一、技術領域

本發(fā)明涉及串聯(lián)表達禽流感病毒ha抗原片段和pb1-f2蛋白的重組枯草芽孢桿菌，屬于生物技術基因工程領域。具體包括：禽流感病毒ha-pb1-f2蛋白整合表達性質粒pinhapb1的構建，禽流感病毒ha-pb1-f2蛋白的表達與鑒定以及重組枯草芽孢桿菌可以刺激雞骨髓源樹突狀細胞mhc11的表達發(fā)生顯著變化，誘導樹突狀細胞的成熟；也可以刺激spf雛雞機體產生有效的ha-pb1-f2特異性免疫應答水平。

二、

背景技術：

1口服黏膜免疫研究進展

目前，在我國控制禽流感最實際有效的方法是使用全病毒滅活疫苗。原因是具有良好的安全性，抗原成分齊全和免疫原性強等特點。但是，傳統(tǒng)的疫苗接種(肌肉或皮下注射)具有以下缺點：①動物和人類的病毒需要在動物細胞中培養(yǎng)，這使得疫苗生產的成本非常高；②疫苗中的病原體可能在疫苗生產過程中沒有完全被殺死或完全減毒，從而導致疾病更大范圍的擴散；③減毒菌株可能發(fā)生突變；④有些疾病使用傳統(tǒng)疫苗控制效果不佳(如艾滋病)；⑤導致家禽的應激反應從而影響動物的生長；⑥傳統(tǒng)疫苗如果多次接種，會造成體內疫苗殘留導致肉類產品質量下降，間接影響食品安全和公共衛(wèi)生；⑦禽流感感染主要通過呼吸道和胃腸道途徑，通過肌肉注射動物的滅活油乳劑疫苗，不能刺激呼吸道和消化道局部粘膜免疫。

新興的粘膜免疫，具有簡單，安全，方便等許多優(yōu)點，引起國內外免疫學專家的關注，現(xiàn)已成為免疫學研究的熱點之一。一方面，粘膜免疫方法簡單安全，不僅在粘膜局部和其他粘膜組織產生免疫反應，而且還能引起全身性體液免疫反應；另一方面，有顯著的免疫效果，疫苗在口服免疫后通過上呼吸道粘膜相關淋巴組織不僅有效地誘導局部免疫反應，而且激活淋巴細胞歸巢到其他粘膜部位，誘導廣泛的粘膜免疫應答，防御病原微生物入侵，因此通過口服粘膜免疫能夠獲得好的效果。例如，口服脊髓灰質炎疫苗的應用，使得脊髓灰質炎的全球發(fā)病率得到了有效控制，為口服疫苗的開發(fā)和應用起到了引導作用。然而，在實踐中，口服粘膜免疫也存在不足，由于疫苗僅作用在粘膜表面，很少能有效地進入動物體，同時也受到膜表面粘液和其他等因素的影響，特別是在經過消化道粘膜時，疫苗很容易被破壞，影響免疫效果，這使得消化道粘膜免疫的使用和推廣得到了限制。近年來，疫苗遞送已成為傳染病防御領域的熱點之一。特別是細菌活載體疫苗因培養(yǎng)方便，外源基因容量大，能刺激細胞免疫力的優(yōu)勢具有較大潛力。因此，理想的疫苗抗原載體的選擇是建立新的生物技術的關鍵。理想的抗原遞送載體應該能夠在體內長時間存在，本身是安全的并且可以產生持續(xù)免疫力。

2枯草芽孢桿菌對口服黏膜免疫的影響

近年來，疫苗遞送系統(tǒng)已成為預防傳染病領域的熱點之一。特別是細菌活載體疫苗因其培養(yǎng)方便，外源基因容量大，刺激細胞免疫等優(yōu)點具有巨大的潛力。細菌活載體疫苗是新興的粘膜免疫疫苗的重要發(fā)展方向。通過使用細菌活載體疫苗，不僅能刺激腸道免疫反應，而且能夠針對特異性抗原產生特異性免疫反應，使機體得到全面保護。目前，研究比較廣泛的活菌載體有沙門氏菌、乳桿菌、李斯特菌等?？莶菅挎邨U菌是一種安全和非致病的活細菌載體，廣泛存在于土壤和植物中，許多研究表明，枯草芽孢桿菌不僅可以誘導腸粘膜免疫應答，也對動物和人的病原體有拮抗作用。作為抗原載體的枯草芽孢桿菌具有許多優(yōu)點：①是一種安全非致病的益生菌；②有良好的安全性，抗逆性強(適合保存和運輸)；③生產方便(發(fā)酵條件簡單，產品易于分離和純化)；④遺傳操作系統(tǒng)成熟。因此，枯草芽孢桿菌非常適合用于安全口服疫苗和其它病原體的抗原遞送載體。同時，作為抗原遞送載體的枯草芽孢桿菌可以誘導粘膜免疫應答和全身免疫應答，這都使得應用枯草芽孢桿菌作為抗原遞送載體具有廣闊的前景。

3枯草芽孢桿菌對樹突狀細胞的影響

使用益生菌——枯草芽孢桿菌做為活細菌載體具有一箭雙雕的作用?？莶菅挎邨U菌不僅能誘導腸道粘膜免疫反應，還能夠對病原菌產生拮抗。雞的呼吸道和消化道黏膜下廣泛分布有天然免疫細胞-樹突狀細胞，時刻監(jiān)視病原微生物的入侵。當遇到入侵的病原體時，dcs則伸出許多樹突狀或偽足樣突起通過上皮細胞之間的連接攝取外界抗原，對抗原進行加工處理后遷移到附近的淋巴結呈遞給淋巴細胞，誘導免疫反應?？莶菅挎邨U菌是與雞dcs的表面受體tlr2和tlr4結合，通過誘導dcs的成熟提高機體局部免疫力。并且枯草芽孢桿菌在腸道內能夠具有完整的生活周期，枯草芽孢桿菌在極端條件下能自動生成芽孢形式存在，一旦外界條件適合生長就會從芽孢狀態(tài)大量繁殖。因此使枯草芽孢桿菌表面展示高致病性ha蛋白和pb1-f2蛋白作為雞腸道基因工程菌具有非常廣闊的應用前景。近年來，枯草芽孢桿菌在表達酶和抗原方面取得了很多進展。馬海等應用枯草芽孢桿菌成功串聯(lián)表達o型口蹄疫病毒的復合表位與霍亂毒素b單位；牟春曉等應用枯草芽孢桿菌成功表達豬傳染性胃腸炎病毒s蛋白；hinc等應用枯草芽孢桿菌成功表達幽門螺桿菌urea蛋白。

4h5n1結構蛋白ha蛋白和pb1-f2蛋白

流感病毒對世界各地人類和動物的健康構成極大地威脅，是a型流感病毒。近年來，禽流感的爆發(fā)范圍非常廣泛，并且高頻爆發(fā)，每次爆發(fā)都造成大量家禽染病死亡或者遭到捕殺，對中國和世界的家禽業(yè)造成巨大的經濟損失。禽流感病毒可以編碼多達16種蛋白質，感染多種宿主，包括人，鳥，馬，狗，豬等。我國是養(yǎng)殖業(yè)大國也是人口大國，因此有效快速找到預防禽流感的方法迫在眉睫。預防禽流感病毒需要具有針對流感病毒的特異性抗體，表面血凝素蛋白ha蛋白在病毒吸附，與細胞融合，侵襲粘膜上皮細胞過程中起決定性作用，也是中和抗體的主要靶標。病毒通過ha糖蛋白將唾液酸錨定到宿主細胞的表面受體，然后通過細胞網格蛋白或小窩蛋白介導的細胞內吞作用進入細胞。近年來，禽流感病毒ha基因已被用于制備禽流感dna疫苗和禽流感病毒ha基因重組禽痘疫苗，并獲得好的免疫效果。隨著益生菌作為抗原遞送的載體，能有效刺激粘膜免疫這一技術的提升，本發(fā)明使用枯草芽孢桿菌表達ha蛋白對抵抗禽流感病毒有重要的意義。

pb1-f2蛋白是流感病毒表達的第11個蛋白，能夠影響流感病毒的毒性，是病毒毒力的一個重要因素，h5n1亞型的高致病性禽流感病毒蛋白之一。pb1-f2基因是流感病毒第2片段編碼，由87-90個氨基酸殘基組成，是流感病毒的pb1基因序列的可替代開放閱讀框編碼的非結構輔助蛋白。許多研究表明pb1-f2可引起許多不同的效應，例如上調病毒聚合酶活性；增強炎癥；通過與線粒體抗病毒信號蛋白mavs相互作用來抑制ifn途徑的誘導；促進繼發(fā)性細菌感染。pb1-f2蛋白誘導細胞凋亡機制主要與pb1-f2的線粒體定位有關。pb1-f2的線粒體定位通過線粒體靶向序列實現(xiàn)，該序列c末端的富含短的α-螺旋精氨酸的序列。來自bcl-2家族細胞前體蛋白bax/bak的活化是與線粒體外膜相互作用，刺激vdac1開放并誘導細胞凋亡；另一種誘導細胞凋亡機制是pb1-f2蛋白本身并沒有細胞毒性當其形成β-折疊二級結構(淀粉樣蛋白纖維和β-淀粉樣蛋白孔結構)時導致線粒體細胞膜損傷，產生高細胞毒性，下調宿主免疫力，最終導致死亡。最近報道pb1-f2通過tom40通道轉移到線粒體內膜中，在細胞器內積累，并能損害細胞先天免疫，并發(fā)現(xiàn)pb1-f2蛋白在誘導樹突狀細胞成熟中也起著最關鍵的作用。增強樹突狀細胞活性是提高粘膜免疫的關鍵。因此使用枯草芽孢桿菌表達pb1-f2蛋白對抵抗禽流感的入侵有重要意義。

三、

技術實現(xiàn)要素：

技術問題

本發(fā)明成功構建了禽流感病毒ha-pb1-f2蛋白重組枯草芽孢桿菌整合表達質粒pinhapb1-f2，并成功化學轉化和電擊轉化入枯草芽孢桿菌wb600。ha蛋白和pb1-f2蛋白在重組枯草芽孢桿菌wb600表面被成功表達，并通過口服免疫可以刺激一日齡spf雛雞產生有效特異性免疫應答水平。因此，重組枯草芽孢桿菌有望成功開發(fā)成預防家禽禽流感的基因工程口服疫苗。

技術方案

本發(fā)明涉及串聯(lián)表達禽流感病毒ha抗原片段和pb1-f2蛋白的重組枯草芽孢桿菌，重組枯草芽孢桿菌wb600，屬于枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。檢測口服免疫重組枯草芽孢桿菌wb600菌株，機體能產生有效的禽流感特異性免疫應答水平。

1其整合表達載體質粒構建方法包括：

1.1高致病性禽流感h5n1病毒血凝素(ha)基因的克?。?/p>

以含有血凝素的質粒pc1-h5ha(哈爾濱獸醫(yī)研究所陳化蘭惠贈，ncbi編號是af144305)為模板，設計引物進行pcr擴增。在上游引物引入與gfp末端16bp的同源臂序列；在下游引物引入與pb1-f2末端16bp的同源臂序列。引物序列如下：

p1：ggcatggatgaactatacaaataccatgcaaacaactcg

p2：cacttccacctccaccgcaaattctgcattgtaac

pcr反應體系為50μl，pcr反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃1min30sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；pcr產物電泳鑒定回收后獲得禽流感h5n1病毒血凝素(ha)基因序列seqidno.1。

1.2高致病性禽流感h5n1病毒pb1-f2基因的合成：

參照已發(fā)表的h5n1的pb1-f2蛋白基因序列(genbank登陸號：gu596982)，設計一對擴增pb1-f2蛋白基因cdna的引物，在上游引物引入與ha3’末端16bp的同源臂序列，在下游引物引入與枯草芽孢桿菌cotg5’末端16bp的同源臂序列。

引物序列如下：

p3：gtggaggtggaagtaggaggatggaacaggaacagg

p4：ggtaccaagcttttaggatcctccagtttatccactcttg

參照已發(fā)表的h5n1的pb1-f2蛋白基因序列(genbank登陸號：gu596982)，將pb1-f2序列送去南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以p3、p4為引物合成的pb1-f2為模板進行pcr擴增增強腸道dc活性的pb1-f2蛋白。pcr反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；pcr產物電泳鑒定回收后獲得低致病性禽流感h5n1病毒pb1-f2基因序列seqidno.2。

1.3融合ha和pb1-f2片段

用重疊pcr將擴增的ha與pb1-f2使用p1，p4引物以seqidno.1和seqidno.2為模板進行pcr擴增獲得目的片段ha-pb1-f2。pcr反應反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；pcr產物電泳鑒定回收獲得ha-pb1-f2基因序列seqidno.3。

1.4綠色熒光蛋白基因gfp的克隆

參照已發(fā)表的綠色熒光蛋白基因序列(genbank登陸號：ku312311.1)設計一對擴增綠色熒光蛋白基因gfp的引物，在上游引物引入與載體基因3’末端16bp的同源臂序列，兩序列之間引入xba1酶切位點(下劃線為酶切位點)；在下游引物引入與ha蛋白5’末端16bp的同源臂序列，引物序列如下：

p5：aagaaatacaaatctagaatgagtaaaggagaagaact

p6：tcgagttgtttgcatggtatttgtatagttcatccatgcc

以pinamye-cotg-gfpcoe-fimh質粒為模板進行pcr擴增；pcr反應體系為50μl，pcr反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；pcr產物電泳鑒定回收后獲得綠色熒光蛋白基因gfp的基因序列seqidno.4。

1.5整合表達載體pinhapb1的構建

將回收的seqidno.3序列和seqidno.4序列使用onestepcloningkit定點克隆試劑盒克隆至載體骨架pinamye-cotg(xba1和bamh1酶切后pinamye-cotg-gfpcoe-fimh膠回收獲得)。測序后獲得整合表達載體pinhapb1。

2化學轉化枯草芽孢桿菌wb600菌株，屬于枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。

取500μl-1ml枯草芽孢桿菌wb600化學轉化感受態(tài)細胞置于43℃-46℃水浴中浴化，加入1-6μl(500ng/μl)整合表達載體pinhapb1質?；旌?，37℃，80rpm孵育1-3h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固體基礎培養(yǎng)基lb平板，14-18h可見陽性菌落。將陽性菌落提基因組進行pcr驗證，然后進行western-blot驗證，并且進行蔡司顯微鏡觀察。

3電轉化枯草芽孢桿菌wb600菌株，屬于枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)

將構建的整合表達質粒pinhapb1采用電擊轉化的方法，取50μl-100μl枯草芽孢桿菌wb600電轉化感受態(tài)細胞與1μl-3μl(50ng/μl)整合表達載體pinhapb1質?；旌霞尤腚姄舯斜?0min后進行電擊，電擊條件：22kv/cm，20μf，200ω，電擊一次。加入1ml電擊恢復液，37℃150rpm孵育3-5h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固體基礎培養(yǎng)基lb平板，14-18h可見陽性菌落。將重組枯草芽孢桿菌wb600，提進行pcr驗證，然后western-blot驗證，并且進行熒光共聚焦顯微鏡觀察。

4檢測重組枯草芽孢桿菌wb600體外對雞樹突狀細胞表面mhc-ii表達的影響

雞骨髓源dc分離培養(yǎng)：20日齡的spf小雞經處死后立即浸入75％的酒精中浸泡5min，再轉入含有雙抗的pbs浸泡5min。無菌條件下分離雞的股骨和脛骨，用10ml注射器吸取pbs沖洗股骨和脛骨的骨髓。收集沖洗液，離心，1000rpm/min×8min，pbs清洗2次，1000rpm/min×8min，棄上清，pbs重懸，然后按照等體積的比例將雞骨髓細胞懸液慢慢加入已裝有histopaque-1119的離心管中，2500rpm/min×30min，離心后出現(xiàn)3層，輕輕收集中間白霧層細胞，pbs洗滌1次，用含10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)液重懸細胞，1×106/ml細胞密度接種于6孔板中，再加入雞重組gm-csf和il-4終濃度均為50ng/ml。然后放入37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至第2、4和6天時各半量換液1次。在培養(yǎng)至第7天時收集細胞進行后續(xù)試驗。

空白枯草芽孢桿菌wb600菌株(基因組中未整合外源基因)和串聯(lián)表達禽流感病毒ha蛋白和pb1-f2蛋白的重組枯草芽孢桿菌wb600菌株分別作用于培養(yǎng)至第7天的雞樹突狀細胞，培養(yǎng)12h后收集雞樹突狀細胞。離心，1000rpm/min×8min，棄上清，pbs清洗兩次，100μlpbs重懸細胞，加入fitc標記的抗雞mhc-ii，4℃孵育30min，pbs清洗兩次后，200μlpbs重懸細胞，流式細胞儀檢測樹突狀細胞表面mhc-ii表達情況。

5口服免疫重組枯草芽孢桿菌wb600菌株spf雞體免疫應答水平的檢測

空白枯草芽孢桿菌wb600菌株(基因組中未整合外源基因)和串聯(lián)表達禽流感病毒ha蛋白和pb1-f2蛋白的重組枯草芽孢桿菌wb600菌株分別口服免疫一日齡spf雛雞，口服劑量為1×10¹⁰cfu/kg，連續(xù)免疫兩周，每周免疫兩次，每次劑量相同。每周進行糞便和血清的采集，飼養(yǎng)周期為5周。采用間接elisa方法檢測體內特異性siga和igg水平。檢測方法為：大腸桿菌表達過柱回收的血凝素ha蛋白抗原包被96孔板，4℃包被過夜；包被過夜，1％bsa(牛血清白蛋白)37℃封閉2h，洗滌后加待檢樣品37℃作用1h，洗滌加適當稀釋后的辣根過氧化物酶標兔抗雞igg或iga抗體，37℃1h，含四甲基聯(lián)苯胺和h2o2的tmb顯色液顯色后酶標儀檢測od450。

有益效果

1本實驗所構建的整合型表達質粒pinhapb1是目前國內外第一株枯草芽孢桿菌wb600串聯(lián)表達禽流感ha蛋白和pb1-f2蛋白的質粒。

2本發(fā)明成功構建了禽流感病毒ha-pb1-f2蛋白重組枯草芽孢桿菌整合表達質粒pinhapb1，并成功化學轉化和電擊轉化入枯草芽孢桿菌wb600。重組枯草芽孢桿菌作用于雞樹突狀細胞能夠影響其表面mhc11的表達從而誘導雞樹突狀細胞的成熟，并且經western-blot驗證ha蛋白和pb1-f2蛋白在重組枯草芽孢桿菌wb600中被成功表達，并通過口服免疫可以刺激一日齡spf雛雞產生有效特異性免疫應答水平。因此，重組枯草芽孢桿菌有望開發(fā)成預防家禽高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。下面結合附圖及具體實施技術對本發(fā)明做進一步說明。

四、附圖說明：

圖1：禽流感病毒ha蛋白基因ha的pcr擴增結果瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2：高致病性禽流感病毒pb1-f2蛋白基因pb1-f2的pcr擴增結果瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3：重疊pcr串聯(lián)ha和pb1-f2片段的pcr擴增結果瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖4：綠色熒光蛋白基因gfp的pcr擴增結果瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖5：構建的整合表達質粒載體酶切電泳圖；

圖6：整合型表達載體質粒pinhapb1酶切驗證電泳圖；

圖7：重組枯草芽孢桿菌wb600(化學法轉化)基因組pcr驗證電泳圖；

圖8：重組枯草芽孢桿菌wb600(電擊法轉化)基因組pcr驗證電泳圖；

圖9：重組枯草芽孢桿菌wb600表達產物western-blot(免疫印跡圖)；

圖10：重組枯草芽孢桿菌wb600表達產物page圖；

圖11：空白雞樹突狀細胞流式結果；

圖12：枯草芽孢桿菌wb600作用雞樹突狀細胞流式結果；

圖13：重組枯草芽孢桿菌wb600作用雞樹突狀細胞流式結果；

圖14：重組枯草芽孢桿菌wb600對ha-pb1-f2特異性igg水平變化的影響圖；

圖15：重組枯草芽孢桿菌wb600對ha-pb1-f2特異性siga水平變化的影響圖；

五、具體實施方式

1整合表達質粒pinhapb1的構建

下列所述方法如無注明，均為常規(guī)實驗方法。實驗具體涉及的材料和試劑如下：枯草芽孢桿菌wb600菌株由南京農業(yè)大學生命科學學院閆新老師實驗室惠贈；高致病性禽流感h5n1病毒血凝素(ha)基因(ncbi編號是af144305)由哈爾濱獸醫(yī)研究所陳化蘭惠贈；高致病性禽流感病毒h5n1毒株包含pb1-f2由南京金斯瑞生物有限公司合成；gfp基因由南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院牟春曉惠贈；pinamye-cotg由南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院牟春曉惠贈。

試劑：硫酸卡那霉素，氨芐青霉素等均購自takara公司；細菌基因組提取試劑盒購自康為公司；膠回收試劑盒，去內毒素質粒提取試劑盒等均購自omega公司；onestepcloningkit定點克隆試劑盒，dh5α感受態(tài)均購自vazyme公司。

1.1高致病性禽流感h5n1病毒血凝素(ha)基因的克?。?/p>

以含有血凝素的質粒pci-h5ha(哈爾濱獸醫(yī)研究所陳化蘭惠贈，ncbi編號是af144305)為模板，設計引物進行pcr擴增。在上游引物引入與gfp末端16bp的同源臂序列；在下游引物引入與pb1-f2末端16bp的同源臂序列。引物序列如下：

p1：ggcatggatgaactatacaaataccatgcaaacaactcg

p2：cacttccacctccaccgcaaattctgcattgtaac

以pci-h5ha質粒為模板，p1和p2為引物pcr克隆禽流感血凝素蛋白ha。如圖1：可知pcr成功克隆出ha片段1647bp，切取目的條帶，經dna純化試劑盒回收后待用。

1.2高致病性禽流感h5n1病毒pb1-f2基因的合成：

參照已發(fā)表的h5n1的pb1-f2蛋白基因序列(genbank登陸號：gu596982)，設計一對擴增pb1-f2蛋白基因cdna的引物，在上游引物引入與ha3’末端16bp的同源臂序列，在下游引物引入與枯草芽孢桿菌cotg5’末端16bp的同源臂序列。

引物序列如下：

p3：gtggaggtggaagtaggaggatggaacaggaacagg

p4：ggtaccaagcttttaggatcctccagtttatccactcttg

以高致病性禽流感病毒h5n1毒株(由南京金斯瑞生物有限公司合成)為模板，提取的總rna為模板，經mlv-反轉錄酶合成cdna第一鏈，以cdna為模板p3，p4為引物，進行pcr擴增增強腸道dc活性的pb1-f2蛋白。如圖2：可知pcr成功克隆出pb1-f2蛋白273bp，切去目的條帶用dna純化試劑盒回收待用。

1.3融合ha和pb1-f2片段

用重疊pcr將擴增的ha與pb1-f2使用p1，p4引物以膠回收ha和pb1-f2為模板進行pcr擴增獲得目的片段ha-pb1-f2。如圖3：可知pcr成功克隆出ha-pb1-f2片段1944bp，切取目的片段，使用dna回收試劑盒回收目的片段待用。

1.4綠色熒光蛋白基因gfp的克隆

參照已發(fā)表的綠色熒光蛋白基因序列(genbank登陸號：ku312311.1)設計一對擴增綠色熒光蛋白基因gfp的引物，在上游引物引入與載體基因3’末端16bp的同源臂序列，兩序列之間引入xba1酶切位點(下劃線為酶切位點)；在下游引物引入與ha蛋白5’末端16bp的同源臂序列，引物序列如下：

p5：aagaaatacaaatctagaatgagtaaaggagaagaact

p6：tcgagttgtttgcatggtatttgtatagttcatccatgcc

以pinamye-cotg-gfpcoe-fimh質粒為模板p5，p6為引物進行pcr擴增。如圖4：可知pcr成功獲得綠色熒光蛋白基因gfp714bp。切取目的片段回收待用。

1.5整合表達載體pinhapb1的構建

將pinamye-cotg-gfpcoe-fimh載體質粒通過xba1和bamh1雙酶切，并回收骨架載體大小為9774bp。將回收的ha-pb1-f2基因序列和綠色熒光蛋白基因gfp序列使用onestepcloningkit定點克隆試劑盒克隆至載體骨架pinamye-cotg上。獲得整合表達載體pinhapb1。

1.6整合表達載體pinhapb1的驗證

采用限制性核酸內切酶nhei和xhoi進行雙酶切重組質粒pinhapb1。如圖6：可知雙酶切成功得到含有綠色熒光蛋白gfp和禽流感蛋白ha-pb1-f2的片段7077bp。

2重組串聯(lián)表達禽流感病毒ha蛋白和pb1-f2蛋白枯草芽孢桿菌wb600的獲得及驗證

本次實驗采用了化學轉化枯草芽孢桿菌和電擊轉化枯草芽孢桿菌wb600菌株。

化學轉化方法：取500μl-1ml枯草芽孢桿菌wb600化學轉化感受態(tài)細胞置于43℃-46℃水浴中浴化，加入1-6μl(500ng/μl)整合表達載體pinhapb1質?；旌?，37℃，80rpm孵育1-3h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固體基礎培養(yǎng)基lb平板，14-18h可見陽性菌落。擴培將陽性菌落并提基因組進行pcr驗證。

電擊轉化法：取50μl-100μl枯草芽孢桿菌wb600電轉化感受態(tài)細胞與1μl-3μl(50ng/μl)整合表達載體pinhapb1質?；旌霞尤腚姄舯斜?0min后進行電擊，電擊條件：22kv/cm，20μf，200ω，電擊一次。加入1ml電擊恢復液，37℃150rpm孵育3-5h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固體基礎培養(yǎng)基lb平板，14-18h可見陽性菌落。擴培陽性菌落并提進行pcr驗證。

重組枯草芽孢桿菌wb600的基因組中含有gfp序列和ha-pb1f2序列。pcr驗證引物如下：

p5：aagaaatacaaatctagaatgagtaaaggagaagaact

p4：ggtaccaagcttttaggatcctccagtttatccactcttg

以上引物均由上海生工有限公司合成；

如圖7可知，1號為空白枯草芽孢桿菌wb600菌株基因組pcr結果，2，3，4為隨機挑選的陽性重組枯草芽孢桿菌，2號為假陽性，3，4號為正確陽性菌株；圖8可知，除1號為wb600空白組沒有ha-pb1-f2蛋白外，其他菌株的基因組中均含有ha-pb1-f2蛋白的基因序列，為陽性菌株。由此可知化學法比電擊法轉化效率稍低一些。

3重組串聯(lián)表達禽流感ha和pb1-f2蛋白枯草芽孢桿菌wb600的sds-page電泳及western-blot分析

對重組枯草芽孢桿菌陽性菌株wb600用溶菌酶處理。處理后進行sds-page電泳及western-blot實驗。sds-page電泳圖如圖9可知，重組枯草芽孢桿菌wb600與空白枯草芽孢桿菌相比，在98kd處有一條明顯的蛋白帶。western-blot實驗中，一抗使用鼠抗ha抗體，二抗使用鼠抗。結果如圖10可知與wb600空白菌相比陽性菌株在98kd處有一條明顯的蛋白印跡帶，并且沒有非特異性條帶出現(xiàn)，證明禽流感病毒ha-pb1-f2在枯草芽孢桿菌wb600中成功表達。

4重組枯草芽孢桿菌wb600體外對雞樹突狀細胞表面mhc-ii表達的影響

雞骨髓源dc分離培養(yǎng)：20日齡的spf小雞經處死后立即浸入75％的酒精中浸泡5min，再轉入含有雙抗的pbs浸泡5min。無菌條件下分離雞的股骨和脛骨，用10ml注射器吸取pbs沖洗股骨和脛骨的骨髓。收集沖洗液，離心，1000rpm/min×8min，pbs清洗2次，1000rpm/min×8min，棄上清，pbs重懸，然后按照等體積的比例將雞骨髓細胞懸液慢慢加入已裝有histopaque-1119的離心管中，2500rpm/min×30min，離心后出現(xiàn)3層，輕輕收集中間白霧層細胞，pbs洗滌1次，用含10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)液重懸細胞，1×10⁶/ml細胞密度接種于6孔板中，再加入雞重組gm-csf和il-4終濃度均為50ng/ml。然后放入37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至第2、4和6天時各半量換液1次。在培養(yǎng)至第7天時收集細胞進行后續(xù)試驗。

空白枯草芽孢桿菌wb600菌株(基因組中未整合外源基因)和串聯(lián)表達禽流感病毒ha蛋白和pb1-f2蛋白的重組枯草芽孢桿菌wb600菌株分別作用于培養(yǎng)至第7天的雞樹突狀細胞，培養(yǎng)12h后收集雞樹突狀細胞。離心，1000rpm/min×8min，棄上清，pbs清洗兩次，100μlpbs重懸細胞，加入fitc標記的抗雞mhc-ii，4℃孵育30min，pbs清洗兩次后，200μlpbs重懸細胞，流式細胞儀檢測樹突狀細胞表面mhc-ii表達情況。如圖11，圖12和圖13可知，空白枯草芽孢桿菌wb600菌株和重組枯草芽孢桿菌wb600菌株均能顯著提高雞樹突狀細胞表面mhc-ii的表達水平，誘導樹突狀細胞成熟。重組枯草芽孢桿菌wb600效果顯著高于空白枯草芽孢桿菌。

5口服免疫枯草芽孢桿菌wb600菌株并進行機體免疫應答水平的檢測

空白枯草芽孢桿菌wb600菌株(基因組中未整合外源基因)和串聯(lián)表達禽流感病毒ha蛋白和pb1-f2蛋白的重組枯草芽孢桿菌wb600菌株分別口服免疫一日齡spf雛雞，口服劑量為1×10¹⁰cfu/kg，連續(xù)免疫兩周，每周免疫兩次，每次劑量相同。每周進行糞便和血清的采集，飼養(yǎng)周期為5周。采用間接elisa方法檢測體內特異性siga和igg水平。檢測方法為：大腸桿菌表達過柱回收的血凝素ha蛋白抗原包被96孔板，4℃包被過夜；包被過夜，1％bsa(牛血清白蛋白)37℃封閉2h，洗滌后加待檢樣品37℃作用1h，洗滌加適當稀釋后的辣根過氧化物酶標兔抗雞igg或iga抗體，37℃1h，含四甲基聯(lián)苯胺和h2o2的tmb顯色液顯色后酶標儀檢測od450。如圖14可知，口服重組枯草芽孢桿菌wb600菌株和空白枯草芽孢桿菌wb600菌株spf雛雞體內ha-pb1-f2的特異性抗體igg水平均有提高，口服重組枯草芽孢桿菌wb600與口服空白枯草芽孢桿菌wb600相比，有非常顯著的效果。如圖15可知，口服重組枯草芽孢桿菌wb600和口服空白枯草芽孢桿菌wb600菌株spf雛雞血清中ha-pb1-f2的特異性siga水平在免疫一周到五周均有顯著提高。

應用

本發(fā)明涉及串聯(lián)表達禽流感病毒ha抗原片段和pb1-f2蛋白的重組枯草芽孢桿菌wb600，有望成功開發(fā)成預防家禽高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。