本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體而言，本發(fā)明涉及從豆科植物厚果崖豆藤中分離得到的3種具有較強(qiáng)乙酰和丁酰膽堿酯酶抑制活性的黃酮類化合物及其可藥用鹽，以及含有這些化合物的藥物組合物?？梢灶A(yù)期其用于學(xué)習(xí)記憶障礙和老年性癡呆癥的預(yù)防和治療。
背景技術(shù)：
：阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease，AD）是一種漸進(jìn)性神經(jīng)退化性失調(diào)癥，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。該病多為大腦原發(fā)性疾病，起病緩慢，病程呈進(jìn)行性，多有家族史，是老年人群中引起癡呆的最常見的疾病。AD最顯著的神經(jīng)病理組織學(xué)特征是老年斑、淀粉狀蛋白沉積物和神經(jīng)纖維纏結(jié)，主要發(fā)生在前腦基底、海馬組織和大腦皮層。關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制，目前有多種不同的假說，其中中樞膽堿能神經(jīng)功能失調(diào)被認(rèn)為是最為重要的一種。乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）為促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)遞質(zhì)，其在腦內(nèi)被兩種膽堿酯酶水解，即乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）和丁酰膽堿酯酶（Butyrveholinesterase，BuChE）。膽堿酯酶抑制劑能延緩乙酰膽堿的水解，因此膽堿酯酶抑制劑能夠提高AD患者乙酰膽堿在突觸間隙的含量而產(chǎn)生療效，是目前惟一被普遍認(rèn)可的藥物治療手段。目前臨床應(yīng)用的大部分膽堿酯酶抑制劑都是選擇性的AChE抑制劑，如他克林（tacrine）、加蘭他敏（galanthamine）、多奈哌齊（donepezil）、利伐司替明（rivastigmine）等。我國(guó)學(xué)者從蕨類植物蛇足石杉中發(fā)現(xiàn)并開發(fā)的AChE抑制劑石杉?jí)A甲（huperzineA）也顯示了良好的臨床應(yīng)用前景。但因其外周副作用較大，長(zhǎng)期治療效果不理想。Mesulam等研究發(fā)現(xiàn)，盡管腦內(nèi)AChE較BuChE濃度高許多，但當(dāng)AD患者腦中AChE活性下降時(shí)，BuChE的活性卻逐漸增加，這充分表明當(dāng)AChE被AChE抑制劑所抑制時(shí)，BuChE起到一定補(bǔ)償作用。此外BuChE在晚期AD病人大腦中的含量很高，其在晚期AD患者腦中乙酰膽堿的水解過程中起到更為突出的作用。故建議開發(fā)AChE-BuChE雙重抑制劑或選擇性BuChE抑制劑。厚果崖豆藤M(fèi)illettiapachycarpa為豆科崖豆藤屬植物，其種子味苦，辛，有毒，具有殺蟲、攻毒和止痛的功效，主治疥癬瘡癩、痧氣腹痛和小兒疳積，分布于我國(guó)的浙江、四川、江西、湖南、廣東、廣西、貴州、云南、福建等地，為廣西和貴州部分地區(qū)民間用藥材。對(duì)其化學(xué)成分的研究表明，該植物中次生代謝產(chǎn)物主要為結(jié)構(gòu)新穎的黃酮、異黃酮、二氫黃酮、查耳酮和魚藤酮類化合物。并且其中的部分異黃酮類化合物具有較好的抗雌性激素樣作用、細(xì)胞毒和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性，但是有關(guān)該植物和分離化合物的膽堿酯酶抑制活性及其在抗老年癡呆疾病中的應(yīng)用尚未見報(bào)告。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明的目的是提供了一種從豆科植物厚果崖豆藤中得到有效抑制乙酰及丁酰膽堿酯酶單體化合物的方法和應(yīng)用。這3個(gè)黃酮類化合物均具有明顯的乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制作用，顯示出在預(yù)防和治療學(xué)習(xí)記憶障礙和老年癡呆疾病中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的再一目的是提供了含有本發(fā)明的化合物和制藥學(xué)上可用的載體的藥物組合物。本發(fā)明的又一目的是提供了將本發(fā)明化合物用于制備預(yù)防和治療學(xué)習(xí)記憶障礙和老年癡呆藥物及與上述疾病有關(guān)的醫(yī)藥或保健品用途。本發(fā)明的化合物結(jié)構(gòu)式如下所示：本發(fā)明的3個(gè)黃酮類化合物，來自豆科植物厚果雞血藤的根、莖、葉、皮和種子中，經(jīng)過提取、分離、純化得到。也可通過半合成或全合成得到。本發(fā)明的化合物具有較高的乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制活性，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的化合物對(duì)兩種膽堿酯酶具有雙重抑制活性或選擇性抑制活性。本發(fā)明還涉及以本發(fā)明化合物作為活性成分的藥物組合物。該藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行制備。通過將本發(fā)明化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形物和/或輔劑結(jié)合，制成適于人使用的任何劑型。本發(fā)明化合物在其藥物組合物中的含量通常為0.01-95重量%。本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑包括口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注鼻腔、口腔黏膜、呼吸道、皮膚、直腸等。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑（包括真溶液和膠體溶液）、乳劑（包括O/W、W/O型和復(fù)乳）、混懸劑、注射劑（包括水針劑、粉針劑和輸液）、滴鼻劑等；固體劑型可以是片劑（包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片）、膠囊劑（包括硬膠囊、軟膠囊和腸溶膠囊）、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣（粉）霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也可以制成緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將本發(fā)明化合物制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑。稀釋劑是以淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；潤(rùn)濕劑可以是水、乙醇、異丙醇等、粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羥甲基淀粉鈉、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤(rùn)滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片或雙層片和多層片。為了將本發(fā)明化合物制成膠囊劑，可以將本發(fā)明化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可以將本發(fā)明化合物先與稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑制成顆粒或微丸，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發(fā)明化合物片劑的各種稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑和助流劑等可用于制備本發(fā)明化合物的膠囊劑。為將本發(fā)明化合物制備成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領(lǐng)域常用的增溶劑、助溶劑、pH調(diào)節(jié)劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β-環(huán)糊精等；pH調(diào)節(jié)劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸鹽、氫氧化鈉等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可以加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。此外，如需要也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其他添加劑。為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。本發(fā)明的化合物或組合物可單獨(dú)服用，或與其它治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用。當(dāng)本發(fā)明的化合物與其它治療藥物存在協(xié)同作用時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整它的劑量。具體實(shí)施例：下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。實(shí)施例1：本發(fā)明3個(gè)化合物的提取、分離、純化的方法：（1）取厚果雞血藤種子4.5kg，粉碎后置于熱回流裝置中，用95%的乙醇浸沒藥材，用電熱套加熱回流提取，每次3小時(shí)，提取3次。（2）將乙醇提取液真空濃縮，回收乙醇，得到乙醇濃縮液。（3）用適量的水稀釋乙醇濃縮液，得到的混懸液用石油醚進(jìn)行萃取。萃取采取少量多次的原則，第一次采用水溶液一半體積的石油醚，進(jìn)行萃取，以后逐步減少石油醚用量，直到石油醚層顏色非常淺為止，萃取過程中的乳化層歸于水層。（4）上層為石油醚層，將石油醚層真空濃縮回收石油醚后得到石油醚浸膏。（5）下層為水層，水層同法用乙酸乙酯萃取，萃取過程中的乳化層歸于水層。（6）上層為乙酸乙酯層，乙酸乙酯層真空濃縮回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯浸膏。（7）下層為水層，水層同法用水飽和的正丁醇萃取，萃取過程中的乳化層歸于正丁醇層。（8）上層為正丁醇層，正丁醇層真空濃縮回收正丁醇后得到正丁醇浸膏。（9）乙酸乙酯浸膏137g進(jìn)行硅膠柱層析（8cm柱子）分離，用石油醚-乙酸乙酯混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，將收集到的流分按照TLC檢測(cè)結(jié)果、用顯色劑顯色后的顏色以及放置后析出沉淀等性質(zhì)進(jìn)行合并濃縮，得到6個(gè)流份（流份A~F）。（10）流份B4g，用硅膠柱分離（2.5cm柱子）。用石油醚-乙酸乙酯的混和溶液梯度洗脫（從10∶1，8:1到6∶1，體積比，每個(gè)梯度400mL）。其中流份B-3～11中有橙色針晶析出，抽濾后重結(jié)晶得化合物1?；衔?為4-methoxylonchocarpin，其結(jié)構(gòu)鑒定如下：橙色針晶，1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ13.79(1H,brs,-OH),7.85(1H,d,J=15.2Hz,H-α),7.72(1H,d,J=9.6Hz,H-2'),7.61(2H,d,J=8.4Hz,H-2),7.44(1H,d,J=15.2Hz,H-β),6.94(2H,d,J=8.8Hz,H-3),6.75(1H,d,J=10Hz,H-4''),6.38(1H,d,J=9.2Hz,H-3'),5.59(1H,d,J=10Hz,H-3''),3.86(3H,s,OMe),1.47(6H,s,2×Me);13C-NMR(100.0MHz,CDCl3):δ191.9(C-O),161.8(C-4'),160.9(C-2'),159.9(C-4),144.1(C-β),130.5(C-6'),130.3(C-2,6),128.1(C-2''),127.5(C-1),117.8(C-α),115.9(C-11''),114.4(C-3,5),114.1(C-1'),109.4(C-3'),108.2(C-5'),77.7(C-3''),55.4(OMe),28.3(2×Me)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(SinghalAK,BaruaNC,SharmaRP,etal.Phytochemistry,1983,22(4):1005-1006.)報(bào)道相符，故該化合物鑒定為4-methoxylonchocarpin。（11）流份D4.8g,用硅膠柱分離（2.5cm柱子）。用石油醚-乙酸乙酯的混和溶液梯度洗脫（從，8:1，6:1,4:1，2:1到1∶1，體積比，每個(gè)梯度400mL）。其中流份D-111～141中有白色粉末析出，抽濾后進(jìn)一步純化后得化合物2。其中流份D-216～228中有白色粉末析出，進(jìn)一步純化后得化合物3?；衔?為barbigerone，其結(jié)構(gòu)鑒定如下：白色無定形粉末，1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ8.06(1H,d,J=8.4Hz,H-4''),7.96(1H,s,H-2),7.20(1H,d,J=2.0Hz,H-6'),7.04(1H,dd,J=2.0,8.4Hz,H-2'),6.92(1H,d,J=8.0Hz,H-3'),6.86(1H,d,J=8.8Hz,H-5''),6.81(1H,d,J=10.4Hz,H-4''),3.91(6H,s,2×OCH3),1.50(6H,s,2×CH3).13C-NMR(CDCl3,100MHz):δ175.9(C-4),157.3(C-7),152.3(C-10),151.9(C-2),149.1(C-4'),148.8(C-3'),130.3(C-5''),126.7(C-5),124.7(C-1'),121.1(C-6'),118.3(C-10),115.3(C-6),114.9(C-4''),112.6(C-2'),111.2(C-5'),109.2(C-8),77.7(C-6''),56.0(2×OCH3),28.1(2×CH3)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(YeH,ChenL,LiY,etal.JournalofChromatographyA,2008,1178(1):101-107)報(bào)道相符，故該化合物鑒定為barbigerone。化合物3為4',5'-dimethoxy-6,6-dimethylpyranoisoflavone，其結(jié)構(gòu)鑒定如下：白色無定形粉末，1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ8.06(1H,d,J=8.4Hz,H-4''),7.96(1H,s,H-2),7.20(1H,d,J=2.0Hz,H-6'),7.04(1H,dd,J=2.0,8.4Hz,H-2'),6.92(1H,d,J=8.0Hz,H-3'),6.86(1H,d,J=8.8Hz,H-5''),6.81(1H,d,J=10.4Hz,H-4''),3.91(6H,s,2×OCH3),1.50(6H,s,2×CH3).13C-NMR(CDCl3,100MHz):δ175.9(C-4),157.3(C-7),152.3(C-10),151.9(C-2),149.1(C-4'),148.8(C-3'),130.3(C-5''),126.7(C-5),124.7(C-1'),121.1(C-6'),118.3(C-10),115.3(C-6),114.9(C-4''),112.6(C-2'),111.2(C-5'),109.2(C-8),77.7(C-6''),56.0(2×OCH3),28.1(2×CH3)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(YeH,ChenL,LiY,etal.JournalofChromatographyA,2008,1178(1):101-107)報(bào)道相符，故該化合物鑒定為4',5'-dimethoxy-6,6-dimethylpyranoisoflavone。實(shí)施例2化合物對(duì)膽堿酯酶的體外抑制活性根據(jù)文獻(xiàn)并優(yōu)化的膽堿酯酶抑制劑篩選模型，對(duì)苦檀子中分離得到的化合物進(jìn)行了活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)化合物具有較高的抑制活性，其活性見表1。表1化合物體外抑制AChE和BChE的活性化合物編號(hào)IC50forAChE(μM)IC50forBuChE(μM)Selectivityratioa117.14±2.255.68±0.393.032121.60±4.6821.77±1.065.633131.17±13.772.34±0.0555.98加蘭他敏1.60±0.0213.18±0.770.12當(dāng)前第1頁1 2 3