(dòng)能力結(jié)果，c為曠場(chǎng)試驗(yàn)中央?yún)^(qū)探索時(shí)間結(jié)果，d為高架十字迷宮小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡圖，e為高架十字迷宮探索時(shí)間結(jié)果

圖8為芯片篩選精神疾病患者腦組織中pdcd4的表達(dá)情況

圖9為pdcd4sirna在人源細(xì)胞的的干擾效果

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開(kāi)的實(shí)施方案包括：pdcd4作為靶點(diǎn)在制備抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物中的用途，所述藥物抑制pdcd4基因的表達(dá)，或者抑制和拮抗pdcd4的蛋白功能。

優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，抑制pdcd4基因的表達(dá)通過(guò)pdcd4基因敲除實(shí)現(xiàn)，人類pdcd4基因定位如染色體10q24，其表達(dá)的蛋白經(jīng)序列分析表明有469個(gè)氨基酸組成，包括n末端結(jié)構(gòu)域、c末端結(jié)構(gòu)域和2個(gè)保守的α螺旋ma-3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明所述pdcd4基因敲除包括部分或全部敲除pdcd4基因，以實(shí)現(xiàn)pdcd4基因功能缺失。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制pdcd4基因的表達(dá)通過(guò)pdcd4基因干擾或基因沉默實(shí)現(xiàn)，包括但不限于使用sirna、shrna、microrna以及可產(chǎn)生出sirna、shrna的干擾質(zhì)粒等。

例如cn102719435a公開(kāi)了抑制pdcd4基因表達(dá)的sirna，mir21抑制pdcd4基因的表達(dá)，在此在此一并引入本發(fā)明；現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的其他sirna、shrna、microrna、可產(chǎn)生出sirna、shrna的干擾質(zhì)粒，在此也一并引入本發(fā)明。

pdcd4基因表達(dá)的調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)pdcd4基因的表達(dá)，主要通過(guò)與pdcd4基因的調(diào)控區(qū)相互作用，或甲基化5’cpg島來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此，可直接pdcd4基因的調(diào)控區(qū)相互作用降低pdcd4基因表達(dá)的試劑或甲基化試劑，也屬于本發(fā)明所述抑制pdcd4基因的表達(dá)的藥物的范圍；轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控主要是通過(guò)抑制mrna翻譯或直接降解mrna來(lái)負(fù)性調(diào)節(jié)pdcd4的表達(dá)，例如mir-21。

本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，抑制和拮抗pdcd4的蛋白功能的藥物，包括但不限于pdcd4蛋白的抗體、pdcd4蛋白的特異性拮抗劑等。例如pdcd4蛋白的特異性拮抗劑包括但不限于pdcd4蛋白的突變體蛋白或多肽、以及產(chǎn)生pdcd4蛋白的突變體蛋白或多肽的表達(dá)基因或質(zhì)粒等。

本發(fā)明公開(kāi)的實(shí)施方案還包括：一種抗抑郁癥和/或抗焦慮癥藥物，其含有有效劑量的抑制pdcd4基因表達(dá)的藥物或者抑制和拮抗pdcd4蛋白功能的藥物，和藥學(xué)上可以接受的載體。

所述有效劑量，是指采用藥物后pdcd4基因表達(dá)量或者pdcd4蛋白功能，與未采用藥物的pdcd4基因表達(dá)量或者pdcd4蛋白功能，產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。

優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的抗抑郁癥和/或抗焦慮癥藥物，其劑型可以為液體劑型或固體劑型。

更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的液體劑型可以為注射劑、溶液劑、混懸劑、乳劑或氣霧劑。

更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的固體劑型為片劑、膠囊、丸劑、粉針劑、緩釋制劑或各種微粒給藥系統(tǒng)。

本發(fā)明公開(kāi)的實(shí)施方案包括：一種篩選抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物的方法，其包括pdcd4作為治療靶點(diǎn)來(lái)篩選的步驟。

pdcd4作為治療靶點(diǎn)來(lái)篩選抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物，以pdcd4基因表達(dá)水平的下降或缺失，或者pdcd4的蛋白功能的抑制或缺失，為篩選指標(biāo)。

優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，所述篩選抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物的方法，采用動(dòng)物體內(nèi)抑郁癥的模型來(lái)篩選，尤其是采用chronicresistantstress(crs)小數(shù)模型，檢測(cè)crs小鼠的海馬腦區(qū)的pdcd4mrna水平和/蛋白水平。

此外，本發(fā)明公開(kāi)的實(shí)施方案還包括將pdcd4作為靶點(diǎn)在篩選抑郁癥和/或焦慮癥的早期預(yù)警以及臨床診斷試劑中的應(yīng)用。

所述診斷試劑用于檢驗(yàn)pdcd4基因表達(dá)水平或者pdcd4的蛋白功能水平，包括但不限于常規(guī)pcr引物、熒光定量pcr引物及熒光試劑、pdcd4抗體等。

本發(fā)明所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明所使用實(shí)驗(yàn)材料，除特別說(shuō)明外，均為本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)試驗(yàn)材料。

實(shí)施例一、pdcd4在小鼠腦組織中的各個(gè)腦區(qū)的表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)6-8周齡野生型c57小鼠脫頸處死，斷頭取腦。

(2)利用腦槽分腦區(qū)取材。得到前額葉，海馬，下丘腦，紋狀體，內(nèi)嗅皮層，丘腦和小腦，放入ep管，立即凍在液氮中。

(3)用ripa研磨組織，離心收取上清，98℃煮沸，得到各腦區(qū)蛋白。

(4)westernblot利用rabbitanti-mousepdcd4抗體(cst)檢測(cè)在各個(gè)腦區(qū)中pdcd4的蛋白表達(dá)情況。

(5)通過(guò)hrp-ecl顯色曝光。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，可以發(fā)現(xiàn)pdcd4在腦中廣泛分布。

實(shí)施例二、pdcd4在腦細(xì)胞的分布類型

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)野生型c57小鼠用5％水合氯醛麻醉

(2)剪開(kāi)胸骨，暴露心臟，用生理鹽水灌注沖出血液，再用4％多聚甲醛灌注至身體僵硬。

(3)剪頭取腦，浸泡于4％的多聚甲醛，24h。

(4)將甲醛液體換成30％蔗糖/pbs溶液，沉糖3天至腦沉淀于管底。

(5)冰凍切片機(jī)切片后進(jìn)行熒光免疫組織化學(xué)染色。

(6)利用alexa488熒光素二抗(abcam)標(biāo)記pdcd4,alexa594熒光素二抗(abcam)標(biāo)記神經(jīng)元markerneun；alexa488熒光素二抗(abcam)標(biāo)記rabbitanti-mousepdcd4(novas)抗體,alexa594熒光素抗體(abcam)標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞markergfap；alexa488熒光素二抗(abcam)標(biāo)記pdcd4,alexa594熒光素二抗(abcam)小膠質(zhì)細(xì)胞markeriba1。

(7)通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察pdcd4與各類細(xì)胞marker的共標(biāo)情況，

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pdcd4在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，但很少在星形膠質(zhì)中分布。

實(shí)施例三、造crs模型的小鼠腦組織中pdcd4的表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)6-8周雄性野生型小鼠(購(gòu)于北京維通利華)分為兩組，一組每天早9:00置入小鼠束縛應(yīng)激管中2h，持續(xù)14天，成為crs組，8只；另一組沒(méi)有處理為組，8只。

(2)第14天造模后，小鼠立即實(shí)施斷頭取腦，獲得海馬腦區(qū)，凍于液氮中。

(3)一側(cè)海馬組織利用trizol提取mrna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，用pdcd4的引物(上游seqidno:1：5’-aaacaactccgtgatctttgtcca-3；下游seqidno:25’-tcaggtttaagacggcctcca-3’)和β-actin引物(上游seqidno:3：5’-caacttgatgtatgaaggctttggt-3’；下游seqidno:4：

5’-acttttattggtctcaagtcagtgtacag-3’)做rt-pcr檢測(cè)pdcd4在各組mrna的表達(dá)情況。

(4)另一側(cè)腦組織用ripa研磨，收取蛋白，利用westernblot利用rabbitanti-mousepdcd4抗體(cst)檢測(cè)在各組中的蛋白表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：pcr結(jié)果分析，以及westernblot的圖片及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)crs組相較于組，pdcd4mrna和蛋白都有升高。

實(shí)施例四、pdcd4敲除小鼠造crs模型后抑郁樣行為學(xué)表現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)獲得6-8周雄性pdcd4全身敲除小鼠(購(gòu)于jacksonlaboratory,貨號(hào)018164)以及同窩野生型小鼠，

(2)將兩組小鼠又分為和crs組，每組各8只進(jìn)行crs造模。

(3)第十四天后進(jìn)行抑郁樣行為學(xué)檢測(cè)。分別為懸尾試驗(yàn)，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)以及蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)。

(4)懸尾試驗(yàn)：將小鼠用膠布固定到高約60cm的鐵架上6分鐘，攝像頭記錄小鼠的行動(dòng)，分為不動(dòng)和掙扎，計(jì)算不動(dòng)時(shí)間占總時(shí)間的比例。

(5)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：2升量筒注滿1升水，將小鼠置于水中6分鐘，攝像頭記錄小鼠的行動(dòng)，分為不動(dòng)和掙扎，計(jì)算不動(dòng)時(shí)間占總時(shí)間的比例。

(6)蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)：小鼠單籠飼養(yǎng)，每天規(guī)定時(shí)間給予兩瓶1％蔗糖水飲用(或者不限時(shí)間，給予兩瓶1％蔗糖水飲用)，連續(xù)3-5天。測(cè)試期：2天，在固定時(shí)間給予小鼠一瓶水與一瓶1％蔗糖水飲用，24h后水瓶位置互換，計(jì)算蔗糖水的飲用量或者蔗糖水飲用率(蔗糖水/蔗糖水+自來(lái)水)。如果適應(yīng)期是全天給予自來(lái)水飲用，則測(cè)試期飲水量也是稱量全天的飲用量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：行為檢測(cè)結(jié)果分析，見(jiàn)圖4，a-b懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳檢測(cè)小鼠行為絕望，不動(dòng)時(shí)間與行為絕望程度成正比，不難發(fā)現(xiàn)野生型小鼠進(jìn)行crs造模后表現(xiàn)出明顯的不動(dòng)比例增強(qiáng)現(xiàn)象，但是在pdcd4敲除小鼠進(jìn)行crs造模并沒(méi)有提高小鼠不動(dòng)時(shí)間。c蔗糖水偏好檢測(cè)小鼠快感缺乏，喝糖水占總飲水的比例越低，表明小鼠失去快感。統(tǒng)計(jì)該指數(shù)發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠進(jìn)行crs造模后表現(xiàn)出明顯的糖水偏好性降低，但是在pdcd4敲除小鼠進(jìn)行crs造模并沒(méi)有野生型小鼠表達(dá)的快感缺乏現(xiàn)象。結(jié)果顯示，在野生型小鼠中，crs可以導(dǎo)致抑郁樣行為，pdcd4敲除不影響小鼠的抑郁樣情緒，對(duì)全身敲除進(jìn)行crs造模后，表現(xiàn)出抗抑郁樣行為。

實(shí)施例五、pdcd4敲除小鼠造crs模型后焦慮樣行為學(xué)表現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)獲得6-8周雄性pdcd4全身敲除小鼠(購(gòu)于jacksonlaboratory,貨號(hào)018164)以及同窩野生型小鼠，將兩組小鼠又分為和crs組，每組各8只進(jìn)行crs造模,進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)，高架十字迷宮檢測(cè)焦慮樣行為

(2)曠場(chǎng)試驗(yàn)：將小鼠置于60cm×60cm的曠場(chǎng)中，攝像頭記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)情況。曠場(chǎng)中間的20cm×20cm區(qū)域定義為中央?yún)^(qū)，軟件獲取小鼠行動(dòng)路線，分析運(yùn)動(dòng)總距離和在中央?yún)^(qū)所待的時(shí)間比例。

(3)高架十字迷宮：高架十字迷宮由一對(duì)開(kāi)臂和一對(duì)閉臂組成。將小鼠放入高架十字迷宮，軟件分析小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，分別計(jì)算小鼠在開(kāi)臂和閉臂中的時(shí)間和進(jìn)入開(kāi)臂和閉臂的次數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：小鼠行為學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖5，a-c利用曠場(chǎng)檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)能力和焦慮情緒，b圖顯示野生型小鼠和pdcd4小鼠運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有變化，但是，c圖發(fā)現(xiàn)野生型小鼠進(jìn)行crs造模后在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)探索時(shí)間降低，而在pdcd4敲除小鼠crs造模后并沒(méi)有表現(xiàn)出該現(xiàn)象。結(jié)果顯示在野生型小鼠進(jìn)行crs可以導(dǎo)致焦慮樣行為，pdcd4敲除不影響小鼠的焦慮情緒，并且pdcd4全身敲除進(jìn)行crs造模后，表現(xiàn)出抗焦慮樣行為。

實(shí)施例六、海馬腦區(qū)定點(diǎn)注射包裝pdcd4sirna的慢病毒并檢測(cè)小鼠的抑郁樣行為表現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)包裝sipdcd4和gfp慢病毒(委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成包裝獲得)，滴度7×10⁷。

(2)水合氯醛麻醉野生型c57小鼠，將小鼠固定在腦立體定位儀上，暴露顱骨，坐標(biāo)：前囟后-2.03，左右+2.4，鉆洞，微量注射器吸液(1.5μl每側(cè))，垂直固定在定位儀上，下針深1.87，以0.1μl/分鐘注射到小鼠的海馬腦區(qū)。

(3)術(shù)后小鼠恢復(fù)7天后，對(duì)小鼠進(jìn)行crs造模。

(4)造模14天后檢測(cè)抑郁樣行為，分別為懸尾試驗(yàn)，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)以及蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法如同實(shí)施例四。

(5)行為檢測(cè)結(jié)果分析，見(jiàn)圖6，c-d懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳檢測(cè)小鼠行為絕望，不動(dòng)時(shí)間與行為絕望程度成正比，不難發(fā)現(xiàn)注射慢病毒gfp小鼠進(jìn)行crs造模后表現(xiàn)出明顯的不動(dòng)比例增強(qiáng)現(xiàn)象，但是在注射慢病毒sipdcd4小鼠進(jìn)行crs造模并沒(méi)有提高小鼠不動(dòng)時(shí)間。e蔗糖水偏好檢測(cè)小鼠快感缺乏，喝糖水占總飲水的比例越低，表明小鼠失去快感。統(tǒng)計(jì)該指數(shù)發(fā)現(xiàn)，注射慢病毒gfp小鼠進(jìn)行crs造模后表現(xiàn)出明顯的糖水偏好性降低，但是在注射慢病毒sipdcd4小鼠進(jìn)行crs造模并沒(méi)有野生型小鼠表達(dá)的快感缺乏現(xiàn)象。結(jié)果顯示，注射gfp病毒的小鼠，crs可以導(dǎo)致抑郁樣行為，sipdcd4注射不影響小鼠的抑郁樣情緒，但是sipdcd4注射的小鼠進(jìn)行crs造模后，表現(xiàn)出抗抑郁樣行為。

(6)免疫熒光組織化學(xué)反映病毒擴(kuò)散情況和westernblot反映體內(nèi)干擾pdcd4的效果，見(jiàn)圖6a和b。

實(shí)施例七、海馬腦區(qū)定點(diǎn)注射包裝pdcd4sirna的慢病毒并檢測(cè)小鼠的焦慮樣行為表現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)對(duì)注射gfp病毒和sipdcd4病毒的小鼠進(jìn)行焦慮樣行為檢測(cè)，曠場(chǎng)試驗(yàn)，高架十字迷宮檢測(cè)焦慮樣行為，實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例五。

(2)行為檢測(cè)結(jié)果分析，見(jiàn)圖7，a-c利用曠場(chǎng)檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)能力和焦慮情緒，b圖顯示注射gfp和sipdcd4小鼠運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有變化，但是，c圖發(fā)現(xiàn)gfp小鼠進(jìn)行crs造模后在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)探索時(shí)間降低，而在注射sipdcd4小鼠crs造模后并沒(méi)有表現(xiàn)出該現(xiàn)象。結(jié)果顯示，注射gfp病毒的小鼠crs可以導(dǎo)致焦慮樣行為，sipdcd4注射不影響小鼠的焦慮情緒，而且sipdcd4注射的小鼠進(jìn)行crs造模后，表現(xiàn)出抗焦慮行為。

實(shí)施例八、芯片篩選精神疾病患者腦組織中pdcd4的表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)從公共geo網(wǎng)站上搜得已有研究人員針對(duì)精神疾病人群腦組織進(jìn)行的rna芯片結(jié)果(數(shù)據(jù)庫(kù)文件號(hào)：gds3345/39510_r_at)。

(2)利用芯片呈現(xiàn)的表達(dá)絕對(duì)值，通過(guò)spss軟件統(tǒng)計(jì)one-wayanova分析pdcd4在精神疾病中的mrna表達(dá)情況。

(3)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，見(jiàn)圖8，pdcd4在抑郁癥和雙向精神障礙的患者腦中都有高表達(dá)趨勢(shì)，但是在精神分裂的人群中并沒(méi)有變化。

實(shí)施例九、pdcd4sirna在人源細(xì)胞的的干擾效果

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)設(shè)計(jì)pdcd4的人源sirna(序列seqidno:5:gagauggaauuuuauguaatt)，上海吉瑪公司合成sirna粉末。

(2)hek293細(xì)胞高表達(dá)pdcd4，以5×10⁵的密度種于六孔板中。

(3)24小時(shí)后，1μlsirna或negativecontrol(上海吉瑪公司合成，序列：uucuccgaacgugucacgutt)與2μllipo2000混合加入細(xì)胞中，4-6小時(shí)后換成細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24后，ripa收取細(xì)胞蛋白。

(4)通過(guò)westernblot的方式檢測(cè)pdcd4的表達(dá)情況

(5)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，見(jiàn)圖9，sipdcd4組與nc比，pdcd4的量降低很多。

sequencelisting

<110>山東大學(xué)

<120>pdcd4作為抗抑郁癥和/抗焦慮癥藥物治療靶點(diǎn)的應(yīng)用

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