本發(fā)明涉及一種分型方法和系統(tǒng)，尤其涉及一種對個體進行str分型的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：dna檢驗技術(shù)尤其是str檢測技術(shù)自20世紀80年代中期問世以來，在刑事、民事案件、大型災(zāi)難性事故(如：美國9·11恐怖襲擊、印尼海嘯、汶川大地震)及群體性突發(fā)事件中均發(fā)揮了巨大的作用。隨著微量生物物證dna檢驗技術(shù)和短小片段str復(fù)合擴增檢驗技術(shù)的發(fā)展，dna檢驗技術(shù)的應(yīng)用范圍有進一步擴大的趨勢，dna數(shù)據(jù)庫建設(shè)規(guī)模的持續(xù)擴大使得跨區(qū)域的流動性犯罪和系列案件串并偵破成為長效機制。在2009年的打拐專項行動中，公安部首次應(yīng)用dna數(shù)據(jù)庫來協(xié)助確認行動中解救的婦女兒童的親緣關(guān)系。時至今日，依據(jù)查閱二十一世紀以后國內(nèi)外法庭科學(xué)領(lǐng)域公開發(fā)表的文獻，str相關(guān)的研究依然是法醫(yī)遺傳學(xué)研究的熱點和核心。如歐盟法醫(yī)dna分型標準委員會認為，雖然新技術(shù)與新遺傳標記不斷涌現(xiàn)，但在今后相當長的時期內(nèi)，str將仍然是最主要的常染色體遺傳標記。從1995年英國首先建立國家dna數(shù)據(jù)庫以來，世界上很多國家已經(jīng)開始建立國家dna數(shù)據(jù)庫，并利用核心基因座來進行個體識別，侵權(quán)鑒定等，并逐步成為法律訴訟調(diào)查的得力工具，為識別重復(fù)犯罪和未破性犯罪案件的調(diào)查開辟了新的途徑。然而不同地域、民族基因組多態(tài)性差異巨大，國外現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫以及用以進行個體識別和侵權(quán)鑒定的核心基因座不能直接適用于亞洲人群，加之我國人口基數(shù)巨大，民族眾多，需要針對我國人群的自身特征建立數(shù)據(jù)庫，并確定可以用于個體識別和侵權(quán)鑒定等的核心基因座。自2000年建庫以來，我國建立dna數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)包含了5000多萬條的str數(shù)據(jù)，并且以每年600萬條的速度遞增，如何從這些眾多的數(shù)據(jù)中選擇適合中國人群個體的基因座，構(gòu)建適合正常檢材和微量降解檢材str分型方法和系統(tǒng)成為有待解決的技術(shù)問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種對個體進行str分型的方法，通過采用特定str基因座組合以及針對這些基因座設(shè)計的特定引物，能夠?qū)χ袊巳簜€體正常檢材和微量降解檢材進行準確高效分型，從而為實現(xiàn)個體識別、家系排查或親權(quán)鑒定等提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明還提供一種對個體進行str分型的系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)可以實現(xiàn)對針對19個基因座的準確分型。本發(fā)明還提供了一種復(fù)合檢測體系，所述檢測體系能準確獲得19個str基因座的基因型。本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒，包括所述的復(fù)合檢測體系。本發(fā)明提供的一種對個體進行str分型的方法，該方法包括：1)獲得所述個體dna；2)獲得所述個體dna包括18個常染色體str基因座和1個性別決定基因座amelogenin在內(nèi)共19個基因座的基因型，所述18個常染色體str基因座為d18s51、d21s11、d3s1358、fga、d8s1179、vwa、csf1po、d16s539、d7s820、d13s317、d5s818、d2s1338、d12s391、th01、tpox、d19s433、pentae、及d6s1043，包括采用與所述19個基因座一一對應(yīng)的擴增引物對其進行擴增以獲得擴增產(chǎn)物的步驟，所述擴增引物為序列表中seqidno.1至seqidno.38的核苷酸序列；3)根據(jù)所述19個基因座的基因型獲得所述個體的str分型結(jié)果。在本發(fā)明的方案中，所述19個基因座是申請人通過對大量中國人群的生存環(huán)境、種族起源等進行綜合分析獲得的。針對上述基因座的引物也是申請人通過大量實驗獲得的，這些特定基因座的組合實現(xiàn)對正常檢材和微量降解檢材(如：接觸性dna，脫落細胞，腐敗檢材等)的dna分型。進一步的，在本申請的方案中，“獲得所述個體dna”指的是提取該個體的例如血液、組織等樣本中的dna，或者直接獲得含有所述個體dna的血卡?！八鰝€體的str分型結(jié)果”指的是能用于對該進行個體識別、家系排查或親權(quán)鑒定的str分型結(jié)果。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述引物為熒光標記引物。在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，其中2)還包括在獲得擴增產(chǎn)物后，使用遺傳分析儀分析該擴增產(chǎn)物，以獲得所述19個基因座的基因型的步驟。在本發(fā)明的方案中，所述遺傳分析儀可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的遺傳分析儀，例如abi3130或abi3500型遺傳分析儀，通過id-x軟件或其他genemapper軟件等分析該pcr擴增產(chǎn)物中所述19個基因座的基因型。本發(fā)明提供的一種對個體進行str分型的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括dna獲取體系，復(fù)合檢測體系、推斷體系；所述dna獲取體系用于獲得所述個體dna；所述復(fù)合檢測體系用于獲得所述個體dna包括18個常染色體str基因座和1個性別決定基因座amelogenin在內(nèi)共19個基因座的基因型，所述18個常染色體str基因座為d18s51、d21s11、d3s1358、fga、d8s1179、vwa、csf1po、d16s539、d7s820、d13s317、d5s818、d2s1338、d12s391、th01、tpox、d19s433、pentae、及d6s1043，包括采用與所述19個基因座一一對應(yīng)的擴增引物對其進行擴增以獲得擴增產(chǎn)物的步驟，所述擴增引物為序列表中seqidno.1至seqidno.38的核苷酸序列；所述推斷體系用于根據(jù)所述個體的str分型結(jié)果對該進行個體識別、家系排查或親權(quán)鑒定。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述引物為熒光標記引物。更進一步的，所述復(fù)合檢測體系還用于在獲得擴增產(chǎn)物后，使用遺傳分析儀分析該擴增產(chǎn)物，以獲得所述19個基因座的基因型。更進一步的，所述遺傳分析儀利用針對各基因座的等位基因的分型標準物來確定dna中各基因座的基因型。等位基因的分型標準物的制備可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)手段制備。本發(fā)明提供的一種復(fù)合檢測體系，所述體系包括個體dna，19個基因座，以及擴增引物，所述復(fù)合檢測體系用于獲得所述個體dna包括18個常染色體str基因座和1個性別決定基因座amelogenin在內(nèi)共19個基因座的基因型，所述18個常染色體str基因座為d18s51、d21s11、d3s1358、fga、d8s1179、vwa、csf1po、d16s539、d7s820、d13s317、d5s818、d2s1338、d12s391、th01、tpox、d19s433、pentae、及d6s1043，包括采用與所述19個基因座一一對應(yīng)的擴增引物對其進行擴增以獲得擴增產(chǎn)物的步驟，所述擴增引物為序列表中seqidno.1至seqidno.38的核苷酸序列。在本發(fā)明的方案中，所述dna聚合酶可以是faststartdna聚合酶、taqdna聚合酶、hotstartdna聚合酶中的一種或多種。本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒，包括所述的復(fù)合檢測體系。在本發(fā)明的方案中，本發(fā)明利用所述復(fù)合檢測體系進行19個基因座的分型的方法，包括：1)將獲取的dna作為模板；2)使用所述擴增引物對作為模板的dna進行多重pcr擴增反應(yīng)以得到擴增產(chǎn)物；3)將所述擴增產(chǎn)物利用遺傳分析儀進行分析，以獲得19個基因座的基因型。在本發(fā)明的方案中，所述19個基因座信息如表1所示：表1本發(fā)明提供的擴增引物序列如下。所述擴增引物及其相對應(yīng)的基因座如下表2所示，pcru代表上游引物，pcrl代表下游引物；表2本發(fā)明方案具有以下的優(yōu)點：1、本發(fā)明的檢測方法和檢測系統(tǒng)采用特定的str基因座組合以及引物序列，使得最終獲得的分型圖譜上各位點之間排布均勻，圖譜完整清晰；重復(fù)檢測結(jié)果無明顯差異；stutter峰面積比不超過10％，峰高比不超過15％，完全能夠滿足法醫(yī)str檢驗的要求。2、使用本發(fā)明的檢測方法和檢測系統(tǒng)同時檢測特定19個str位點，具有高的個體識別、家系排查或親權(quán)鑒定能力。目前，常用的商品化str復(fù)合擴增試劑盒可獲得多至15個常染色體str基因座的分型結(jié)果。即使同時應(yīng)用兩個以上的試劑盒，最多也只可獲得18到19個str基因座的分型結(jié)果，但此種同時應(yīng)用數(shù)個試劑盒檢驗，由于基因座大部分重復(fù)，所能增加的基因座數(shù)量極為有限，也增加了檢驗成本。3、本發(fā)明的方案可以通過使用熒光標記，利用常規(guī)的遺傳分析儀，根據(jù)所要擴增的基因的分子量和熒光顏色的不同，獲得直觀的檢測結(jié)果，并且該結(jié)果與現(xiàn)有檢測系統(tǒng)相比，準確性為100％。4、本發(fā)明的方案能夠解決在dna檢測過程中，dna檢材由于腐敗、接觸過土壤、灰塵等存在pcr抑制劑(血色素、靛藍、腐殖酸等)、以及腐敗降解檢材中dna含量低等因素造成的上述基因座不易檢出等技術(shù)難題，提供了具有更高靈敏度(能檢出低至0.125ng的dna)，更高抗抑制劑能力、更高擴增效率的復(fù)合擴增方法。附圖說明圖1顯示了使用本發(fā)明系統(tǒng)獲得的一個樣本的分型結(jié)果圖。圖2顯示了本發(fā)明方法和系統(tǒng)的靈敏度檢測結(jié)果。圖3顯示了本發(fā)明方法和系統(tǒng)的種屬特異性檢測結(jié)果。圖4顯示了本發(fā)明方法和系統(tǒng)的重復(fù)性檢測結(jié)果。圖5顯示了本發(fā)明方法和系統(tǒng)的分型準確性檢測結(jié)果。具體實施方式以下實施例中使用的200份無關(guān)人員靜脈血(男性100份,女性100份)，由公安部物證鑒定中心提供。以下實施例中使用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用試劑耗材和儀器如下表3所示：表3實施例1、對本發(fā)明的對進行str分型的方法和系統(tǒng)準確性的驗證在本實施例中，所述為200份人靜脈血，已知其個體來源，但在本申請實施例1的實施過程中設(shè)定其個體來源未知，采用本申請方法和系統(tǒng)對其進行str分型，包括：1)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中的dna獲取體系獲得所述個體dna，2)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中的復(fù)合檢測體系獲得所述個體dna19個str基因座的基因型，并根據(jù)該基因型獲得該個體的str分型結(jié)果，3)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中所述推斷體系，根據(jù)所述個體的str分型結(jié)果對該進行個體識別、家系排查或親權(quán)鑒定。本實施例中，所述復(fù)合檢測體系用于獲得所述個體dna包括18個常染色體str基因座和1個性別決定基因座amelogenin在內(nèi)共19個基因座的基因型，所述18個常染色體str基因座為d18s51、d21s11、d3s1358、fga、d8s1179、vwa、csf1po、d16s539、d7s820、d13s317、d5s818、d2s1338、d12s391、th01、tpox、d19s433、pentae、及d6s1043，包括采用與所述19個基因座一一對應(yīng)的擴增引物對其進行擴增以獲得擴增產(chǎn)物的步驟，所述擴增引物為序列表中seqidno.1至seqidno.38的核苷酸序列。1、模板提取使用dnaminim48磁珠dna提取試劑盒提取檢測個體的靜脈血dna。提取步驟按照試劑盒說明書進行。2、利用所述復(fù)合檢測體系對上述樣本進行19個基因座的分型，包括：使用所述擴增引物對dna模板進行多重pcr擴增，以獲得擴增產(chǎn)物；將擴增產(chǎn)物利用遺傳分析儀確定19個基因座的基因型。具體過程如下：2.1、引物池配置擴增引物池的配置，其中所述19個基因座一一對應(yīng)的19對擴增引物如上所述；本發(fā)明提供的各種引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成好的引物用1×te緩沖液稀釋到100μm，將19個基因座的上下游引物等比混合，得到濃度為50μm的引物。從19管pcr引物中分別取不同體積加入到一個新的離心管中，作為19重pcr引物池，在該引物池中，各str位點的引物的終濃度為10μm。2.2、多重pcr反應(yīng)本實施例使用9700型pcr擴增儀進行多重pcr反應(yīng)。(1)配置pcr反應(yīng)混合物(pcrmix)(25μl體系)，如下表4所示。表4(2)擴增程序?qū)cr反應(yīng)混合物置于pcr儀上，調(diào)整循環(huán)程序如下表5進行擴增，得到擴增產(chǎn)物：表52.3、pcr產(chǎn)物分型待分型樣品的準備：1.電泳上樣混合物的準備，按下面比例準備由內(nèi)標和去離子甲酰胺組成上樣混合物：50μltyper500內(nèi)標+1000μl去離子甲酰胺，混合均勻。2.每管加入10μl上樣混合物、0.8μl擴增產(chǎn)物，混勻。3.95℃變性3分鐘，立即放在冰上冷卻3分鐘，之后電泳。利用abi3130xl型遺傳分析儀上進行檢測。應(yīng)用abi3130xldatecollectionsoftware3.1收集數(shù)據(jù)，genemapper3.3軟件對電泳結(jié)果進行分析，獲得所述19個基因座的基因型。2.4、結(jié)果分析使用本發(fā)明系統(tǒng)對200份dna樣品進行分型的一個代表性分型結(jié)果如圖1所示，為了驗證分型結(jié)果的準確性，從200份dna樣品中隨機抽取100份dna樣品，對19個基因座進行測序(北京邁奧德恩生物科技有限公司測序)，采用本實施例的復(fù)合檢測體系獲得的所述個體的所有分型結(jié)果與測序結(jié)果均一致，一致性達到100％，此結(jié)果證明本發(fā)明復(fù)合檢測體系分型結(jié)果準確。3、根據(jù)未知來源個體dna的19個基因座的基因型對其進行個體識別由本實施例方法獲得的上述200份樣品的個體來源結(jié)果，與其已知的個體來源結(jié)果一致，說明本發(fā)明方法可以對未知來源個體進行個體識別。4、根據(jù)200份dna樣品所述19個基因座的基因型，獲得個體的str分型結(jié)果，并進行親權(quán)鑒定。由本實施例方法獲得的上述200個個體的親權(quán)鑒定結(jié)果，與其已知的個體親權(quán)鑒定結(jié)果一致，說明本發(fā)明方法可以進行的親權(quán)鑒定。進一步的，上述19個基因座的基因型也可以用于對個體進行家系排查。實施例2本發(fā)明復(fù)合擴增體系靈敏度、種屬特異性、系統(tǒng)重復(fù)性、分型結(jié)果準確性驗證、以及抗抑制能力檢測一、靈敏度檢測當模板量≥0.125ng，19個基因座的全部等位基因均可正確分型；模板量<0.125ng，出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象，見圖2?？梢钥闯?，本發(fā)明的系統(tǒng)能對低至0.125ng的dna進行檢測。二、種屬特異性檢測復(fù)合擴增體系檢測動物血液樣本，在分型區(qū)均未產(chǎn)生特異性峰型，見圖3?？梢钥闯霰景l(fā)明的方法和系統(tǒng)具有良好的種屬特異性。三、系統(tǒng)重復(fù)性檢測采用2個批次的試劑對92份樣本(靜脈血，來自公安部物證鑒定中心)進行檢測，結(jié)果穩(wěn)定、圖譜完整清晰；重復(fù)檢測結(jié)果無明顯差異；stutter峰面積比不超過10％，峰高比不超過15％。使用本發(fā)明所述體系分型與使用pluspcramplificationkit試劑盒分型在共有基因座上分型結(jié)果完全相同，說明本發(fā)明的方法和系統(tǒng)具有良好的系統(tǒng)重復(fù)性。進一步的，將本發(fā)明pcr體系中pcr引物+反應(yīng)混合物和typer500內(nèi)標反復(fù)凍融5、10、15、20次獲得的檢測結(jié)果之間沒有明顯變化，各基因座間擴增平衡性好，參見圖4(反復(fù)凍融20次結(jié)果)，可以看出本發(fā)明的方法和系統(tǒng)具有良好的系統(tǒng)重復(fù)性。四、各類案件檢材分型準確性各類常見檢材如存放15年的血痕樣本、骨骼及唾液斑等樣本，經(jīng)本發(fā)明系統(tǒng)的19個str基因座復(fù)合擴增體系檢測均能得到準確分型結(jié)果(參見圖5，15年的血痕樣本結(jié)果)，且與dnatyper15tm、pluspcramplification試劑盒在共有基因座上的分型結(jié)果完全相同。五、復(fù)合擴增體系抗抑制能力的研究實驗方法:以1ng9947a為模板，在本發(fā)明的10ul擴增體系中分別加入三種不同濃度的pcr抑制劑(血色素、靛藍、腐殖酸)進行檢測，每個實驗重復(fù)三次，以測試該復(fù)合擴增體系的抗抑制能力和穩(wěn)定性。10ul擴增體系：血色素、靛藍、腐殖酸三種抑制劑的濃度和出峰率結(jié)果見下表6。表6血色素(hematin)濃度(μmol/l)200400600800出峰率(％)10010010084靛藍(indigo)濃度(nmol/l)200300400500600700800出峰率(％)10010010010010010088腐殖酸(humicacid)濃度(ng/μl)2025303540出峰率(％)10010010010088血色素、靛藍、腐殖酸是常見的存在于腐敗、接觸過土壤灰塵的dna檢材中的抑制劑，會對pcr過程產(chǎn)生不同程度的抑制，本申請上述實驗結(jié)果表明，本申請的pcr體系能耐受較高濃度的以上三種抑制劑，能夠滿足對一般的腐敗、接觸過土壤、灰塵等的dna檢材的分型檢測需求。序列表<110>公安部物證鑒定中心<120>一種對個體進行str分型的方法和系統(tǒng)<130>168726gf<160>38<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>1ttcttgagcccagaaggtta20<210>2<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>2attctaccagcaacaacacaaataaac27<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>3gtgagtcaattccccaag18<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>4gttgtattagtcaatgttctcc22<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>5actgcagtccaatctgggt19<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>6atgaaatcaacagaggcttg20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>7tgacataaaacattaagcac20<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>8ctcattggcaaaaggaaag19<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>9tttttgtatttcatgtgtacattcg25<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>10cgtagctataattagttcattttca25<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>11tggcgacagagcgagact18<210>12<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>12gccttgcactcctgggat18<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>13aacctgagtctgccaaggactagc24<210>14<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>14ttccacacaccactggccatcttc24<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>15gatcccaagctcttcctctt20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>16acgtttgtgtgtgcatctgt20<210>17<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>17tgtcatagtttagaacgaactaacg25<210>18<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>18ctgaggtatcaaaaactcagagg23<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>19acagaagtctgggatgtgga20<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>20gcccaaaaagacagacagaa20<210>21<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>21gggtgattttcctctttggt20<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>22tgattccaatcatagccaca20<210>23<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>23tgcatttacctgtgagta18<210>24<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>24ctcaggaggagctactga18<210>25<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>25aacaggatcaatggatgcat20<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>26tggcttttagacctggactg20<210>27<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223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