本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地講，涉及對(duì)細(xì)菌性莢膜多糖粗制品的純化方法。
背景技術(shù)：
：肺炎鏈球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，有90多種血清型，其中大部分肺炎鏈球菌細(xì)菌表面包裹一層莢膜多糖。莢膜多糖可逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別，防止免疫細(xì)胞的吞噬作用，因而使得細(xì)菌能夠在體內(nèi)繁殖而致病。多年的研究和臨床證明，肺炎鏈球菌的莢膜多糖作為疫苗能誘導(dǎo)特異性抗體，對(duì)相應(yīng)的肺炎鏈球菌具有很好的免疫保護(hù)作用。不同血清型的肺炎鏈球菌的莢膜多糖的成分和結(jié)構(gòu)都不一樣，因而通常需要使用不同血清型的肺炎鏈球菌的多糖組合作為疫苗來(lái)預(yù)防主要肺炎鏈球菌的致病性。用于制備多糖疫苗的肺炎鏈球菌在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，除了產(chǎn)生莢膜多糖之外，還產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物。為了滿足疫苗制備所必須的莢膜多糖純度，發(fā)酵液通常必須經(jīng)過(guò)多個(gè)純化步驟處理，將多糖粗制品中的蛋白、核酸、內(nèi)毒素等雜質(zhì)去除，從而避免后續(xù)接種疫苗可能引起的副反應(yīng)。細(xì)菌莢膜多糖純化工藝的建立經(jīng)歷了多年的發(fā)展，傳統(tǒng)細(xì)菌莢膜多糖純化工藝采用冷酚萃取法去除蛋白質(zhì)，該方法需要較長(zhǎng)的離心時(shí)間，且苯酚作為有一種具有極強(qiáng)腐蝕的試劑，可能腐蝕操作者的皮膚、粘膜甚至抑制操作者的中樞神經(jīng)或損害肝、腎功能；且廢棄苯酚的處理，對(duì)環(huán)境保護(hù)來(lái)說(shuō)存在著較嚴(yán)重的威脅。乙醇分沉淀法通常能夠有效地去除多糖中的蛋白污染物，但是難以達(dá)到用于注射用的疫苗純度的要求。另外，乙醇的使用還會(huì)帶來(lái)以下問(wèn)題：1)乙醇的使用需要防火設(shè)施，而設(shè)計(jì)這樣的設(shè)施成本很高；2)需要的乙醇量巨大，每升加工材料幾乎需要4-6l乙醇，并且廢液處理非常困難；3)處理后的多糖復(fù)溶困難，需要凍干等步驟。專利us5714354提出了一種用無(wú)乙醇沉淀來(lái)純化肺炎球菌莢膜多糖的改進(jìn)方法。該方法是通過(guò)用十六烷基三甲基溴化銨(ctab)來(lái)沉淀23種肺炎球菌血清型中的20個(gè)莢膜多糖，然后用活性炭過(guò)濾、羥基磷酸灰質(zhì)鹽(hydroxyapatite)色譜法和陰離子交換色譜法來(lái)進(jìn)一步分離多糖中的雜質(zhì)，該純化工藝步驟能夠純化出大部分血清型莢膜多糖。該方法純化出來(lái)的所有23個(gè)血清型莢膜多糖的質(zhì)量達(dá)到多糖疫苗的質(zhì)量指標(biāo)。目前，ctab已被廣泛用來(lái)選擇性的沉淀多糖，從而達(dá)到與蛋白及核酸分離的目的，如專利cn201510012526以及cn200910128141。然而，由于形成的ctab-多糖復(fù)合物解離較為困難，工藝步驟多且繁瑣，影響了莢膜多糖的回收率。因此，在專利cn200910128141中，仍然采用純的乙醇或乙醇和水混合物來(lái)溶解ctab-多糖復(fù)合物。降低多糖發(fā)酵溶液的ph值也被專利cn200880012946以及cn201210112391公開(kāi)用于選擇性沉淀蛋白質(zhì)、核酸，而不嚴(yán)重影響多糖產(chǎn)率。這樣純化方法的特點(diǎn)在于通過(guò)酸化這一步來(lái)將大部分的污染物(如蛋白、核酸等)和溶液中的莢膜多糖分離，簡(jiǎn)化了后續(xù)工藝，縮短了純化時(shí)間。然而，我們發(fā)現(xiàn)獲得的制備的多糖不能符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，仍然需要進(jìn)一步純化，包括使用層析色譜吸附殘留的雜質(zhì)，以及微濾、超濾來(lái)獲得合格多糖。在多糖純化過(guò)程中，多糖溶液不管是經(jīng)多步乙醇分級(jí)沉淀、還是ctab沉淀，以及簡(jiǎn)化純化步驟的酸化處理得到的多糖(粗糖)都不能達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，還需進(jìn)一步通過(guò)單個(gè)或多個(gè)色譜步驟處理獲得合格精糖。如專利cn201180071029報(bào)導(dǎo)在多糖純化過(guò)程使用疏水作用色譜(hic)或離子交換色譜(iex)去除溶液中c-多糖。由于部分血清型莢膜多糖糖基帶有磷酸根離子(如6a、6b、19f等)，在層析過(guò)程中填料會(huì)大量結(jié)合這類多糖分子，導(dǎo)致流出液中需要回收的多糖顯著降低。專利cn200610048875則使用sepharose4ff凝膠對(duì)細(xì)菌多糖進(jìn)行精純，但由于所選填料的性質(zhì)，處理的溶液體積明顯受到限制，不適合放大生產(chǎn)。季宇等(中國(guó)新藥雜志2016年第25卷第10期)采用doe設(shè)計(jì)建立了一種基于captoadhere的肺炎多糖純化工藝，但依然有少部分蛋白未能有效去除，色譜純化參數(shù)控制要求非常嚴(yán)格，通常蛋白、核酸含量很難達(dá)標(biāo)，不利于實(shí)際生產(chǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種不需要乙醇沉淀，操作簡(jiǎn)單，回收效率高的色譜層析純化細(xì)菌性莢膜多糖的純化方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供組合使用復(fù)合型離子交換層析和羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析在細(xì)菌性莢膜多糖純化方法中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：細(xì)菌性莢膜多糖的純化方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)滅活劑處理肺炎鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)液，得到包含有細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、核酸和多糖的細(xì)菌溶解液；(2)在步驟(1)獲得的細(xì)菌溶解液中加酸調(diào)節(jié)ph值6.5，沉淀雜質(zhì)，離心和微濾去除沉淀物獲得多糖澄清液；(3)用截留分子量10—100kda的膜對(duì)步驟(2)獲得的多糖澄清液進(jìn)行超濾換液并濃縮，獲得去除大部分可溶性蛋白質(zhì)、核酸以及大顆粒雜質(zhì)含量的莢膜多糖溶液；(4)將步驟(3)獲得的莢膜多糖溶液組合使用復(fù)合型離子交換層析和羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析進(jìn)行色譜層析，獲得純化的莢膜多糖溶液；(5)濃縮及超濾步驟(4)獲得的莢膜多糖溶液，并進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾、保存。作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(2)中所加的酸是磷酸、乙酸、鹽酸、硫酸或硝酸中的一種或幾種。作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(2)中ph值的范圍是3.0—6.5。作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(2)中微濾所用微濾膜的膜孔徑為0.22，0.45，0.65，1.0um中的任意一種。作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(4)所述的組合使用是指先使用復(fù)合型離子交換層析，后使用羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析或者先使用羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析，后使用復(fù)合型離子交換層析。作為一個(gè)優(yōu)選方案，復(fù)合型離子交換層析填料選自captoadhere、toyopearlmx-trp-650m、cellufinemaxaminobutyl，羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析為chttmceramichydroxyapatite。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：組合使用復(fù)合型離子交換層析和羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析在細(xì)菌性莢膜多糖純化方法中的應(yīng)用。本發(fā)明可用于從含有肺炎鏈球菌不同血清型中純化莢膜多糖，此處只是舉例，而不限于這些血清型，包括1，2，3，4，5，6a，6b，7f，8，9n，9v，10a，11a，12f，14，15b，17f，18c，19a，19f，20，22f，23f和33f。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：通過(guò)組合使用復(fù)合型離子交換層析和羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析，可有效降低蛋白質(zhì)及核酸雜質(zhì)到低于1％，純化的多糖產(chǎn)品質(zhì)量高于歐盟藥典標(biāo)準(zhǔn)要求，回收率在60％以上。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單快捷，容易放大進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，并且不需用到乙醇沉淀，具有操作簡(jiǎn)單，回收效率高，試劑消耗低、多糖中蛋白、核酸含量低等優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1離子交換層析(captodeae)肺炎球菌多糖19f色譜圖。圖2復(fù)合型離子交換層析(captoadhere)肺炎球菌多糖19f色譜圖。圖3羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析(hydroxyapatite)肺炎球菌多糖19f色譜圖。圖4色譜層析過(guò)程中多糖溶液中蛋白雜質(zhì)變化的sds-page圖。圖5色譜層析過(guò)程中多糖溶液中蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)圖。圖6色譜層析過(guò)程中多糖溶液中核酸含量變化趨勢(shì)圖。圖7色譜層析過(guò)程中多糖回收率趨勢(shì)圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1.肺炎鏈球菌多糖血清型1、3、4、7f、9v、15b、19a、19f、23f、33f莢膜粗多糖的制備肺炎鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)液用脫氧膽酸鈉(doc)于4℃溶解12-24h。之后直接加酸至細(xì)菌溶解液中，調(diào)節(jié)含有莢膜多糖溶解液ph值至3—6.5之間，室溫靜置1小時(shí)以上，離心去除溶解劑、部分蛋白質(zhì)和核酸，以及大量細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。在20℃下以大于10000g相對(duì)離心力將酸化液離心一小時(shí)，收集上清液并棄沉淀。獲得上清液以分子截留為50-100kd膜超濾，用純水進(jìn)行洗濾進(jìn)一步去除小分子雜質(zhì)，最后濃縮獲得粗制莢膜多糖溶液。表1.不同血清型、生產(chǎn)批次蛋白和核酸含量以及多糖回收率情況實(shí)施例2.19f血清型莢膜多糖溶液經(jīng)不同層析填料處理效果分析實(shí)驗(yàn)操作離子交換層析(captodeae，ge)：經(jīng)酸化處理后得到的粗多糖溶液使用截留分子量10-100kd膜，用5-50mm磷酸緩沖液，在ph6至8的ph下，進(jìn)一步超濾換液，直到達(dá)到恒定電導(dǎo)。captodeae層析柱用相同緩沖液平衡，隨后將換液后的莢膜多糖溶液上柱，收集流穿液。上樣完成后，用1-2個(gè)柱體積25mm磷酸緩沖液進(jìn)一步洗滌，多糖在的流穿液和洗滌液中被回收。結(jié)合在captodeae層析柱上的蛋白、核酸以及多糖用1mnacl洗脫下來(lái)。復(fù)合型離子交換層析(captoadhere，ge)：經(jīng)酸化處理后得到的粗多糖溶液使用截留分子量10-100kd膜，用5-50mm磷酸緩沖液，鹽離子濃度(nacl、kcl)優(yōu)選地在100-300mm下，進(jìn)一步超濾換液，直到達(dá)到恒定電導(dǎo)。captoadhere層析柱用相同緩沖液平衡，隨后將換液后的莢膜多糖溶液上柱，收集流穿液。上樣完成后，用1-2個(gè)柱體積磷酸緩沖液，含相同鹽離子濃度的緩沖液進(jìn)一步洗滌，多糖在的流穿液和洗滌液中被回收。結(jié)合在captoadhere層析柱上的蛋白、核酸以及多糖用0.1m乙酸洗脫下來(lái)。羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析(hydroxyapatite，bio-rad)：經(jīng)酸化處理后得到的粗多糖溶液使用截留分子量10-100kd膜，用5-50mm磷酸緩沖液，鹽離子濃度(nacl)優(yōu)選地在100-300mm下，進(jìn)一步超濾換液，直到達(dá)到恒定電導(dǎo)。hydroxyapatite層析柱用相同緩沖液平衡，隨后將換液后的莢膜多糖溶液上柱，收集流穿液。上樣完成后，用1-2個(gè)柱體積相同鹽離子緩沖液進(jìn)一步洗滌，多糖在的流穿液和洗滌液中被回收。結(jié)合在hydroxyapatite層析柱上的蛋白、核酸以及多糖用0.5m磷酸緩沖液洗脫下來(lái)。組合使用復(fù)合型離子交換層析(captoadhere，ge)和羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析(hydroxyapatite，bio-rad)經(jīng)酸化處理后得到的粗多糖溶液使用截留分子量10-100kd膜，用5-50mm磷酸緩沖液，鹽離子濃度(nacl)優(yōu)選地在100-300mm下，進(jìn)一步超濾換液，直到達(dá)到恒定電導(dǎo)。hydroxyapatite層析柱優(yōu)選的串聯(lián)captoadhere層析柱之后用用相同緩沖液平衡，隨后將換液后的莢膜多糖溶液上柱，收集流穿液。上樣完成后，用1-2個(gè)柱體積相同鹽離子緩沖液進(jìn)一步洗滌，多糖在的流穿液和洗滌液中被回收。分別洗脫結(jié)合在captoadhere層析柱上和在hydroxyapatite層析柱上的蛋白、核酸以及多糖。另外，captoadhere層析后回收的含有莢膜多糖溶液，經(jīng)超濾換液調(diào)節(jié)(或不調(diào)節(jié))溶液鹽離子濃度后，接著繼續(xù)上hydroxyapatite層析柱，收集含多糖的流穿液。反之，經(jīng)酸化處理后的粗糖液經(jīng)調(diào)節(jié)緩沖液鹽濃度后上hydroxyapatite層析柱后再上captoadhere層析柱亦可。結(jié)果分析從圖1肺炎球菌多糖血清型19f離子交換層析(captodeae)色譜圖可以看出，captodeae層析流穿液中的多糖峰明顯低于captoadhere層析(圖2)和hydroxyapatite層析(圖3)，推測(cè)很大一部分莢膜多糖吸附到captodeae填料上，從而導(dǎo)致流穿液中多糖濃度降低。因?yàn)?，在堿性到中性ph條件下，血清型19f莢膜多糖由于糖基上含有磷酸根離子而帶負(fù)電荷而吸附到captodeae上。這表明，captodeae并不適用于這類含有磷酸根離子血清型多糖的純化。有報(bào)道顯示captoadhere層析被用于肺炎多糖純化工藝的開(kāi)發(fā)(中國(guó)新藥雜志2016年第25卷第10期)，但從圖4多糖溶液中蛋白質(zhì)sds-page圖譜可以看出，captoadhere層析后多糖溶液中依然有部分蛋白殘留(含量約為10-20％)。而hydroxyapatite層析后的多糖溶液中殘留的蛋白條帶少于captoadhere層析。兩種不同層析方法處理后，殘留的蛋白條帶大小也有明顯不同，顯示兩種層析填料對(duì)蛋白的吸附有一定差異性。因而，組合使用captoadhere以及hydroxyapatite層析后，幾乎在多糖溶液中看不到蛋白殘留。以上結(jié)果表明，組合使用復(fù)合型離子交換層析和羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析兩個(gè)色譜步驟可有效用于細(xì)菌莢膜多糖純化。表2.19f莢膜多糖經(jīng)不同色譜層析處理結(jié)果純化方法蛋白含量％核酸含量％多糖回收率％captodeae9.60.315.4captoadhere14.30.685hydroxyapatite6.70.578.1captoadhere，hydroxyapatite0.50.163.6實(shí)施例3.肺炎鏈球菌多糖血清型1、3、4、7f、9v、15b、19a、19f、23f、33f精糖的制備經(jīng)酸化處理后得到的粗多糖溶液使用截留分子量10-100kd膜，用5-50mm磷酸緩沖液，鹽離子濃度(nacl)優(yōu)選地在100-300mm下，進(jìn)一步超濾換液，直到達(dá)到恒定電導(dǎo)。hydroxyapatite層析柱優(yōu)選的串聯(lián)captoadhere層析柱之后用用相同緩沖液平衡，隨后將換液后的莢膜多糖溶液上柱，收集流穿液。上樣完成后，用1-2個(gè)柱體積相同鹽離子緩沖液進(jìn)一步洗滌，多糖在的流穿液和洗滌液中被回收。表3.不同血清型經(jīng)captoadhere以及hydroxyapatite層析后，蛋白和核酸含量以及多糖回收率情況本發(fā)明是一種基于色譜層析純化肺炎鏈球菌多糖的方法，通過(guò)使用復(fù)合型離子交換層析能夠避免普通離子交換層析非特異性吸附帶磷酸根離子基團(tuán)類血清多糖(如6a、6b、19f等)。結(jié)合羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析有利于進(jìn)一步減少多糖溶液中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。通過(guò)本方法制備的莢膜多糖有約60至80％的回收率，其中蛋白質(zhì)含量少于1％，且核酸含量少于1％。所述的方法已經(jīng)在研究、中試規(guī)模實(shí)現(xiàn)。此方法與基于ctab或酒精沉淀的方法相比，純化多糖能節(jié)約50-90％的時(shí)間以及降低90％的成本。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12