技術領域：

本發(fā)明提供一種預測和診療急性心肌梗死的標記物，進一步講是提供了nfyb基因作為標記物表達產(chǎn)物和生物制劑在制備急性心肌梗死預測和診療藥物中用途，屬于基因診斷和生物醫(yī)藥領域。

背景技術：
：

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟ad）是由環(huán)境因素與遺傳因素共同作用而導致的最常見心血管疾病，是一種多基因相互作用的復雜疾病，其發(fā)生與發(fā)展是在環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的基礎之上，多重危險因素作用的結果。已知的危險因素，如高血壓、血脂異常、血糖升高、吸煙等長期積累，結合遺傳背景最終將導致急性心血管事件（如，急性心肌梗死，ami）的發(fā)生，常常危及患者生命。因此，臨床上需要有效的風險預測方法，對高危人群給予有效識別，從而更早的干預，來降低急性心血管事件的發(fā)生，改善病人預后。

基因組中編碼的遺傳信息是穩(wěn)定的，大多數(shù)情況下是不可變的。然而研究表明，大約有25000個基因在rna水平的表達是高度可變的，可以反應機體短期內(nèi)的生理和病例變化。近年來隨著基因芯片技術的發(fā)展，基因表達分析已經(jīng)廣泛應用于疾病的研究。在其他醫(yī)學領域的研究已經(jīng)表明，外周全血或外周血單核細胞的基因表達對疾病具有顯著的預測價值，外周全血或外周單個核細胞基因表達的改變已被證實對cad有顯著的預測價值。基因表達分析可以為疾病近期風險預測提供新的生物標志物。

由nfyb基因編碼的nfyb亞基是nfy的重要組成部分，在nfy的調控中起到必不可少的作用。既往研究表明，由nfy調控表達的基因廣泛參與了甘油三酯、脂肪酸、酮體代謝和膽固醇合成等重要的脂類代謝相關通路，在現(xiàn)有研究中未見對nfyb與心肌梗死的相關報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供nfyb基因作為急性心肌梗死風險預測標記物中的用途，所述急性心肌梗死風險預測和診斷制劑檢測nfyb基因和或基因的表達產(chǎn)物。進一步的，所述的nfyb基因和或基因的表達產(chǎn)物在急性心肌梗死外周血中低表達。進一步的，所述的nfyb基因和或基因的表達產(chǎn)物的表達水平熒光定量檢測方法。

本發(fā)明的目的在于所述急性心肌梗死風險預測和診斷制劑檢測nfyb基因和或基因的表達產(chǎn)物進一步的，采用熒光定量試劑盒、基因芯片、酶聯(lián)免疫、抗體雜交方法外周血中基因的表達檢測方法和相關的生物制劑。

本發(fā)明的目的在于所述急性心肌梗死風險預測和診斷制劑檢測nfyb基因和或基因的表達產(chǎn)物進一步的，包含本nfyb基因和或表達產(chǎn)物用于急性心肌梗死風險預測和診斷的生物制劑。

本發(fā)明中熒光定量pcr檢測中使用的引物對p，其序列如下：

上游引物序列：5’atgacaatggatggtgacagttc3’

下游引物序列：5’ctagccacgtttgctattgga3’。

本發(fā)明中熒光定量pcr檢測體系及反應條件：

熒光定量pcr反應體系：20ul反應體系，每個反應包括:10ulsybrpremixextaqtm，上、下游引物各0.5ul(濃度為10umol/l)，無核酸酶的雙蒸水8ul，cdna模板1ul。權利要求3中所述的熒光定量pcr反應條件：應用實時熒光定量pcr系統(tǒng)擴增。反應條件為95℃預變性10分鐘；40個循環(huán)：95℃變性15秒,60℃退火20秒,72℃20延伸秒；溶解曲線和擴增曲線95℃1分鐘，55℃30秒,95℃30秒。以gapdh基因為內(nèi)參基因，所有樣本至少重復測量三次，結果取均值。

本發(fā)明進行的外周血急性心肌梗死差異基因表達譜分析結果顯示：在急性心肌梗死病人的外周血白細胞中存在著大量差異表達的基因。其中，nfyb基因在急性心肌梗死病人外周血中呈現(xiàn)顯著低表達。發(fā)明人在前期研究成果的基礎之上，通過擴大樣本量，來進一步驗證nfyb基因在急性心肌梗死發(fā)病過程中的差異表達，并分析nfyb基因促進急性心肌梗死發(fā)病的可能機制。

本發(fā)明的積極效果在于：

提供了以nfyb基因和或基因的表達產(chǎn)物一種新的急性心肌梗死風險預測和診斷治療靶點，利用nfyb基因及其表達產(chǎn)物制備急性心肌梗死風險預測標記物和診斷制劑，具有重要的臨床應用意義和開發(fā)價值。

附圖說明

圖1是nfyb基因熒光定量pcr的特異性引物的溶解曲線和nfyb基因熒光定量pcr擴增曲線；a是熒光定量特異性引物的溶解曲線，b是熒光定量pcr擴增曲線；

圖2實施例2中nfyb基因rt-pcr擴增目的片段電泳圖，其中，泳道1，2是rt-pcr產(chǎn)物，泳道3是dl500dnaladdermarker；

圖3是nfyb基因mrna相對表達量；其中^**代表p<0.01。

具體實施方式

結合實例具體實例，進一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本領域的普通技術人員可以理解，在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型。

本發(fā)明主要采用熒光定量pcr篩選出急性心肌梗死相關基因，結合分子生物學實驗和臨床病例關聯(lián)分析，證實了是急性心肌梗死診治標志物。

病例的收集

選取2014年11月-2016年7月于吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療，根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的缺血性心臟病命名和診斷標準，明確診斷為冠心病的病人85例為冠心病組。并同時符合：冠狀動脈造影術證實冠狀動脈主要血管（左主干、前降支、回旋支和右冠狀動脈）及其主要分支中至少一支狹窄大于或等于50%。根據(jù)冠狀動脈造影結果，按照gensini評分系統(tǒng)對冠狀動脈血管病變嚴重程度進行評分，分值越高病變約嚴重。對照為經(jīng)冠狀動脈造影術證實冠狀動脈主要血管（左主干、前降支、回旋支和右冠狀動脈）及其主要分支均無明顯狹窄的非冠心病者84例（非冠心病組）。

本發(fā)明醫(yī)療效果的排除標準：

1.非心肌缺血相關的心肌損傷：心臟挫傷、手術、消融、起搏、或除顫儀除顫、伴心臟受累的橫紋肌溶解癥、心肌炎、心臟毒性藥物等。

2.多因素或不確定的心肌損傷：嚴重心力衰竭、應激性心肌病、嚴重肺栓塞或肺動脈高壓、敗血癥和危重病人、腎功能衰竭、嚴重的急性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如卒中、蛛網(wǎng)膜下腔出血、浸潤疾病，如淀粉樣變、結節(jié)病、劇烈運動等。

3.合并有嚴重感染性疾病、惡性腫瘤。

4.正在患有的、慢性的或復發(fā)性的傳染性疾病史。

5.（活動性或潛伏性）結核感染史或證據(jù)。

6.患有免疫系統(tǒng)疾病和（或）正在服用激素。懷疑或證實處于免疫缺陷狀態(tài)的患者

7.臨床資料或者冠脈造影資料不全者。

詳細記錄臨床資料，包括：用藥史、血脂水平、空腹血糖水平、坐位血壓水平、體質指數(shù)（bmi）、冠狀動脈造影資料、冠心病家族史、吸煙史，以及合并其它臨床疾病情況（如高血壓、糖尿?。┑取?/p>

二、急性心肌梗死患者組及對照組外周血中nfyb基因表達情況：

外周血采集、總rna提取及cdna合成

留取各研究對象晨起空腹外周靜脈血4ml，利用血液總rna提取試劑盒（rnasimpletotalrnakit，天根生化科技有限公司，北京），依據(jù)試劑盒說明書對已獲取的外周血進行總rna提取，并利用1.5%瓊脂糖電泳及紫外分光光度計（nanodrop2000）對rna的質量及濃度進行檢測。合格的rna樣本a260/a280值在1.9和2.1之間，且a260/a230值大于2。瓊脂糖凝膠電泳可見明亮的28s和18srrna條帶，且28srrna條帶亮度約為18srrna的兩倍。采用反轉錄試劑盒（toyoborevertraaceqprcrtkit，上海），取總量為1ug合格的總rna進行反轉錄，得到cdna樣品保存于-20℃以便下一步進行實時熒光定量pcr。

實時熒光定量pcr檢測

利用sybr熒光定量試劑盒(sybrpremixextaqtm，takara,大連)進行pcr擴增。采用20ul反應體系，每個反應包括:10ulsybrpremixextaqtm，上、下游引物各0.5ul(濃度為10umol/l)，無核酸酶的雙蒸水8ul，cdna模板1ul。應用mx3005p實時熒光定量pcr系統(tǒng)（stratagene）擴增。反應條件為95℃10分鐘；40個循環(huán)：95℃15秒,60℃20秒,72℃20秒；95℃1分鐘，55℃30秒,95℃30秒。以gapdh基因為內(nèi)參基因，所有樣本至少重復測量三次，結果取均值。每個樣本所得循環(huán)閾值（ct）以相對表達量2-△ct表示（△ct=目的基因ct-內(nèi)參基因ct），并進行比較。急性心肌梗死組對于對照組的相對表達量以2-^△△ct法進行統(tǒng)計分析，△△ct=急性心肌梗死組△ct-對照組△ct。所用pcr引物根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫提供的nfyb基因序列進行設計，并由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1，擴增片段長度為153bp。收集實時熒光定量pcr產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。rt-pcr引物序列如下：

nfyb

上游引物5’-atgacaatggatggtgacagttc-3’

下游引物5’-ctagccacgtttgctattgga-3’

gapdh

上游引物5’-acggatttggtcgtattgggcg-3’

下游引物5’-ctcctggaagatggtgatgg-3’

三、nfyb基因相對表達量與急性心肌梗死患者血脂，血糖等性狀的相關性分析

統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)使用spss22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料服從正態(tài)分布的采用±s進行統(tǒng)計描述，組間差異比較采用獨立t檢驗分析，不服從正態(tài)分布的采用四分位數(shù)間距進行統(tǒng)計描述，組間差異比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料采用頻數(shù)進行統(tǒng)計描述，組間差異采用檢驗分析；冠心病相關危險因素采用二元logistic回歸分析；nfyb基因相對表達量與冠狀動脈狹窄病變嚴重程度相關性采用雙變量相關分析。結果以雙側p<0.05認為有統(tǒng)計學差異。

倫理聲明

本研究涉及醫(yī)學倫理學范疇的內(nèi)容由吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會批準。所有受試者的樣本及信息采集均通過受試者同意，并簽署知情同意書。

實驗結果

1臨床資料分析

研究對象的臨床資料分析結果表明：在年齡、性別、bmi、高血壓病史、冠心病家族史、吸煙史、收縮壓、舒張壓等方面，兩組未見明顯統(tǒng)計學差異。而兩組在血糖和血脂等指標上差別顯著。與非冠心病組相比冠心病組合并糖尿病情況及空腹血糖（fbg）水平明顯高于非冠心病組；血總膽固醇水平（tc）、甘油三酯水平（tg）和低密度脂蛋白膽固醇水平（ldl-c）明顯高于非冠心病組；相反，高密度脂蛋白膽固醇水平（hdl-c）明顯低于非冠心病組，差別均有統(tǒng)計學意義。詳見表1。

2外周血實時熒光定量pcr擴增產(chǎn)物鑒定

實時熒光定量pcr檢測結果顯示，nfyb基因擴增曲線為顯著平滑的“s型”，溶解曲線呈現(xiàn)單一的溶解峰，表明擴增產(chǎn)物特異性較高，結果如圖1。收集擴增產(chǎn)物，取8ul用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。結果如圖2。電泳結果顯示，pcr擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)單一明亮條帶，片段大小約197bp，與預期片段大小相一致。說明pcr擴增反應成功，產(chǎn)物特異性較好。

3nfyb基因mrna在冠心病組和非冠心病組的表達量

rt-pcr所得每個樣本的δct值均為單個樣品重復3次測量所得均值。nfyb基因的相對表達量統(tǒng)計采用2^-δδct方法。結果顯示，冠心病組2^-△ct為0.04（0.03-0.07），非冠心病組2^-△ct為0.05（0.03-0.16），兩組差別有顯著統(tǒng)計學差異（z=-2.3，p=0.02）。在mrna水平冠心病組外周血中nfyb基因表達明顯低于非冠心病組，其相對表達量為非冠心病組的0.40±0.34倍，見圖3。

4采用logistic回歸分析nfyb基因相對表達量及其它因素與冠心病的關系

為進一步分析nfyb基因表達量降低是否為冠心病的危險因素，采用逐步logistic回歸分析nfyb基因的相對表達量、年齡、性別、bmi、冠心病家族史、吸煙史、高血壓、糖尿病、空腹血糖及血脂等因素與冠心病的相關性。結果顯示nfyb基因的低表達以及血甘油三酯水平升高是冠心病的獨立危險因素，詳見表2。

5nfyb基因相對表達量與空腹血糖及血脂等指標的關系

將所有納入的研究對象分別按空腹血糖水平和血脂水平分為：空腹血糖正常組和空腹血糖升高組、tc正常組和tc升高組、tg正常組和tg升高組、ldl-c正常組和ldl-c升高組、hdl-c正常組和hdl-c降低組。分別比較組間nfyb基因的表達量。每個研究對象nfyb基因的相對表達量以2^-△ct表示。結果顯示：nfyb基因表達量在血糖正常組與血糖升高組之間、tc正常組和tc升高組之間、ldl-c正常組與ldl-c升高組之間、hdl-c正常組和hdl-c降低組之間差別均無統(tǒng)計學意義；而在tg正常組與tg升高組之間有顯著差別。詳見表3。

6nfyb基因相對表達量與冠狀動脈病變嚴重程度的相關性

根據(jù)冠狀動脈造影結果，按照gensini評分系統(tǒng)對冠心病組研究對象的冠狀動脈病變嚴重程度進行評估。冠心病組gensini評分結果為33.50（20.00-60.00），分值越高代表冠狀動脈狹窄越重。對nfyb基因相對表達量和gensini分值進行雙變量相關分析，結果顯示：nfyb基因的相對表達量與gensini分值呈顯著負相關（rs=-0.61，p=0.00）。表明外周血中nfyb基因的表達量越低，冠狀動脈粥樣硬化病變可能越嚴重。

總結：nfyb基因在冠心病病人外周血中表達顯著降低；nfyb基因可能通過調控脂類代謝相關基因的轉錄進而促進冠心病的發(fā)生；nfyb基因表達量降低是冠心病的獨立危險因素；外周血中nfyb基因的低表達將可能作為冠心病風險評估的生物標志物，并對冠狀動脈病變嚴重程度的評估具有一定的參考價值。

表1為冠心病組與非冠心病組臨床資料比較[(±s)/n(%)]；

表2為冠心病獨立危險因素logistic回歸分析結果；

表3為不同組別間chd9基因相對表達量比較；

sequencelisting

<110>吉林大學

<120>nfyb基因作為急性心肌梗死風險預測標記物中的用途

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>197

<212>mrna

<213>人（homo）

<400>1

atgacaatggatggtgacagttctacaacagatgcttctcaactaggaatctctgcagac60

tatattggaggaagtcattatgttatacagcctcatgatgatactgaggacagcatgaat120

gatcatgaagacacaaatggttcaaaagaaagtttcagagaacaagatatatatcttcca180

atagcaaacgtggctag197

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atgacaatggatggtgacagttc23

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctagccacgtttgctattgga21

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

acggatttggtcgtattgggcg22

<210>5

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<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctcctggaagatggtgatgg20