本申請為國際申請日2011年9月22日、國際申請?zhí)杙ct/ep2011/066500于2013年3月22日進(jìn)入中國國家階段、申請?zhí)?01180045929.0、發(fā)明名稱“用于檢測和/或定量人類dna的方法”的分案申請。

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、診斷學(xué)領(lǐng)域，更具體來說屬于分析和法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明還屬于核酸擴(kuò)增和定量領(lǐng)域，更具體來說屬于dna定量領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在所有dna分型方法中，以及各種其他科學(xué)領(lǐng)域的dna檢測中，測定從法醫(yī)樣品以及其他樣品回收的dna的量是一個關(guān)鍵步驟。例如對于多重dna分型試劑盒來說，為了產(chǎn)生最優(yōu)結(jié)果，通常需要輸入的dna在0.5至2ng的狹窄范圍內(nèi)。因此，為了確保陽性結(jié)果是陽性結(jié)果和/或陰性結(jié)果是由不存在dna造成的陰性結(jié)果，dna的定量是絕對重要的。此外，法醫(yī)dna測試實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求人類特異性的dna定量。這是由于分離技術(shù)可能將人類dna與細(xì)菌和其他外源dna一起回收而造成的。已經(jīng)開發(fā)了允許對人類特異性dna進(jìn)行定量的許多方法步驟，包括初始印跡(start-blot)技術(shù)、基于液體的雜交測定法和實(shí)時pcr(聚合酶鏈反應(yīng))。目前，由于實(shí)時pcr的動態(tài)范圍寬并且易于自動化，實(shí)時pcr是主導(dǎo)技術(shù)。

現(xiàn)代的str試劑盒已變得靈敏得多，并且即使使用少量dna也能獲得良好結(jié)果。因此，對于允許精確和準(zhǔn)確定量甚至低濃度樣品中的人類dna的方法、試劑盒和核酸區(qū)域存在著需求。已經(jīng)有某些定量和檢測試劑盒可用，然而它們具有嚴(yán)重的缺點(diǎn)。一種這樣的試劑盒是quantifilerhuman試劑盒(appliedbiosystems)，另一種試劑盒是quantifilerduo試劑盒(appliedbiosystems)，另一種試劑盒是plexorhy實(shí)時pcr定量試劑盒(promega)。quantifilerduo試劑盒和plexorhy試劑盒兩者都靶向基因組上的常染色體和性染色體(y染色體)靶標(biāo)。

所述試劑盒的缺點(diǎn)：根據(jù)lasalle等，(forensicscienceinternational:genetics，“通過實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行dna定量的單拷貝和多拷貝方法的分析”(analysisofsingleandmulti-copymethodsfordnaquantificationbyreal-timepolymerasechainreaction))，與plexorhy相比，quantifiler試劑盒在定量中更準(zhǔn)確，但是具有較低的動態(tài)范圍。plexorhy由于擴(kuò)增多拷貝靶標(biāo)而提供較高的動態(tài)范圍，但是準(zhǔn)確性較低。這種較低的準(zhǔn)確性可以歸因于多拷貝靶標(biāo)。如果由于例如靶標(biāo)拷貝數(shù)的不穩(wěn)定性，擴(kuò)增少于基因組上全套20個拷貝，那么常染色體與性染色體(y)靶標(biāo)之間的擴(kuò)增比率可能發(fā)生變化。plexorhy試劑盒的動態(tài)范圍略好于其他試劑盒(lasalle等，forensicscienceinternational:genetics，“通過實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行dna定量的單拷貝和多拷貝方法的分析”(analysisofsingleandmulti-copymethodsfordnaquantificationbyreal-timepolymerasechainreaction))。在統(tǒng)計(jì)學(xué)比較中，lasalle等證實(shí)了這兩種試劑盒之間的顯著差異。

法醫(yī)學(xué)中的另一個重要參數(shù)是必須進(jìn)行分析的dna的降解等級。由于quantifilerhuman和plexohy試劑盒的擴(kuò)增子的大小從62至133個堿基對(bp)不等，因此當(dāng)將試劑盒應(yīng)用于降解的dna時，預(yù)期可能存在顯著差異。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決了上面指出的問題，并提供了如下所概述的以下解決方案。

一方面，本發(fā)明涉及用于定量和/或檢測樣品中基因組的一個或多個核酸的方法，其中

a.對所述核酸進(jìn)行擴(kuò)增，并且被擴(kuò)增的基因座是基因組中的多拷貝基因座，

b.所述多拷貝基因座在至少兩個不同的染色體上具有拷貝，

c.并且對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測和/或定量。

這種新方法與現(xiàn)有方法相比的一個顯著優(yōu)點(diǎn)是更高的靈敏度和被檢測靶標(biāo)的更高穩(wěn)定性。其他以前已知的靶標(biāo)在不同個體之間可能存在變化，這是由于重復(fù)元件傾向于在數(shù)目上變化(pavelitz等，人類u2snrna基因在分裂中期表現(xiàn)出永久性開放的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和啟動子解體(humanu2snrnagenesexhibitapersistentlyopentranscriptionalstateandpromoterdisassemblyatmetaphase)，molecularandcellularbiology,2008l,p.3573-3588；liao等，編碼人類u2snrna的串聯(lián)重復(fù)基因(rnu2基因座)的協(xié)同進(jìn)化參與快速染色體內(nèi)均勻化和稀有的染色體間基因轉(zhuǎn)變(concertedevolutionofthetandemlyrepeatedgenesencodinghumanu2snrna(thernu2locus)involvesrapidintrachromosomalhomogenizationandrareinterchromosomalgeneconversion)，theembojournal,vol.16,no.3,pp.588,598,1997；jasinska等，塑造人類轉(zhuǎn)錄組的重復(fù)序列(repetitivesequencesthatshapethehumantranscriptome)，febsletters567(2004)136-141)。

理想情況下，所述基因座不是重復(fù)元件例如短的串聯(lián)重復(fù)序列，或本身不是具有下式的元件：(awcxgytz)2-1000，其中w、x、y和z可以在0至10之間變化，并表示該單元中存在的核苷酸數(shù)目。所述單元可以被重復(fù)2至1000次。另一種重復(fù)元件是通常在端粒內(nèi)的衛(wèi)星dna。其他也不適合的重復(fù)元件是短散在核元件(sine)和長散在核元件(line)。

此外，本發(fā)明涉及基因組中的多拷貝基因座用于檢測和/或定量所述基因組的核酸的用途，其中所述多拷貝基因座不是重復(fù)元件并在至少兩個不同的染色體上具有拷貝。

此外，本發(fā)明涉及用于檢測和/或定量人類核酸的試劑盒，其中所述試劑盒包含引物，所述引物在嚴(yán)緊的條件下與在80個堿基對的區(qū)段上與seqidno.1或52的序列具有至少80％序列同一性的序列結(jié)合。

在本文中使用下列縮寫：(1)hda(解鏈酶依賴性擴(kuò)增)，(2)page(聚丙烯酰胺凝膠電泳)，(3)gdna(基因組dna)，(4)fam(6-羧基熒光素)，(5)snp(單核苷酸多態(tài)性)，(6)ntc(無模板對照)，(7)bhq(黑洞淬滅劑)，(8)qpcr(定量pcr)，(9)hex(6-羧基-4,7,2’,4’,5’,7’-六氯熒光素)。

附圖說明

圖1

示出了鑒定到的一部分基因組區(qū)域。

圖2

hda反應(yīng)的page分析結(jié)果。第1道：o-rangeruler10bpdna梯狀條帶(fermentas)；第2和3道：使用其他引物的hda反應(yīng)；第4道：使用引物ht-for2和ht-rev2而無gdna的hda；第5道：使用引物ht-for2和ht-rev2以及10,000cp人類gdna的hda。

圖3

圖3示出了實(shí)時hda反應(yīng)的結(jié)果。虛線：沒有人類dna的對照反應(yīng)；實(shí)線：具有10,000個拷貝的人類gdna的反應(yīng)。

圖4

示出了來自于一系列稀釋液(10ng-10pg人類gdna)的qpcr數(shù)據(jù)。

圖5

多拷貝測定(正方形)和單拷貝測定(圓)的ct值的圖；以每個反應(yīng)10pg至10nggdna加入模板dna。

圖6

序列的概述。seqidno.2和3是擴(kuò)增seqidno.1的第一個帶下劃線部分的引物。seqidno.11和12是擴(kuò)增seqidno.1的第二個帶下劃線部分的蝎型引物。

圖7

圖7示出了通過引物對11和12、5和6以及8和9擴(kuò)增的區(qū)域。

圖8

圖8示出了人類中降解dna的測定。

圖9

圖9示出了人類中降解dna的測定結(jié)果。

圖10

圖10示出了可變拷貝數(shù)的測定結(jié)果。

圖11a和b

圖11示出了可變拷貝數(shù)的測定結(jié)果。

圖12

圖12示出了可變拷貝數(shù)的測定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

用于定量和/或檢測樣品中基因組的一個或多個核酸的方法，其中

a.對所述核酸進(jìn)行擴(kuò)增，并且被擴(kuò)增的基因座是基因組中的多拷貝基因座，

b.所述多拷貝基因座在至少兩個不同的染色體上具有拷貝，

c.并且對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測和/或定量。

令人驚訝的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用于核酸的檢測和/或定量時，不是重復(fù)元件的多拷貝基因座優(yōu)于其他基因座。眾所周知，在不同個體之間重復(fù)元件的拷貝數(shù)可能不同。因此，本發(fā)明優(yōu)選涉及本文中引述的方法，其中所述多拷貝基因座不是重復(fù)元件。

總的來說，這些核酸可以具有原核或真核等任何來源。優(yōu)選情況下，它們是哺乳動物的，更優(yōu)選為人類的。這是因?yàn)楸景l(fā)明的一個極大優(yōu)點(diǎn)是其在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

一個這樣的序列被顯示在seqidno.1中，另一個序列顯示在seqidno.52中。事實(shí)上，seqidno.1是seqidno.52的一部分。本發(fā)明人已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，該序列和/或與其具有序列相似性的序列可以在人類基因組中被多次找到。因此，理想情況下使用與這些序列結(jié)合的引物和/或探針。

分布在基因組各處的序列不是全都完全相同的。重要的是所選引物也結(jié)合于近似相同的序列。因此，理想情況下，所述基因座與seqidno.1或seqidno.52的序列在80個堿基對的區(qū)段上具有至少60％、70％、80％、90％或甚至95％或98％的序列同一性。

兩個序列之間的百分比同一性的確定是使用karlin和altschul的數(shù)學(xué)算法(proc.natl.acad.sci.usa(1993)90:5873-5877)來完成的。這樣的算法是altschul等的blastn和blastp程序(j.mol.biol.(1990)215:403-410)的基礎(chǔ)。使用blastn程序來執(zhí)行blast核苷酸檢索，分值＝100，字長＝12，以獲得核苷酸序列之間的百分比同一性。使用blastp程序來執(zhí)行blast蛋白質(zhì)檢索，分值＝50，字長＝3，以獲得氨基酸序列之間的百分比同一性。為了獲得空位比對(gappedalignment)供比較目的用，利用如altschul等(nucleicacidsres.(1997)25:3389-3402)所述的gappedblast。當(dāng)利用blast和gappedblast程序時，使用相應(yīng)程序的缺省參數(shù)。

本發(fā)明的一個方面是對多個拷貝進(jìn)行擴(kuò)增。理想情況下，對在多個不同的染色體上的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29個拷貝進(jìn)行擴(kuò)增。seqidno.1、52或與其非常相似的序列在人類基因組中出現(xiàn)高達(dá)29次。這不僅是令人驚訝的，而且提供了本發(fā)明的能力。此外，所述拷貝可以存在于各個不同的染色體例如1、4、5、7、11、16號染色體上。

擴(kuò)增方法是非等溫法或等溫法。

非等溫?cái)U(kuò)增方法可以選自聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)(saiki等，(1985)science230:1350)、定量實(shí)時pcr(rtpcr)、連接酶鏈反應(yīng)(lcr)(landegren等，(1988)science241:1077-1080)。聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增是優(yōu)選的。

等溫?cái)U(kuò)增方法可以選自解鏈酶依賴性擴(kuò)增(hda)(vincent等，(2004)emborep5(8):795-800)、熱穩(wěn)定的hda(thda)(an等，(2005)jbiolchem280(32):28952-28958)、鏈置換擴(kuò)增(sda)(walker等，(1992)nucleicacidsres20(7):1691-6)、多重置換擴(kuò)增(mda)(dean等，(2002)procnatlacadsciusa99(8):5261-5266)、滾環(huán)擴(kuò)增(rca)(liu等，(1996)jamchemsoc118:1587-1594)、限制性輔助rca(wang等，(2004)genomeres14:2357–2366)、單引物等溫?cái)U(kuò)增(spia)(dafforn等，(2004)biotechniques37(5):854-7)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(tma)(vuorinen等，(1995)jclinmicrobiol33:1856-1859)、切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(near)(maples等，us2009017453)、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(expar)(vanness等，(2003)procnatlacadsciusa100(8):4504-4509)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(lamp)(notomi等，(2000)nucleicacidsres28(12):e63)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(rpa)(piepenburg等，(2006)plosbiol4(7):1115-1120)、基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba)(kievits等，(1991)jvirolmethods35:273-286)、smart擴(kuò)增法(smap)(mitani等，(2007)natmethods4(3):257-62)。

在本發(fā)明的文本中，“等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)”是指在反應(yīng)期間溫度沒有顯著變化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在發(fā)生擴(kuò)增的主要酶性反應(yīng)步驟中，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的溫度偏差不超過10℃，優(yōu)選不超過5℃，甚至更優(yōu)選不超過2℃。

取決于核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，擴(kuò)增反應(yīng)需要不同的酶。用于核酸擴(kuò)增的已知等溫方法是上面所提到的那些，其中用于在等溫條件下擴(kuò)增核酸的至少一種嗜中溫酶選自解旋酶、嗜中溫聚合酶、具有鏈置換活性的嗜中溫聚合酶、切口酶、重組蛋白、連接酶、糖基化酶和/或核酸酶。

“解旋酶”對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。它們是沿著核酸的磷酸二酯骨架定向移動，使用源自于ntp或dntp水解的能量將兩條退火的核酸鏈(例如dna、rna或rna-dna雜合體)分開的蛋白。根據(jù)明確的解旋酶基序的存在，可以確定給定蛋白質(zhì)的解旋酶活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇適合的具有解旋酶活性的酶用于本發(fā)明的方法中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，解旋酶選自來自于不同家族的解旋酶：超家族i解旋酶(例如dda、pcra、f質(zhì)粒trai蛋白解旋酶、uvrd)，超家族ii解旋酶(例如recq、ns3解旋酶)，超家族iii解旋酶(例如aavrep解旋酶)，來自于dnab樣超家族的解旋酶(例如t7噬菌體解旋酶)或來自于rho樣超家族的解旋酶。

除了所需的酶之外，擴(kuò)增方法還將包含緩沖液、dntp或ntp。

當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“dntp”是指脫氧核糖核苷三磷酸。這樣的dntp的非限制性實(shí)例是datp、dgtp、dctp、dttp、dutp，其也可以以標(biāo)記的衍生物的形式存在，所述標(biāo)記的衍生物例如包含熒光標(biāo)記物、放射活性標(biāo)記物、生物素標(biāo)記物。還包括具有修飾的核苷酸堿基的dntp，其中所述核苷酸堿基是例如次黃嘌呤、黃嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、次黃嘌呤核苷、黃嘌呤核苷、7-甲基鳥苷、5,6-二氫尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氫尿苷、5-甲基胞苷。此外，在本發(fā)明中還包括上述分子的ddntp。

當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“ntp”是指核糖核苷三磷酸。這樣的ntp的非限制性實(shí)例是atp、gtp、ctp、ttp、utp，其也可以以標(biāo)記的衍生物的形式存在，所述標(biāo)記的衍生物例如包含熒光標(biāo)記物、放射活性標(biāo)記物、生物素標(biāo)記物。

理想情況下，當(dāng)檢測核酸時，使用解鏈酶依賴性擴(kuò)增(hda)。當(dāng)對核酸進(jìn)行定量時，使用實(shí)時pcr(rtpcr)。

理想情況下，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小在80bp和200bp之間。擴(kuò)增產(chǎn)物也可以更長，即300bp、400bp或甚至更長。

理想情況下，用于擴(kuò)增的引物具有在18個核苷酸的區(qū)段上與seqidno.2、3、5、6、8、9、10、11和12的差異不超過5個核苷酸的核苷酸序列。

可以使用任何適合的方法例如磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自動化實(shí)施方案來制備寡核苷酸引物。在一個這樣的自動化實(shí)施方案中，使用二乙基亞磷酰胺作為起始材料，并且它可以如beaucage等(1981)tetrahedronletters22:1859-1862所述來合成。在美國專利no.4,458,006中描述了一種用于在改性的固體支持物上合成寡核苷酸的方法。也可以使用從生物來源(例如限制性內(nèi)切酶消化物)分離的引物。優(yōu)選的引物具有約6-100個堿基、更優(yōu)選約20-50個堿基、最優(yōu)選約20-40個堿基的長度。

使用實(shí)時pcr的dna定量

在pcr期間，dna的量理論上隨著每個循環(huán)而加倍。在每個循環(huán)后，dna的量是循環(huán)前的兩倍。

優(yōu)選使用外部標(biāo)準(zhǔn)品來確定未知樣品中dna的絕對量。標(biāo)準(zhǔn)品通常非常類似于未知樣品；標(biāo)準(zhǔn)品的引物結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)該與靶序列中的相同。這確保標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品兩者中的靶標(biāo)以等同的效率被擴(kuò)增，這對于定量來說是必需的。

使用實(shí)時pcr技術(shù)，在實(shí)時pcr熱循環(huán)儀中檢測并測定熒光，與產(chǎn)物的指數(shù)增加相對應(yīng)的熒光的幾何增加被用于確定每個反應(yīng)中的循環(huán)閾值(ct)。

將未知樣品和每個標(biāo)準(zhǔn)品在獨(dú)立的管中進(jìn)行擴(kuò)增。使用不同的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(ct值/交點(diǎn)對標(biāo)準(zhǔn)品的量的對數(shù)作圖)。將未知樣品的ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，允許計(jì)算靶標(biāo)的初始量。重要的是為待定量的核酸的類型選擇適合的標(biāo)準(zhǔn)品。為了產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)該對至少5個不同的量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，并且未知靶標(biāo)的量應(yīng)該落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍之內(nèi)。因此，在一個實(shí)施方案中，還執(zhí)行上述定量步驟。

本發(fā)明還涉及基因組中的多拷貝基因座用于檢測和/或定量所述基因組的核酸的用途，其中理想情況下，所述多拷貝基因座不是重復(fù)元件。在一個實(shí)施方案中，所述多拷貝基因座的用途旨在按照本文中引述的方法檢測和/或定量核酸，或用于分析人類dna的降解狀態(tài)。

法醫(yī)科學(xué)家常常應(yīng)對來自于不同來源的案例工作樣品。這些樣品由于不同因素例如環(huán)境脅迫而可能降解。

本發(fā)明還涉及與現(xiàn)有技術(shù)方法相比具有更高靈敏度和準(zhǔn)確性的人類dna降解標(biāo)志物系統(tǒng)。

從文獻(xiàn)中已知，可以通過在同一反應(yīng)容器中通過qpcr靶向至少兩個不同的基因組區(qū)域來評估dna的完整性。這兩種共同擴(kuò)增的靶標(biāo)必須具有不同的長度，但是使用未降解dna的擴(kuò)增效率必須相等。因此，如果dna未被降解，則較短和較長的pcr系統(tǒng)兩者將以相同的效率被擴(kuò)增。如果所分析的dna受損，則樣品中存在的dna片段的平均長度將下降，這導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低。由于較長系統(tǒng)的模板dna在統(tǒng)計(jì)學(xué)上比較短系統(tǒng)的模板更容易受損，因此，較長pcr系統(tǒng)的擴(kuò)增效率將比較短系統(tǒng)的效率低。隨著樣品中平均片段長度的降低，兩種pcr系統(tǒng)之間擴(kuò)增效率的差距將增加。因此，兩種pcr系統(tǒng)的定量的比率給出了關(guān)于待分析dna的降解狀態(tài)的信息。

在下面的圖8中顯示了一個實(shí)例。在rotor-geneq的深紅色通道中使用“蝎型探針和引物降解”(seqidno.53和54)來瞄準(zhǔn)較長pcr系統(tǒng)，產(chǎn)生了363bp的pcr產(chǎn)物。在相同儀器的綠色通道中使用上面概述的引物和蝎型探針來瞄準(zhǔn)較短pcr系統(tǒng)，產(chǎn)生了146bp的pcr產(chǎn)物。顯示了未受損的dna樣品與降解的dna樣品的(在約500、300和150bp的平均片段長度上)定量的比較。在圖9中給出了使用兩種pcr系統(tǒng)的定量。兩種定量的比率是表示待分析dna的降解狀態(tài)的可能解決方案。較高的比率指示所分析dna的較高的降解程度；也參見圖9.

優(yōu)選情況下，基因座與seqidno.1或52的序列在80個堿基對的區(qū)段上具有至少80％的序列同一性。序列同一性可以按照上面所概述的來確定。

本發(fā)明還涉及用于檢測和/或定量人類核酸的試劑盒，其中所述試劑盒包含引物，所述引物在嚴(yán)緊的條件下與在50個堿基對的區(qū)段上與seqidno.1或52的序列具有至少80％的序列同一性的序列結(jié)合。結(jié)合條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且可以在《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(currentprotocolsinmolecularbiology),johnwiley&sons,n.y.,6.3.1-6.3.6,1991中找到。嚴(yán)緊的條件可以被定義為等同于在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)中在45℃下雜交，然后在0.2xssc、0.1％sds中在65℃下洗滌。在優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑盒旨在按照本文中引述的方法檢測和/或定量核酸。

優(yōu)選情況下，試劑盒中的至少一個引物具有在18個核苷酸的區(qū)段上與seqidno.2、3、5、6、8、9、10、11和12的差異不超過5個核苷酸的核苷酸序列。

實(shí)施例

本發(fā)明的極大優(yōu)點(diǎn)是可以產(chǎn)生允許進(jìn)行dna定量和/或檢測并且不論性別、種族或地區(qū)背景如何都能起作用的引物和探針。這提供了超過現(xiàn)有技術(shù)的極大優(yōu)勢。

人類dna的擴(kuò)增與分子診斷學(xué)以及法醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域相關(guān)。在法醫(yī)學(xué)方法中，通過擴(kuò)增dna的某些區(qū)域來進(jìn)行dna分型。這些區(qū)域通常被稱為短串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。為了獲得正確結(jié)果，必需施加具有一定的狹窄濃度范圍的模板dna。知道向反應(yīng)添加的dna的準(zhǔn)確量對其來說是重要的其他領(lǐng)域，是hla分型以及單核苷酸多態(tài)性(snp)分析。執(zhí)行hla分型是為了分析移植物是否會被排斥。snp分析通常被用于分析個體的遺傳背景以例如評估遺傳疾病，以及用于分析個體是否對某些癌癥類型易感。

此外，在與本發(fā)明方法相似的某些現(xiàn)有方法中，待擴(kuò)增基因座的多個拷貝以串聯(lián)重復(fù)基序的形式位于一條染色體上，并且在群體中存在不同的變體，這引起不同的結(jié)果。盡管這未得到證明，但它似乎是解釋現(xiàn)有測試的缺點(diǎn)的一種方式。在上面也概述過的常用擴(kuò)增方法是hda方法。美國專利us7,662,594在圖6中顯示了在使用過多dna時獲得的擴(kuò)增結(jié)果。因此，顯然在某些擴(kuò)增方法中，需要知道向反應(yīng)添加的dna的準(zhǔn)確量，并且這對于所述反應(yīng)的成功而言是必需的。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于下述事實(shí)，即，能夠提供來自于多個拷貝、特別是來自于不同染色體的可重復(fù)的擴(kuò)增的這種基因組區(qū)域，最初通過檢索文獻(xiàn)來鑒定，這被證明是無用的，后來通過檢索數(shù)據(jù)庫來鑒定，這也不是非常有幫助的，其中沒有基因座位于x或y染色體之一上。本發(fā)明人從通用轉(zhuǎn)錄因子iih亞基2基因(gtf2h2)開始鑒定到了另一個序列，然而該序列不是該基因的一部分。鑒定到的dna區(qū)域?yàn)榧s2000bp大小，并位于11號染色體上(pos.69000bp-71000bp)。所述序列被示出在圖6的seqidno.1中。在整個基因組中都可以找到與在11號染色體上鑒定到的序列具有高序列同一性的其他序列。

seqidno.2

ht-for1(5’-agtgggtctggagaggccgacttg-3’)

seqidno.3

ht-rev1(5’-tcaggcccatggggctcattcct-3’)

上面鑒定到的引物實(shí)現(xiàn)的擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增了分布于整個人類基因組中的29個基因座(參見圖1)。還為等溫反應(yīng)合成了作為引物以及探針的其他寡核苷酸。為了在本文所發(fā)明的多拷貝靶標(biāo)與單拷貝靶標(biāo)之間進(jìn)行定量pcr的比較，產(chǎn)生了下列引物和探針。

ht-for1和ht-rev1以及探針ht-pro1(5’-fam-ttctgggcccggagaggccgc-bhq1-3’)(seqidno.4)

所述比較在本發(fā)明的方法與使用cmyc基因的單拷貝基因定量之間進(jìn)行。與cmyc相反，存在27個可以用上面概述的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增和探測的基因座。所述反應(yīng)包含下列組分。

1xquantitectmultiplexmastermix(qiagen)

400nmht-for1bzw.cmyc-fwd

400nmht-rev1bzw.cmyc-rev

200nmht-pro1bzw.cmyc探針

0至10,000個拷貝的人類基因組dna

使用rotorgene6000(qiagen)對反應(yīng)進(jìn)行循環(huán)，利用了下列pcr模式：95℃10分鐘，然后進(jìn)行40個循環(huán)，其中每個循環(huán)由95℃10秒和60℃45秒構(gòu)成。對于兩種引物系統(tǒng)來說，pcr效率相同。ht-for1/rev1-pcr的歸一化探針熒光比cmyc-pcr反應(yīng)的探針熒光早4.2±0.2個循環(huán)達(dá)到給定閾值。將這往回計(jì)算到模板濃度，這計(jì)算出ht-for1/rev1反應(yīng)與cmyc反應(yīng)相比，dna擴(kuò)增模板的濃度高18倍。這不等于27:1的理論比率，但非常接近。

還使用hda方法對多拷貝基因座進(jìn)行了等溫?cái)U(kuò)增。為等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生了許多不同的正向和反向引物。最佳組合是ht-for2(5’-gcagaaggtgggcctggagagtttgac-3’；seqidno.5)和ht-rev2(5’-ccttttttggcccagttcctgtccagc-3’；seqidno.6)。反應(yīng)產(chǎn)物的檢測可以作為終點(diǎn)測定以及實(shí)時測定兩者來進(jìn)行。hda反應(yīng)包含下列組分。

20mmtris/hclph8.8

40mmnacl

10mmkcl

400nmdntp混合物

3mmdatp

4mmmgcl2

0.2xevagreen

1.75μlisoampenzymmix(biohelix)

100nmht-for2

100nmht-rev2

0至10,000個拷貝的人類基因組dna

該溶液被分配成：

預(yù)混物i：15μl體積[ht-for2；ht-rev2；evagreen；人類基因組dna；h2o]

預(yù)混物ii：8μl體積[tris/hclph8.8；nacl；kcl；dntp混合物；datp；酶混合物；h2o]

起始溶液：2μl50mmmgcl2

反應(yīng)如下進(jìn)行：

將15μl預(yù)混物i在pcr循環(huán)儀中在95℃下溫育2分鐘。然后將反應(yīng)冷卻至4℃，然后使用esequanttubescanner(qiagengmbh)再次加熱至65℃。在1分鐘后，向預(yù)溫的預(yù)混物i加入8μl預(yù)混物ii，并將反應(yīng)物混合。在另外1分鐘后，啟動hda反應(yīng)，并在65℃下溫育60分鐘。在溫育完成后，使用12％聚丙烯酰胺凝膠分析結(jié)果，然后將該凝膠用溴乙錠染色。結(jié)果顯示在圖2中。第4道顯示出非常強(qiáng)的dna條帶，大小為約90bp。這與計(jì)算得到的88bp的擴(kuò)增子長度非常符合。第3道中顯示了陰性對照。陰性對照未顯示出大小為約90bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。還進(jìn)行了另一個實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)顯示出所述反應(yīng)也可以繼之以另外的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針ht-pro2(5’-fam-ggaagttttgggcctacattggccgccatg-bhq1-3’)(seqidno.7)。

圖3顯示了與上面概述的反應(yīng)相類似地執(zhí)行的實(shí)時hda反應(yīng)。僅有的差別是添加60nm標(biāo)記的探針ht-pro2，并且引物濃度不同(40nmht-for2，120nmht-rev2)。圖3顯示，使用人類基因組dna作為擴(kuò)增模板的hda反應(yīng)運(yùn)行得很好。在約25分鐘后，熒光信號強(qiáng)烈升高。這是寡核苷酸探針ht-pro2與被擴(kuò)增的靶標(biāo)相結(jié)合的結(jié)果。

作為定量實(shí)時pcr實(shí)驗(yàn)，執(zhí)行了其他實(shí)驗(yàn)。

使用了下列寡核苷酸：

ht-for3(5’-aaggtgggcctggagagttt-3’)(seqidno.8)

ht-rev3(5’-ccttttttggcccagttcctgt-3’)(seqidno.9)

ht-pro3(5’-hex-aagttttgggcctacattggccgc-bhq1-3’)(seqidno.10)

這些引物和探針雜交于人類基因組中的14個基因座并擴(kuò)增所述基因座。

模板是使用qiaampmaxi試劑盒(qiagen)從5位男性和5位女性的edta處理過的血液分離的基因組dna。

該反應(yīng)包含下列組分：

1xquantitectmultiplexroxmastermix

400nmht-for3

400nmht-rev3

200nmht-pro3

每個反應(yīng)10pg至10ng人類gdna

pcr模式如下：在95℃下15min初始溫育后執(zhí)行50個循環(huán)，其中每個循環(huán)由95℃1min和60℃1min構(gòu)成。pcr擴(kuò)增熒光曲線顯示在圖4中。

在同一實(shí)驗(yàn)內(nèi)，分析了本發(fā)明的多拷貝測定法與現(xiàn)有技術(shù)的單拷貝方法相比是否有優(yōu)勢。將hex通道中ht-for3/ht-rev3/ht-probe3測定法(多拷貝)的熒光信號與fam通道中cmyc測定法(單拷貝)的信號進(jìn)行比較。結(jié)果顯示在圖5中。多拷貝測定法的熒光信號比單拷貝cmyc測定法的熒光信號早4.2±0.2個循環(huán)跨過閾值水平。這經(jīng)計(jì)算表明多拷貝靶標(biāo)的濃度是單拷貝靶標(biāo)的18倍。因此，該實(shí)驗(yàn)良好地反映出多拷貝基因座測定法理論上的14個不同的結(jié)合基因座。

此外，本發(fā)明和序列seqidno.1和52可用于分析樣品中人類dna的降解。對于所述應(yīng)用來說，優(yōu)選的探針和引物如下。

多拷貝靶標(biāo)的另一個令人吃驚的應(yīng)用是作為參比基因用于拷貝數(shù)變異(cnv)分析。

拷貝數(shù)變異(cnv)，即基因組中dna拷貝數(shù)的變化，最近已被表明是廣泛存在的現(xiàn)象，其影響約10-20％的人類基因組。已將cnv的出現(xiàn)與多種疾病例如孤獨(dú)癥、自體免疫障礙和癌癥相關(guān)聯(lián)。

用于發(fā)現(xiàn)cnv的最常用的分子生物學(xué)工具是微陣列分析和下一代測序(ngs)。這兩種高通量方法能夠發(fā)現(xiàn)多個潛在的cnv，其隨后需要使用獨(dú)立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。一旦得到驗(yàn)證，就可以在大量樣品中對證實(shí)的cnv進(jìn)行檢查，以鑒定cnv與表型之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的關(guān)聯(lián)性。

由于易于使用、靈敏和可縮放性，定量pcr(qpcr)通常是被選擇用于cnv驗(yàn)證和相關(guān)研究的方法。對于這種應(yīng)用來說，使用相對定量原理：首先必須確定參比基因，所述參比基因的拷貝數(shù)被假定在待比較的樣品之間是恒定的。然后根據(jù)不同樣品中目標(biāo)基因(goi)與參比基因的cq差值來計(jì)算goi的拷貝數(shù)。

由于參比基因的恒定的拷貝數(shù)為基于qpcr的cnv定量所必需的，因此我們將常用的單拷貝參比基因例如tert(端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶)的可靠性與使用多拷貝靶標(biāo)的新方法進(jìn)行比較。作為參比靶標(biāo)的多拷貝靶標(biāo)與單拷貝基因相比，提供了更靈敏和可靠的cnv定量結(jié)果。

對于拷貝數(shù)判定來說，單拷貝基因是不太可靠的參比基因。tert，一種通常作為參比基因用于基于qpcr的cnv驗(yàn)證的單拷貝基因，其本身經(jīng)歷拷貝數(shù)變異；參見圖10。

該圖顯示了tert基因以及5個已知的cnv在5號染色體上的位置?；诨蚪M變體數(shù)據(jù)庫(databaseofgenomicvariants)(http://projects.tcag.ca/cgi-bin/variation/gbrowse/hg19/？name＝chr5:1211340..1337106)的信息。

此外，在dbsnp數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)中記載有517個tert單核苷酸多態(tài)性(snp)。被qpcr引物或探針?biāo)R別的cnv參比基因序列中的snp，可以引起qpcr效率降低以及cq值較晚獲得，并隨后引起錯誤的拷貝數(shù)判定。

通過使用分布于整個基因組中的多拷貝遺傳元件代替單拷貝基因作為參比基因用于δδcq分析，可以實(shí)現(xiàn)更可靠的基于qpcr的拷貝數(shù)定量。

下面的理論計(jì)算說明了從cnv參比基因損失或增加1個拷貝對參比基因的cq值以及goi的拷貝數(shù)判定的影響。假設(shè)包括：參比基因和goi的qpcr效率為100％；goi是單拷貝基因，單拷貝基因的拷貝數(shù)在測試樣品中不改變(nc)。cnv定量參比基因是18個拷貝的遺傳元件或單拷貝基因；參見圖11。

從單拷貝參比基因損失或增加一個拷貝，將引起錯誤的goi拷貝數(shù)判定。從多拷貝參比基因損失或增加一個拷貝不影響goi拷貝數(shù)判定。

基于sybrgreen的qpcr準(zhǔn)確地定量goi和多拷貝靶標(biāo)參比元件。

這種方法依賴于在同一實(shí)驗(yàn)中運(yùn)行的goi和多拷貝靶標(biāo)兩者的cq值的比較。用于這些實(shí)驗(yàn)的引物是seqnr.8和seqnr.9。

基于探針的qpcr準(zhǔn)確地同時定量goi和多拷貝靶標(biāo)參比元件。這種方法依賴于雙路的、基于探針的qpcr方法，其準(zhǔn)確地在一個qpcr反應(yīng)中定量goi和多拷貝靶標(biāo)兩者。

用于這些實(shí)驗(yàn)的引物和探針是seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10；也參見圖12。

序列表

<110>凱杰有限公司

<120>用于檢測和/或定量人類dna的方法

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