本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種利用植物基原料和內生菌共培養(yǎng)制備生物活性物質的方法。

背景技術：

生物活性物質（bioactivesubstance），是指來自生物體內的對生命過程有調控作用的一類微量或少量物質，具備以下特點：一是含量少，二是生物活性高。具備醫(yī)藥用途的生物活性物質是指從生物組織或生物質中提取獲得的一類對人體或動物具有顯著調控作用的天然組分。這些天然組分尤其是對改善人類健康有積極功效。這類生物活性物質通過提取、改性、修飾、轉化成為相關產業(yè)追求的目標。

自然界的生物類群千差萬別，每一種生物中都含有大量的生物活性物質，這些生物活性物質主要為生物體內的一次代謝產物與二次代謝產物。第一，這些一次代謝指植物細胞通過光合作用或微生物的代謝，生成生物體生存繁殖所必需的化合物，如糖類、氨基酸、脂肪酸、核酸及其聚合衍生物、乙酰輔酶a等的代謝過程。第二，有些是以二次代謝產物方式產生，其過程往往是以生物體本身的某些一次代謝產物作為起始原料，通過一系列生物化學反應生成的化合物是典型的生物活性物質，如萜類、甾體、生物堿、多酚類等；第三，這類二次代謝產物也可以是微生物利用植物或動物或微生物的代謝產物，轉化合成而來，也可能是在植物或動物的前體或信號物質誘導下自身加快合成而來；后一種情況在藥用植物及其內生菌相互作用關系中比較普遍。

從自然界中的生物體內分離提取的生物活性物質，其種類包括活性多糖、低聚糖類、功能性糖醇類、膳食纖維、功能性油脂、功能性蛋白質、功能性氨基酸與多肽、生物堿、酚類化合物、黃酮類化合物、植物甾醇類、甙類、揮發(fā)油、單寧類、皂苷類、含硫活性物等。部分生物活性物質已經可以人工合成，但是化學合成的生物活性物質往往具有旋光性差異并導致生物活性差異，往往達不到天然產物的效果，且純化成本高。

目前制備生物活性物質的主要方法中也包括利用培養(yǎng)植物細胞和組織，以及其他繁殖體如原球莖和毛狀根等。但是，人工培養(yǎng)的植物組織中天然產物的含量往往不高，達不到工業(yè)化利用的需求，且植物培養(yǎng)成本高，周期長。值得注意的是，藥用植物內生菌也能夠表達與藥用植物類似或完全相同的生物活性物質，其培養(yǎng)周期短，成本低，甚至表達量高。但是，內生菌表達生物活性物質的水平很不穩(wěn)定，往往隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加而顯著降低，甚至完全喪失。

其他產生物活性物質的菌株表達生物活性物質水平隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加而顯著降低的情況也比較普遍。如文章《蛹蟲草菌種退化的探討》中介紹，蛹蟲草具有與冬蟲夏草極相似的藥理藥效，可以作為冬蟲夏草的代用品，但其菌株在繼代培養(yǎng)過程中極易退化。再如文章《繼代培養(yǎng)對球孢白僵菌毒素產生水平的影響》中報道，繼代培養(yǎng)對球孢白僵菌生物學特性、毒力及毒力相關因素等均會產生影響，發(fā)現(xiàn)隨著世代的增加，白僵菌某些毒素的代謝水平也逐漸降低。文章《繼代培養(yǎng)對球孢白僵菌毒力及毒力相關酶表達的影響》也證實：隨著繼代次數(shù)的增多,供試菌株的表達量均呈下降趨勢。

因此，在內生菌培養(yǎng)過程中加入藥用植物因子，以保障內生菌產生生物活性物質的能力，或刺激內生菌產生相應生物活性物質是一種有效的新選擇。

中國專利文獻（申請?zhí)枺?01610647628.x）公開了一種利用人參內生真菌制備人參白茯苓發(fā)酵液的方法，其包括如下步驟：s1：用人參在內生菌誘導培養(yǎng)基中制備真菌；s2：分別用人參和步驟s1獲得的真菌制備人參提取浸膏和真菌代謝產物浸膏，并利用所述人參提取浸膏和真菌代謝產物浸膏篩選出目標菌株；s3：利用所述目標菌株制備目標菌株種子液；s4：將所述目標菌株種子液接入由人參和白茯苓制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28～32℃下培養(yǎng)，得到所述人參白茯苓發(fā)酵液?，F(xiàn)有公開專利一方面證明了本發(fā)明通過添加植物基材料的觀點；但其所采用的方法僅限對于人參，不適用其它的植物基材料；同時，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明先活化內生菌，提高其生物合成能力，且在共培養(yǎng)過程中形成優(yōu)勢菌群，不易污染；同時，本發(fā)明只需要一種生物基材料就可以高水平持續(xù)表達含有人參的活性成分，且發(fā)酵液更好；其次，本發(fā)明采用獲得植物細胞和活的繁殖體，或部分滅活的植物組織，而不僅僅是提取物作為植物基材料，選擇面更廣，原材料更容易獲得，實踐證明在人參皂甙等活性物質的培養(yǎng)過程中，用本發(fā)明之方法活性更高，更穩(wěn)定。

根據(jù)上述特點，本發(fā)明設計開發(fā)了利用藥用植物原料和內生菌，以共培養(yǎng)方式持續(xù)表達和制備生物活性物質的方法，發(fā)揮藥用植物內生菌快速高水平表達生物活性物質的特點，并通過藥用植物活體細胞和組織及其生物質誘導和維持其表達水平，從而實現(xiàn)天然生物活性物質的持續(xù)高水平表達，由此建立具備產業(yè)化水平的天然生物活性物質的表達體系。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是，提供一種一種天然活性物質高效表達和制備的方法。

為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術方案是，該利用植物基原料和內生菌共培養(yǎng)制備生物活性物質的方法，具體包括以下步驟：

（1）植物基原料的預處理：取無菌培養(yǎng)的活體植物細胞、植物組織或器官繁殖體，或將植物基原料經過烘干和/或造粉和滅菌預處理；

（2）內生菌活化：將內生菌接種于含不同生物材料濃度梯度微生物培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)，預培養(yǎng)時間為1-25天，從而制得活化的內生菌；

（3）生物材料與內生菌共培養(yǎng)：在共培養(yǎng)設備中接種步驟（2）中制得的活化的內生菌中，并加入步驟（1）中所制得的含植物基材料的固體或液體培養(yǎng)基進行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為4-90天，獲得共培養(yǎng)產物；

（4）生物活性物質的提取：將步驟（3）中獲得的共培養(yǎng)產物根據(jù)所需的生物活性物質的特點，采用醇提、水提、超臨界提取、層析收集和噴霧干燥方法，獲得生物活性物質的濃縮，再分離和純化，得到生物活性物質。通過植物基和內生菌共培養(yǎng)，制得活性物質，工藝簡單可控，且生產周期短。

進一步改進在于，所述植物基原料包括活的植物細胞和組織、組織培養(yǎng)所獲得無性繁殖體和植物生物質；所述活的植物細胞和組織包括種子、細胞、新鮮莖、葉和根；組織培養(yǎng)所獲得無性繁殖體包括愈傷組織、原球莖、幼苗、毛狀根和胚狀體；植物生物質包括藥用植物莖稈、葉片、汁液、粉末和植物的愈傷組織、種苗、毛狀根和提取物。

進一步改進在于，共培養(yǎng)內生菌為具有生物活性物質的植物內生真菌或內生細菌或放線菌，是從具有生物活性物質物質的藥用植物中分離獲得的。

進一步改進在于，所述步驟（3）中的所述共培養(yǎng)設備包括固體發(fā)酵設備、間歇浸沒植物生物反應器、發(fā)酵罐、培養(yǎng)瓶中的一種或兩種以上。

進一步改進在于，所述共培養(yǎng)產物是指培養(yǎng)液和/或混合培養(yǎng)物和/或培養(yǎng)后植物材料和/或培養(yǎng)后內生菌菌體；也可以是固體發(fā)酵產物。

進一步改進在于，所述步驟（3）中所獲得的共培養(yǎng)產物，可以作為下一代培養(yǎng)的種子菌，循環(huán)擴大培養(yǎng)3-5代，且擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有/或不含有植物基原料。

進一步改進在于，所述步驟（2）中內生菌活化的預培養(yǎng)時間為3-10天；所述步驟（3）中生物材料與內生菌共培養(yǎng)中進行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7-50天。

進一步改進在于，所述步驟（3）中加入步驟（1）中所制得的含植物基材料的固體或液體培養(yǎng)基與內生菌一同加入，培養(yǎng)時間為7~50天。

進一步改進在于，所述步驟（3）中加入步驟（1）中所制得的含植物基材料的固體或液體培養(yǎng)基在內生菌接種培養(yǎng)2-20天后加入，加入后繼續(xù)培養(yǎng)4-60天。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述步驟（3）中加入步驟（1）中所制得的含植物基材料的固體或液體培養(yǎng)基在內生菌接種培養(yǎng)4-10天后加入，加入后繼續(xù)培養(yǎng)15-45天。

采用本發(fā)明的技術方案，與現(xiàn)有技術相比，其產生的有益效果是：本發(fā)明的有益效果包括：（1）天然活性物質的生產周期短、效率高；（2）天然活性物質制備過程可控，適宜工廠化和規(guī)模化生產；（3）內生菌產生天然活性物質的水平穩(wěn)定，不隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加而減少。

附圖說明

下面結合附圖進一步描述本發(fā)明的技術方案：

圖1是本發(fā)明利用植物基原料和內生菌共培養(yǎng)制備生物活性物質的方法的流程框圖。

具體實施方式

實施例1：

該利用植物基原料和內生菌共培養(yǎng)制備生物活性物質的方法，具體包括以下步驟：

（1）植物基原料的預處理：植物基原料選取梔子嫩芽作為外植體，通過氯化汞、酒精和無菌水處理得到無菌的梔子外植體，培養(yǎng)梔子愈傷組織；梔子愈傷組織的培養(yǎng)基的配方為：采用ms液體為基本培養(yǎng)液，添加激素2,4-d4.0mg/l，6-ba2.0mg/l，蔗糖濃度10g/l，瓊脂濃度1.5g/l，調整ph值5.8；設定的培養(yǎng)條件為：黑暗培養(yǎng)20d，然后轉入光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為15d，光照強度1800lx，光照時間18h/d，溫度為24±1℃。在愈傷組織長成后，轉入愈傷組織固體增殖步驟中，所述固體培養(yǎng)基配方為：采用ms液體為基本培養(yǎng)液，添加激素naa3.0mg/l，6-ba2.0mg/l，蔗糖濃度30g/l，瓊脂濃度7.0g/l，調整ph值7.0；設定的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時間為90d，光照強度1800lx，光照時間18h/d，溫度為24±1℃；

（2）內生菌活化：將藏紅花的內生菌接種于含不同生物材料濃度梯度微生物培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)，預培養(yǎng)時間為3天，從而制得活化的內生菌；

（3）生物材料與內生菌共培養(yǎng)：將步驟（1）獲得的愈傷組織與分離自藏紅花的內生菌fusariumspp-1共培養(yǎng)，共培養(yǎng)條件為：1）fusariumspp-1在普通pda固體培養(yǎng)基上，活化培養(yǎng)4d，培養(yǎng)溫度25℃；2）配置馬鈴薯葡萄糖液體（pd）培養(yǎng)基并滅菌；3）在滅菌分裝好的pd培養(yǎng)基中加入梔子愈傷組織，達到總量的3%，同時接種活化的fusariumspp-1培養(yǎng)物，達到總量的0.5%以上；4）搖瓶培養(yǎng)35d，獲得共培養(yǎng)產物；

（4）生物活性物質的提取：將步驟（3）中獲得的共培養(yǎng)產物分離純化。根據(jù)藏紅花素難溶于無水乙醚、正丁醇，石油醚等，易溶于水、無水乙醇、堿液等特點，選取50%的無水乙醇，待共培養(yǎng)產物固液分離后，量取液體體積2倍的50%的無水乙醇，在60℃下提取3次，合并3次提取液，55℃下旋轉蒸發(fā)至干，甲醇溶解至5ml，hplc檢測其含量。

結果顯示：培養(yǎng)產物液體部分粗藏紅花素的含量為0.43mg/l。

實施例2：

該利用植物基原料和內生菌共培養(yǎng)制備生物活性物質的方法，具體包括以下步驟：

（1）植物基原料的預處理：植物基原料選取紅豆杉外植體，通過氯化汞和無菌水處理得到無菌的紅豆杉外植體，培養(yǎng)紅豆杉愈傷組織；紅豆杉愈傷組織的培養(yǎng)基的配方為：采用ms液體為基本培養(yǎng)液，添加激素2,4-d2.0mg/l，6-ba1.0mg/l，蔗糖濃度30g/l，瓊脂濃度6.0g/l，調整ph值6.0；設定的培養(yǎng)條件為：黑暗培養(yǎng)25d，然后轉入光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為13d，光照強度1800lx，光照時間18h/d，溫度為24±1℃。在愈傷組織長成后，轉入愈傷組織固體增殖步驟中，所述固體培養(yǎng)基配方為：采用ms液體為基本培養(yǎng)液，添加激素naa2.0mg/l，6-ba1.0mg/l，蔗糖濃度30g/l，瓊脂濃度6.0g/l，調整ph值7.0；設定的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時間為90d，光照強度1800lx，光照時間16h/d，溫度為25±1℃；

（2）內生菌活化：將紅豆杉的內生菌接種于含不同生物材料濃度梯度微生物培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)，預培養(yǎng)時間為6天，從而制得活化的內生菌；

（3）生物材料與內生菌共培養(yǎng)：將步驟（1）獲得的愈傷組織與分離自紅豆杉的內生菌phomopsistcn-01共培養(yǎng)，共培養(yǎng)條件為：1）phomopsistcn-01在普通pda固體培養(yǎng)基上，活化培養(yǎng)5d，培養(yǎng)溫度25℃；2）配置馬鈴薯葡萄糖液體（pd）培養(yǎng)基并滅菌；3）在滅菌分裝好的pd培養(yǎng)基中加入紅豆杉愈傷組織，達到總量的4%，同時接種活化的phomopsistcn-01培養(yǎng)物，達到總量的0.8%以上；4）搖瓶培養(yǎng)20d，獲得共培養(yǎng)產物；

（4）生物活性物質的提?。禾崛∽仙即迹粚⒉襟E（3）中獲得的共培養(yǎng)產物根據(jù)所需的生物活性物質的特點，先進行固液分離，鑒于紫杉醇易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等特點，采用乙酸乙酯進行提取。液體部分：取100ml的液體，量取液體體積2倍的乙酸乙酯，與液體混合萃取浸提8h后，取上層液，45℃旋轉蒸發(fā)濃縮至干，甲醇溶解至5ml，hplc檢測其含量；固體部分：稱取3g的菌絲，液氮研磨后，加入30ml乙酸乙酯，浸提8h，離心分離取上清液體，45℃旋轉蒸發(fā)濃縮至干，甲醇溶解至5ml，hplc檢測其含量。醇提、水提、超臨界提取、層析收集和噴霧干燥方法，獲得生物活性物質的濃縮，再分離和純化，得到生物活性物質。

結果顯示：培養(yǎng)產物液體部分粗紫杉醇的含量為123.78μg/l。培養(yǎng)產物固體部分紫杉醇含量為3.82μg/g。

實施例3：

該利用植物基原料和內生菌共培養(yǎng)制備生物活性物質的方法，具體包括以下步驟：

（1）植物基原料的預處理：植物基原料選取紅豆杉葉提取物，通過高壓濕熱滅菌處理得到無菌的紅豆杉葉提取物；

（2）內生菌活化：將紅豆杉的內生菌接種于含不同生物材料濃度梯度微生物培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)，預培養(yǎng)時間為5天，從而制得活化的內生菌；

（3）生物材料與內生菌共培養(yǎng)：將步驟（1）獲得的紅豆杉葉提取物與分離自紅豆杉的內生菌phomopsistcn-01共培養(yǎng)，共培養(yǎng)條件為：1）phomopsistcn-01在普通pda固體培養(yǎng)基上，活化培養(yǎng)5d，培養(yǎng)溫度25℃；2）配置馬鈴薯葡萄糖液體（pd）培養(yǎng)基并滅菌；3）在滅菌分裝好的pd培養(yǎng)基中加入紅豆杉葉提取物，達到總量的4%，同時接種活化的phomopsistcn-01培養(yǎng)物，達到總量的0.6%以上；4）搖瓶培養(yǎng)30d，獲得共培養(yǎng)產物；

（4）生物活性物質的提?。禾崛∽仙即?；將步驟（3）中獲得的共培養(yǎng)產物，先進行固液分離，鑒于紫杉醇易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等特點，采用乙酸乙酯進行提取。液體部分：取100ml的液體，量取液體體積2倍的乙酸乙酯，與液體混合萃取浸提8h后，取上層液，45℃旋轉蒸發(fā)濃縮至干，甲醇溶解至5ml，hplc檢測其含量；固體部分：稱取3g的菌絲，液氮研磨后，加入30ml乙酸乙酯，浸提8h，離心分離取上清液體，45℃旋轉蒸發(fā)濃縮至干，甲醇溶解至5ml，hplc檢測其含量。

結果顯示：培養(yǎng)產物液體部分粗紫杉醇的含量為592.25μg/l。培養(yǎng)產物固體部分紫杉醇含量為3.82μg/g。

實施例4：

該利用植物基原料和內生菌共培養(yǎng)制備生物活性物質的方法，具體包括以下步驟：

（1）植物基原料的預處理：植物基原料選取銀杏葉提取物，通過過濾滅菌處理得到無菌的銀杏葉提取物；

（2）內生菌活化：從銀杏枝條中獲得一株高產黃酮的內生菌，經鑒定為刺盤孢屬真菌yxx03（colletotrichumsp.）；將菌株yxx03在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（pda）上活化培養(yǎng)6天；

（3）生物材料與內生菌共培養(yǎng)：將步驟（2）中活化后的菌株yxx03接種到銀杏葉提取物殘渣中，進行固體發(fā)酵；固體發(fā)酵溫度27℃；

（4）生物活性物質的提取：通過在索氏提取器內，用95%乙醇溶液提取后，將浸提液用旋轉蒸發(fā)儀55°c減壓濃縮得棕色粘稠物，結果顯示：用70%乙醇溶解，分光光度計，檢測培養(yǎng)15d的固體培養(yǎng)物和菌絲中，粗黃酮含量為0.69mg/g；培養(yǎng)35d的固體培養(yǎng)物和菌絲中，粗黃酮含量為1.73mg/g。

實施例5：

該利用植物基原料和內生菌共培養(yǎng)制備生物活性物質的方法，具體包括以下步驟：

（1）植物基原料的預處理：植物基原料取在ms固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天的銀杏愈傷組織若干，在超凈臺中搗碎，平鋪在pda培養(yǎng)基上，待用；

（2）內生菌活化：從銀杏枝條中獲得一株高產黃酮的內生菌，經鑒定為刺盤孢屬真菌yxx03（colletotrichumsp.）；將菌株yxx03在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（pda）上活化培養(yǎng)6天；

（3）生物材料與內生菌共培養(yǎng)：將步驟（1）制得的銀杏愈傷組織接種活化后的菌株yxx03，培養(yǎng)10天后，在無菌條件下切取1cm見方的菌絲塊，接種到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液（pd）中，搖瓶培養(yǎng)45天，分別收集培養(yǎng)液和菌絲體；

（4）生物活性物質的提取：通過在索氏提取器內，用乙醇溶液提取后，測得菌絲體中粗黃酮含量為2.33mg/g；培養(yǎng)液中粗黃酮含量為120.01mg/l；且表達穩(wěn)定；相對于栽培銀杏，需要數(shù)年時間，按照本實施例，產生系統(tǒng)級別黃酮含量的菌培養(yǎng)時間在40天以內。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。