本發(fā)明屬于生物技術的應用領域，涉及到一種高保真快速擴增融合酶以及其制備方法，特別但不限于應用于超長序列擴增和測序。
背景技術：
：DNA聚合酶是基因工程領域常見的一大類工具酶，被廣泛應用于分子克隆、探針標記、鏈或引物延伸、補平或抹平以及核苷酸測序等許多領域。它有4大類型，其中A型和B型占多，A型和B型DNA聚合酶一部分為常用的常溫DNA聚合酶，對微量底物模板的擴增效率不高，影響了其使用范圍；一部分為常用的耐高溫DNA聚合酶，它們對微量底物模板的擴增效率非常高，可以通過PCR將底物模板在很短的時間內(nèi)將模板量增加幾百到幾千萬倍，因而在生物醫(yī)學領域有較廣泛的應用。比較常見的DNA聚合酶為TaqDNAPolymerase、PfuDNAPolymerase、KodDNAPolymerase、VentDNAPolymerase、DeepVentDNAPolymerase等。根據(jù)相關文獻記載，TaqDNAPolymerase無3，-5，外切酶活性，在PCR循環(huán)中，產(chǎn)生的錯誤堿基的滲入率較高，突變率為2x10-5/堿基/循環(huán)，DNA聚合時的延伸速度為1kb左右/min，95℃時半衰期40分鐘左右；PfuDNAPolymerase有3，-5，外切酶活性，在PCR循環(huán)中，產(chǎn)生的錯誤堿基的滲入率中等，突變2.5x10-6/堿基/循環(huán)，DNA聚合時的延伸速度為0.6kb左右/min，95℃溫浴1小時仍然有90%以上的酶保持活性；KodDNAPolymerase有3，-5，外切酶活性，在PCR循環(huán)中，產(chǎn)生的錯誤堿基的滲入率中等，突變率為2.0x10-6/堿基/循環(huán)，DNA聚合時的延伸速度為2kb左右/min，100℃溫浴1小時仍然有70%以上的酶保持活性；VentDNAPolymerase有3，-5，外切酶活性，在PCR循環(huán)中，產(chǎn)生的錯誤堿基的滲入率中等，突變率為4x10-6/堿基/循環(huán)，DNA聚合時的延伸速度為1kb左右/min，95℃溫浴1小時仍然有90%以上的酶保持活性；DeepVentDNAPolymerase有3，-5，外切酶活性，它的錯誤堿基的滲入突變率和延伸速度與VentDNAPolymerase相似，但是耐熱性更高，95℃時半衰期長達8小時左右。以上的幾種用于PCR擴增的DNA聚合酶，在突變率，耐熱性和延伸速度，要么有缺點，要么整體上這幾個方面的性能并不十分突出，而這三個方面是該酶是否適用于超長序列擴增和測序，快速獲得最佳效果和準確數(shù)據(jù)的關鍵指標。技術實現(xiàn)要素：發(fā)明目的：為了克服以上不足，本發(fā)明的目的在于優(yōu)化設計并表達純化出具有較低突變率和較高延伸速度的高性能PCR反應及測序用融合酶，以及其制備方法，并進一步提供了該高保真快速擴增融合酶的氨基酸和基因編碼信息，特別應用于超長序列擴增和測序。技術方案：為了克服現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明提供了一種高保真快速擴增融合酶，包括在高溫條件下能夠與模板和引物結(jié)合的非特異性雙鏈結(jié)合區(qū)的氨基酸序列，以及經(jīng)過多步生物技術方法改造后的嗜熱古細菌DNA聚合酶的氨基酸序列。本發(fā)明所述的高保真快速擴增融合酶包括可以與DNA模板或引物結(jié)合的非特異性雙鏈結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)含有在高溫條件下仍然具有較高的核酸結(jié)合能力的氨基酸基序列；同時含有經(jīng)過多步生物技術方法改造后的嗜熱古細菌DNA聚合酶氨基酸序列，以提高PCR擴增效率和保真度。其中，嗜熱古細菌DNA聚合酶的氨基酸基序列來源于高溫溫泉的嗜熱古細菌，可以在高溫下仍保持高活性。此外，嗜熱古細菌DNA聚合酶的氨基酸基序列通過生物技術方法改造后，含有多個突變、缺失或插入位點的特異性序列，可以增加了PCR過程中核苷酸鏈的延伸速度；同時增加了識別滲入產(chǎn)物鏈中錯誤堿基的識別能力，保真性好；而且還增加切除產(chǎn)物鏈中錯誤堿基的3，-5，外切酶的活性，避免了單純3，-5，外切酶活性的增加而導致核苷酸鏈的延伸速度大大下降。其中，非特異性雙鏈結(jié)合區(qū)是指在PCR反應體系中能夠與DNA模板和引物非特異性相結(jié)合的蛋白結(jié)構(gòu)域，減少有限PCR反應體系中游離DNA聚合酶和引物的數(shù)量，增加該DNA聚合酶與模板和引物結(jié)合幾率，從而該酶在依賴模板和引物的條件下快速延伸，同時非特異性雙鏈結(jié)合區(qū)在下一輪變性的過程中與模板和引物的解離，開始新一輪的變性解離，退火結(jié)合和延伸的過程，因而增加了該酶在PCR過程中核苷酸鏈的延伸速度。通過與DNA模板或引物結(jié)合的非特異性雙鏈結(jié)合區(qū)的序列和含有多個突變、缺失或插入位點的特異性序列的嗜熱古細菌DNA聚合酶連接起來制備成的融合酶，可以特別應用于超長序列擴增和測序所要求的高保真快速擴增。進一步的，上述的高保真快速擴增融合酶，所述融合酶包括在高溫條件下能夠與模板和引物結(jié)合的非特異性雙鏈結(jié)合區(qū)的核苷酸序列，以及經(jīng)過多步生物技術方法改造后的嗜熱古細菌DNA聚合酶的核苷酸序列。通過對嗜熱古細菌DNA聚合酶的核苷酸序列進行生物技術方法改造，以改變其氨基酸列序，增強其特異性功能。進一步的，上述的高保真快速擴增融合酶，所述非特異性雙鏈結(jié)合區(qū)含有SEQIDNO.1所顯的核苷酸序列的一個或幾個或全部功能區(qū)域。進一步的，上述的高保真快速擴增融合酶，所述經(jīng)過多步生物技術方法改造后的嗜熱古細菌DNA聚合酶的核苷酸序列含有SEQIDNO.2所顯的核苷酸序列的一個或幾個或全部功能區(qū)域。進一步的，上述的高保真快速擴增融合酶，所述融合酶含有核苷酸序列SEQIDNO.3，所述SEQIDNO.3含有SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所顯的核苷酸序列的一個或幾個或全部功能區(qū)域，并連接到原核表達質(zhì)粒的啟動子下而形成表達載體。進一步的，上述的高保真快速擴增融合酶，所述融合酶的氨基酸序列含有SEQIDNO.4所顯的氨基酸序列的一個或幾個或全部功能區(qū)域。進一步的，上述的高保真快速擴增融合酶，所述生物技術方法改造包括嗜熱古細菌DNA聚合酶的氨基酸序列中缺失、插入、替換一個或多個氨基酸。通過在嗜熱古細菌DNA聚合酶的氨基酸序列中多位點的缺失、插入、替換一個或多個氨基酸，以改變其氨基酸列序，其效果有些或增加了PCR過程中核苷酸鏈的延伸速度，或增加了識別滲入產(chǎn)物鏈中錯誤堿基的識別能力，或增加切除產(chǎn)物鏈中錯誤堿基的3，-5，外切酶的活性，這樣就避免了3，-5，外切酶活性的單獨增加而導致核苷酸鏈的延伸速度大大下降。進一步的，上述的高保真快速擴增融合酶，所述生物技術方法改造包括嗜熱古細菌DNA聚合酶的核苷酸序列中缺失、插入、替換一個或多個核苷酸。通過在嗜熱古細菌DNA聚合酶的核苷酸序列中多位點的缺失、插入、替換一個或多個核苷酸，以改變其氨基酸列序，其效果有些或增加了PCR過程中核苷酸鏈的延伸速度，或增加了識別滲入產(chǎn)物鏈中錯誤堿基的識別能力，或增加切除產(chǎn)物鏈中錯誤堿基的3，-5，外切酶的活性，這樣就避免了3，-5，外切酶活性的單獨增加而導致核苷酸鏈的延伸速度大大下降。本發(fā)明還提供一種高保真快速擴增融合酶的制備方法，包括以下步驟：（1）嗜熱古細菌DNA聚合酶的核苷酸序列進行多步生物技術方法改造；（2）將非特異性雙鏈結(jié)合區(qū)的核苷酸序列與步驟（1）中的核苷酸序列融合在一起；（3）將步驟（2）的核苷酸序列連接到表達載體；（4）轉(zhuǎn)化到表達菌株，進行誘導表達；（5）所述菌株經(jīng)超聲破碎、離心收集、過濾除顆粒和多步純化，得所述高保真快速擴增融合酶。本發(fā)明所述的高保真快速擴增融合酶的制備方法，方法合理，制備的高保真快速擴增融合酶純度為98%以上的高活性蛋白，PCR擴增保真度在10-7級別，比常規(guī)的Taq、Pfu、Kod等的保真度明顯高1-2個數(shù)量級，并且其可以在較短的2分鐘內(nèi)一次PCR擴增長度可以達到20kb左右。為獲得比較好的表達效果，為下一步純化打下比較好的基礎，取所述的重組轉(zhuǎn)化菌株，表達時采用溫度梯度和IPTG誘導劑梯度。通過20ml的小規(guī)模試驗，同時設置非誘導對照，之后收集菌體，超聲破碎，離心收集上清，上清全菌進行SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE電泳所顯示的大小在100道爾頓左右。再根據(jù)電泳的結(jié)果確定最佳的表達條件。作為一種優(yōu)選上述的溫度梯度和IPTG誘導劑梯度的范圍為溫度25-37℃；誘導試劑IPTG誘導劑梯度范圍為0.1-1mM。此外，為保持重組載體在表達菌株中的存在；維持菌體對目的蛋白活性和自生穩(wěn)定的需要，必要在重組菌株培養(yǎng)和誘導目的蛋白表達的過程中加入一種或幾種濃度的抗生素，其中羧芐青霉素的濃度為80-120μg/ml；氯霉素的濃度在10-40μg/ml。經(jīng)過在重組質(zhì)粒在特異性表達菌株中放大培養(yǎng)和誘導表達、離心收集菌體、超聲破碎、過濾除顆粒、親和純化、脫鹽、離子交換和凝膠過濾、濃縮等多個步驟，得到高純度的高保真快速擴增融合酶，該融合酶尤其適用于超長核酸序列擴增和測序。此外，在多個純化步驟中，采用特異性重組表達菌株，并添加了穩(wěn)定試劑，如還原試劑、蛋白酶抑制試劑、去污試劑以及合適無機鹽的種類和濃度，以便該融合酶在多步驟純化過程中，依然可以使得絕大多數(shù)融合酶保持完整性以及保持其接近天然的正確空間構(gòu)象。并且，在多個純化步驟中，采用親和層析，離子交換，分子篩，高鹽洗滌等多種措施，降低表達菌株自身蛋白的核酸酶、基因組以及其它宿主蛋白等雜質(zhì)殘留，以提高該融合酶的品質(zhì)和質(zhì)量，使其可以分子生物學和基因工程領域得到廣泛應用。通過超長片段的PCR擴增和藍白篩選方法，來驗證該融合酶具有高超的核苷酸鏈延伸速度和相當?shù)偷耐蛔兟?，從而進一步說明該融合酶可以用來做超長序列擴增和測序。進一步的，上述的高保真快速擴增融合酶的制備方法，通過構(gòu)建含有SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所顯的核苷酸序列的一個或幾個或全部區(qū)域，采用重疊PCR技術，將SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所合成兩個片段的核苷酸酸序列和連接肽進行拼接，經(jīng)過測序正確后連接到表達載體中。將構(gòu)建好的表達載體，轉(zhuǎn)化到既可以補充稀有密碼子，又可以增加目的蛋白可溶性，同時又可以減少異源蛋白對宿主大腸桿菌毒性的特異性表達菌株中。有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明所述的高保真快速擴增融合酶，保真度高，擴增速度快，在高溫條件下活性好，并且可以特別用于20Kb左右的超長序列擴增和測序，應用前景廣闊。附圖說明圖1含有融合酶的核苷酸序列的重組表達載體雙酶切電泳圖，濃度0.8%瓊脂糖凝膠，Line1:RecombinantVectorDigestedwithNdeI/BamHI.Line2:DNAMarker10000pb、5000pb、3000pb、2000pb、1500pb、1000pb、750pb、500p、250pb；圖2融合酶表達條件優(yōu)化小實驗，超聲離心收集上清總蛋白SDS-PAG電泳圖，Line1:ProteinMarker116Da、66.2Da、45Da、35Da、25Da；Line2:Control為未誘導的重組表達菌株、37℃；Line3:1mMIPTG、30℃、5小時；Line4:0.5mMIPTG、30℃、5小時；Line5:0.5mMIPTG、37℃、5小時；Line6:1mMIPTG、37℃、5小時；圖3融合酶親和柱純化上樣和清洗圖，2L發(fā)酵液離心收集，超聲離心收集上清，溶解于（50mMNaH2PO4,500mMKCl,10MmImidazole2mMDTT,1mMPMSF,0.5mMEDTApH8.0）溶液；Protio?NI-NTA10ml預裝柱,上樣流速1ml/min；（50mMNaH2PO4,500mMKCl,20mMImidazole,2mMDTTpH8.0）溶液洗滌，流速4ml/min；圖4融合酶親和柱純化洗脫圖，溶液A：50mMNaH2PO4,500mMKCl,20mMImidazole2mMDTTpH8.0；溶液B;50mMNaH2PO4,500mMKCl,500mMImidazole2mMDTTpH8.0；洗脫流速4ml/min，0-50%，15分鐘梯度；圖5融合酶純化SephdexG-25柱脫鹽圖，BXK26mm/400柱(200ml填料)，平衡/洗脫液：20mMTris-HClpH7.0，上樣體積40ml，上樣流速2ml/min，洗脫流速5ml/min；圖6融合酶純化SP陽離子柱洗脫圖，BXK26mm/100柱(30ml填料)，溶液A/平衡液：20mMTris-HClpH7.0，溶液B：1MNaCl,20mMTris-HClpH7.0，上樣體積45ml，上樣流速1.5ml/min，洗脫流速4ml/min，0-100%，20分鐘梯度洗脫；圖7融合酶純化Superdex200柱分離圖，BXK26mm/700柱(340ml填料)，平衡/洗脫液：(40mMTris-HCl,0.2mMEDTA,200mMKCl,2mMDTT,pH7.4)，上樣體積8ml，流速1ml/min，洗脫流速1ml/min；圖8最終濃縮后的SDS-PAG電泳圖，膠厚度0.75cm，濃縮膠5%，80v電泳；10%的分離膠，120v電泳，Line1:ProteinMarker116Da;66Da,45Da;Line2:純化Sample(5μg);Line3:純化Sample(2μg)；圖9融合酶核酸內(nèi)切酶殘留檢測圖；濃度0.8%瓊脂糖凝膠，Line1:DNAMarker5000bp;4000pb;3000pb;1500pb;500pb;Line2,3,4,5:?X174DNARFI；圖10-11融合酶基因組殘留檢測圖，其中，圖10為擴增曲線，橫坐標為CT值，縱坐標為熒光吸收值；圖11為標準曲線橫坐標為拷貝數(shù)，縱坐標為CT值，1:超純水、2:稀釋液、3:800μg/ml融合酶液、4:80μg/ml融合酶液；圖12融合酶對超長片段的PCR擴增效果圖，以λ噬菌體的全長基因組為模板，在2分鐘的延伸時間可以擴增得到20kb的PCR產(chǎn)物,DNAMarker為λDNA-HindIII。具體實施方式下面將通過幾個具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，這些實施例只是為了說明問題，并不是一種限制。材料：pET15b(+)載體、限制性內(nèi)切酶NdeI/BamHI、LB液體培養(yǎng)基、羧芐青霉素、氯霉素、IPTG誘導試劑、Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、SephdexG-25、Superdex200凝膠過濾介質(zhì)、SPSepharose4FF陽離子純化介質(zhì)、Protio?NI-NTA10ml預裝柱等及其他常規(guī)分析純試劑。實施例1：融合酶基因工程菌的建立1、融合酶基因序列的合成采用全基因合成的重疊PCR延伸方法，利用高保真酶合成SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所顯示的核苷酸序列，將兩部分所顯示的核苷酸序列，通過6個氨基酸(GTGGGG)所組成的連接肽相連接，以便于表達純化出來的融合酶的兩個功能區(qū)保持原有蛋白的天然構(gòu)象，發(fā)揮各個功能區(qū)原有的分子生物學功能。2、表達載體的構(gòu)建再將以上所述兩部分功能區(qū)和連接肽通過引物重疊PCR連接起來的過程中，對全長片段進行連接時，在上下游引物的兩端分別加上NdeI（CATATG）/BamHI(GGATCC)兩個限制性內(nèi)切酶的酶識別和切割位點，同時在下游引物上加上終止密碼子。全長擴增后，得到SEQIDNO.3所示全長序列，經(jīng)過雙酶切連接到pET15b(+)載體的NdeI（CATATG）/BamHI(GGATCC)兩個位點之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5alpha。在500μlLB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)0.5小時，離心涂布于含有終濃度100μg/ml羧芐青霉素的LB固體平板上，37℃過夜培養(yǎng)24小時，挑選單菌落，抽提重組質(zhì)粒，進行測序和進行雙酶切鑒定，其情況如圖1所示，選擇序列正確的重組質(zhì)粒.3、基因工程菌的制備經(jīng)過測序雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到制備的高效感受態(tài)大腸桿菌表達菌株Rosetta-GamiB(DE3)pLysS中，在500μlLB培養(yǎng)基中，37℃，80rpm培養(yǎng)10分鐘，再230rpm培養(yǎng)20分鐘，離心涂布于含有終濃度100μg/ml羧芐青霉素和30μg/ml氯霉素的LB固體平板上，37℃過夜培養(yǎng)24小時，待長出肉眼可見的單菌落時，4℃保存待用。實施例2：融合酶表達條件的確立為獲得比較大的產(chǎn)量和同時方便純化，挑選基因工程菌單菌落于含有終濃度100μg/ml羧芐青霉素和30μg/ml氯霉素的20ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。第二天在5個50ml的培養(yǎng)管中加入含有終濃度100μg/ml羧芐青霉素和30μg/m氯霉素的20mlLB液體培養(yǎng)基，將含有過夜培養(yǎng)基因工程菌的液體培養(yǎng)基按照1:20的比例加入,37℃培養(yǎng)4小時，待OD600為0.8左右時，其中一個50ml培養(yǎng)管不加入IPTG誘導試劑；另外四管，兩兩各加入0.5mM和1mMIPTG，兩兩各在30℃和37℃誘導培養(yǎng)5小時。5000rpm、10分鐘、4℃離心收集和洗滌菌體，重懸于（50mMNaH2PO4,500mMKCl,10mMImidazole,2mMDTT,1mMPMSF,0.5mMEDTA,pH8）溶液中，采用HN92-II超聲破碎儀，Q2號變輻桿，放置于冰盒上，功率100伏、超聲4s、間息5s、30個循環(huán)、循環(huán)三次，再4℃、12000rp離20分鐘，取上清，-20℃凍存待用。按照膠厚度0.75cm，濃縮膠5%，80v電泳，10%的分離膠，120v電泳，進行制作小SDS-PAGE膠和電泳，考馬氏亮藍染色。電泳的結(jié)果圖2所示，根據(jù)此圖得到的目的蛋白的大小為98Da左右，與SEQIDNO.4所顯示的融合酶的蛋白大小基本一致，融合酶的最佳表達條件為1mMIPTG，37℃誘導培養(yǎng)5小時。實施例3：融合酶的純化為方便小規(guī)模純化，獲得毫克級的融合酶，滿足下一步用于融合酶的質(zhì)量控制和初步應用中實驗需求，進行2L級別的發(fā)酵培養(yǎng)，誘導和純化。2L級別的發(fā)酵培養(yǎng)和誘導的條件按照實施方法二中表達條件確立的方法進行。采用XZ-8M型大容量低溫高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司），5000rpm，5分鐘，4℃離心去菌液，收集菌體。再重懸于100ml（50mMNaH2PO4,500mMKCl,10mMImidazolepH8.0）緩沖液中，震蕩離心4℃離心收集菌體，以去除LB液體培養(yǎng)基殘留。將沉淀后菌泥重懸于以上同樣溶液中，為避免蛋白的降解，維持蛋白的構(gòu)象和避免蛋白聚集，在上述重懸中加入終濃度為2mMDTT、1mMPMSF和0.5mMEDTA，采用HN92-II超聲破碎儀，Q6號變輻桿，冰浴、功率400伏、超聲4s、間息5s、30個循環(huán)、循環(huán)五次，再4℃、10000rpm離40分鐘，取上清，采用0.45μm過濾器過濾除顆粒，-20℃凍存待用。采用APPSMV50D蛋白純化儀器（利穗科技(蘇州)有限公司）對過濾后的上清進行純化，100ml上樣，用溶液（50mMNaH2PO4,500mMKCl,20mMImidazole,2mMDTTpH8.0）洗滌到基線，Protio?NI-NTA10ml預裝親和柱咪唑梯度洗脫；SephdexG-25脫鹽柱脫鹽；SP陽離子柱離子梯洗脫；Superdex200分子篩柱分離；50ml超濾管濃縮，再加入終濃度為50%的甘油、0.5%Twen-20、0.5%NP-40和200μg/mlBSA，得到6ml(2.5mg/ml)融合酶蛋白，這些過程如圖3、圖4、圖5、圖6、圖7所顯示。按照膠厚度0.75cm，濃縮膠5%，80v電泳，10%的分離膠，120v電泳，進行制作小SDS-PAGE膠和電泳，考馬氏亮藍染色，電泳的結(jié)果圖8所示。經(jīng)過灰度掃描分析，純度大于98%。實施例4：融合酶的質(zhì)量控制和初步應用1、融合酶核酸內(nèi)切酶殘留檢測6ml(2.5mg/ml)的融合酶原液，用溶液（20mMTris-HCl0.1mMEDTA,100mMKCl,1mMDTT，50%Glycerol,0.5%Twen-20,0.5%NP-40,200ug/mlBSApH7.4）稀釋到80μg/ml。50μl的反應體系中，2μl的該融合酶與1μg?x174RFI型DNA37℃溫浴4小時，轉(zhuǎn)變?yōu)镽FII型的比例較少，不明顯。核酸電泳結(jié)果如圖9顯示，說明在純化的融合酶稀釋液中殘留的內(nèi)切酶殘留量及其少，不足以影響待擴增的模板的完整性。2、融合酶基因組殘留檢測該融合酶的表達是在大腸桿菌表達菌株Rosetta-GamiB(DE3)pLysS中經(jīng)過誘導表達后純化出來的，誘導表達時的OD600為0.8左右，此時大腸桿菌處于指數(shù)式生長期，大腸桿菌基因組的含量比較高?；蚪M拷貝數(shù)殘留量過高，會導致非特異性擴增，特別是在低拷貝模板做PCR擴增時特別明顯，例如皮克級的原核基因組測序的過程中，融合酶中含有皮克級宿主菌基因組殘留，會導致實驗結(jié)果失真。因此控制表達菌株的基因組在純化的融合酶中的殘留是融合酶質(zhì)量好壞和使用范圍大小的重要因素之一。本發(fā)明采用培養(yǎng)大腸桿菌DH5alpha，提取其基因組作為模板，5ng的基因組經(jīng)過計算大約為106拷貝，用超純水做106-100一系列10倍梯度稀釋。利用AgilentStratageneMX3000P定量PCR儀器，采用QPCR絕對定量方法方法對大腸桿菌的16sDNA片段進行擴增，其中上游引物（Primer1）為：5-AGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTT-3；下游引物（Primer2）為：5-CAGTATCAGATGCAGTTCCCAGGTT-3。反應體系為2xSYBRqPCRMix(大連寶生物)12.5μl、引物(6μM)各位1.25μl、超純水8μl、待測樣品2μl,共25μl。同時設置2μl的超純水作為空白對照、2μl融合酶稀釋液作為陰性對照。反應條件為：95℃預變性5分鐘，95℃變性20秒，55℃復性20秒，72℃延伸30秒，40個循環(huán)。40個循環(huán)結(jié)束后，以梯度稀釋的拷貝數(shù)為橫坐標，以各個梯度的CT值為縱坐標，做標準曲線，再依據(jù)待測樣品的CT值，計算出稀釋后(80μg/m)融合酶中每微升中殘留的大腸桿菌基因組的拷貝數(shù)。標準曲線中基因組拷貝數(shù)與CT值如表所顯示：拷貝數(shù)106105104103102101100CT值11.6714.6318.0721.5724.9427.930.76結(jié)果如圖10和11所顯示的擴增曲線和標準曲線，其中超純水、稀釋液、800μg/ml融合酶液、80μg/ml融合酶液的CT值均大于30。其中80μg/ml的融合酶稀釋液中含有的拷貝數(shù)小于1，該融合酶在工作濃度下宿主菌基因組殘留量較低，說明經(jīng)過親和柱洗脫；SephdexG-25脫鹽；SP陽離子柱離子梯度洗脫；Superdex200分子篩柱等分離純化后去除了絕大部分的大腸桿菌基因組核酸殘留。3、該融合酶保真度檢測在技術背景的敘述中，對TaqDNAPolymerase、PfuDNAPolymerase、KodDNAPolymerase、VentDNAPolymerase、DeepVentDNAPolymerase等常規(guī)的PCR控制酶的保真度進行了說明，除TaqDNAPolymerase在10-5外，其他幾種酶的保真度均為10-6左右，在對擴增的過程中，隨著待擴增片段長度和循環(huán)數(shù)的增加，錯誤堿基的滲入會明顯增加，因而影響了測序結(jié)果的準確性和效果。對本發(fā)明純化的融合酶采用藍白斑篩選法，對融合酶的PCR保真度進行測定，具體方法如下：從LacIOZalphaPlasmid中采用上有引物Primer3（5-GACGAATTCGTTTTCCCAGTCACGAC-3）和下游引物Primer4（5-GGTATCTTATAGTCCTGTCG-3）擴增1.4KB左右的片段，采用50μl反應體系(2mMMgCl2、0.5μM上下游引物、2.4ngLacIOZalphaPlasmid、0.02MTris-HCl、60mMKCl、10mM(NH4)2SO4、0.02%BSA、pH8.8、0.3mMdNTP),加入0.5μl的該融合酶（80μg/ml）。反應條件為：95℃預變性0.5分鐘，95℃變性10秒，56℃復性20秒，72℃延伸60秒，25個循環(huán)，再72℃保持2分鐘。該PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)過EcoRI限制性內(nèi)切酶消化，連接到λgt10型λ噬菌體載體臂上，再進行?噬菌體的包裝，轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5alpha,涂布于含有X-gal(1mg/ml)和復制版的X-gal(1mg/ml)+IPTG(1.5mM)的LB平板上，37度培養(yǎng)后，計算藍色和白色噬菌斑的數(shù)量。由于LacI有效突變區(qū)域的堿基數(shù)量在349bp左右，而且由于在絕大多數(shù)情況下，25個循環(huán)PCR后得到產(chǎn)物數(shù)量實際并不是原來理想狀態(tài)下模板的225倍，我們將25個循環(huán)后得到的產(chǎn)物分子數(shù)除以模板的分子數(shù)得到實際擴增倍數(shù)，從而得到理論狀態(tài)下的PCR循環(huán)數(shù)，再按照藍色數(shù)量/藍色和白色噬菌斑總量/349/理論PCR循環(huán)數(shù)，得出每個堿基在每次循環(huán)中產(chǎn)生突變的幾率，經(jīng)過計算該融合酶錯誤堿基的滲入突變幾率為2.3x10-7/堿基/循環(huán)。說明該融合酶具有比現(xiàn)有常規(guī)PCR擴增酶具有更低滲入突變幾率，保真度非常高。4、該融合酶對超長片段的PCR擴增效果在常規(guī)的PCR實驗中，常規(guī)PCR擴增酶的進行性、適應性和延伸速度并不高，進行性通常指在PCR延伸過程中，每個酶分子在每次催化反應過程中能夠滲入到延伸鏈末端的核苷酸分子數(shù)，通常進行性好，鏈的延伸速度也較快。KodDNAPolymerase在DNA聚合時的延伸速度為2kb/min左右，可以擴增6Kb左右的模板，但是對于大于10kb,甚至20kb以上的待擴增片段就有點力不從心。主要問題每次循環(huán)過程中需要的高溫時間較長，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，導致酶的活性逐漸下降；同時長片段的擴增也導致長片段產(chǎn)物中錯誤堿基滲入的數(shù)量明顯增加。為解決以上問題，我們經(jīng)常采用的辦法是增加酶活的穩(wěn)定性，例如在反應體系中加BSA、海藻糖、甘露醇、非離子型去污試劑、還原試劑、甘油等；優(yōu)化酶的反應體系包括離子的種類和強度、合適的緩沖體系、適當降低鎂離子的濃度、延長延伸時間等。這些方法在一定程度上對長片端的擴增帶來一定的好處，但是解決不了根本問題。該融合酶對10Kb以下的片段的擴增速度為10kb/min左右,采用50μl反應體系(2mMMgCl2,0.5μM上下游引物、λ噬菌體基因組0.5ng、0.02MTris-HCl、60mMKCl、10mM(NH4)2SO4、0.02%BSA、pH8.8、0.3mMdNTP),加入0.5μl的該融合酶（80μg/ml）。對于不同長度的待擴增目的片段，均采用的反應條件為：95℃預變性0.5分鐘，95℃變性10秒，68℃復性30秒，72℃延伸2分鐘，20個循環(huán)，再72℃保持5分鐘。擴增的效果如圖12所顯示，該融合酶的擴增效率較高，可以用于超長序列擴增和測序。擴增時所使用的引物如下:F（Primer5）5-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3R1(0.5K)（Primer6）5-TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC-3R2(1K)（Primer7）5-GATGACGCATCCTCACGATAATATCCGG-3R3(2K)（Primer8）5-CCATGATTCAGTGTGCCCGTCTGG-3R4(5K)（Primer9）5-CGAACGTCGCGCAGAGAAACAGG-3R5(8K)（Primer10）5-GCCTCGTTGCGTTTGTTTGCACG-3R6(10K)（Primer11）5-GCACAGAAGCTATTATGCGTCCCCAGG-3R7(15K)（Primer12）5-CTTGTTCCTTTGCCGCGAGAATGG-3R8(20K)（Primer13）5-TCTTCCTCGTGCATCGAGCTATTCGG-3以上對本發(fā)明具體實施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領域技術人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。SEQUENCELISTING<110>依科賽生物科技（太倉）有限公司<120>一種高保真快速擴增融合酶及其制備方法<130>2017<160>17<170>Patentversion3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>Primer1<400>1agcggggaggaagggagtaaagtt24<210>2<211>25<212>DNA<213>Primer2<400>2cagtatcagatgcagttcccaggtt25<210>3<211>26<212>DNA<213>Primer3<400>3gacgaattcgttttcccagtcacgac26<210>4<211>20<212>DNA<213>Primer4<400>4ggtatcttatagtcctgtcg20<210>5<211>20<212>DNA<213>Primer5<400>5cctgctctgccgcttcacgc20<210>6<211>28<212>DNA<213>Primer6<400>6tccggataaaaacgtcgatgacatttgc28<210>7<211>28<212>DNA<213>Primer7<400>7gatgacgcatcctcacgataatatccgg28<210>8<211>24<212>DNA<213>Primer8<400>8ccatgattcagtgtgcccgtctgg24<210>9<211>23<212>DNA<213>Primer9<400>9cgaacgtcgcgcagagaaacagg23<210>10<211>23<212>DNA<213>Primer10<400>10gcctcgttgcgtttgtttgcacg23<210>11<211>27<212>DNA<213>Primer11<400>11gcacagaagctattatgcgtccccagg27<210>12<211>24<212>DNA<213>Primer12<400>12cttgttcctttgccgcgagaatgg24<210>13<211>26<212>DNA<213>Primer13<400>13tcttcctcgtgcatcgagctattcgg26<210>14<211>189<212>DNA<213>SEQIDNO.1<400>14gctacggttaagtttaaatataagggcgaagaactggaagtggacatttctaaaatcaaa60aaagtgtggcgcgtgggcaagatgatctcttttacctatgatctgggcggcggcaaaacg120ggccgcggtgcagtgagcgaaaaagatgctcctaaagaactgctgcaaatgctggaaaaa180cagaaaaaa189<210>15<211>2334<212>DNA<213>SEQIDNO.2<400>15atggcgagcgcgattctggacaccgattacatcaccgaggatggtaaaccggtgattcgt60atcttcaagaaagagaacggcgaatttaagatcgaatatgaccgtaccttcgagccgtac120ttttatgcgctgctgaaggacgatagcgcgattgaggaagttaagaaaatcaccgcggaa180cgtcacggtaccgtggttaccgtgaagcgtgttgagaaagtgcagaagaaattcctgggc240cgtccggtggaagtttggaaactgtactttacccacccgcaagacgtgccggcgattcgt300gataagatccgtgaacacccggcggttattgacatctacgagtatgatattccgttcgcg360aagcgttacctgatcgacaaaggtctggtgccgatggagggcgatgaggaactgaagatg420ctggcgttcgacattgaaaccctgtaccacgagggcgaggaatttgcggaaggcccgatt480ctgatgatcagctatgcggatgaggaaggtgcgcgtgtgatcacctggaaaaacgtggac540ctgccgtacgttgatgtggttagcaccgaacgtgagatgattaagcgtttcctgcgtgtg600gttaaggagaaagacccggatgttctgatcacctacaacggtgacaacttcgattttgcg660tatctgaagaaacgttgcgaaaaactgggcattaactttgcgctgggtcgtgatggcagc720gagccgaaaatccagcgtatgggtgaccgtttcgcggtggaagttaagggccgtattcac780tttgacctgtacccggtgattcgtcgtaccatcaacctgccgacctacaccctggaagcg840gtgtatgaggcggttttcggtcaaccgaaggaaaaagtttatgcggaggaaatcaccacc900gcgtgggagaccggcgaaaacctggagcgtgtggcgcgttacagcatggaggatgcgaaa960gttacctatgaactgggcaaggagttcctgccgatggaagcgcagctgagccgtctggtg1020ggtcaaccgctgtgggacgttagccgtagcagcaccggcaacctggtggagtggtttctg1080ctgcgtaaagcgtacgaacgtaacgaggttgcgccgaacaagccgagcgaggaagagtac1140cagcgtcgtctgcgtgagagctataccggtggcttcgtgaaggaaccggagaaaggcctg1200tgggaaaacattgtttacctggattttcacgcgctgtatccgagcatcattatcacccac1260aacgtgagcccggataccctgaacctggagggttgcaagaactacgacatcgcgccgcag1320gttggccacaagttctgcaaagacattccgggttttatcccgagcctgctgggccacctg1380ctggaagagcgtcagaagattaaaaccaagatgaaagaaacccaagacccgattgagaaa1440atcctgctggattaccgtcaaaaggcgatcaaactgctggcgaacagcttctacggttac1500tatggctatgcgaaggcgcgttggtactgcaaagaatgcgcggagagcgtgaccgcgtgg1560ggtcgtaaatatattgaactggtttggaaggagctggaagagaagttcggttttaaagtg1620ctgtacatcgacaccgatggcctgtatgcgaccattccgggtggcgaaagcgaagagatc1680aagaaaaaggcgctggagtttctgaagtacatcaacgcgaaactgccgggcgcgctggaa1740ctggagtacgaaggtttctataaacgtggcctgtttgtgaccaaaaagaaatatgcggtt1800attgatgaagagggtaaaatcaccacccgtggcctggagattgttcgtcgtgactggagc1860gaaatcgcgaaagagacccaggcgcgtgtgctggaagcgctgctgaaggacggtgatgtt1920gagaaagcggttcgtatcgtgaaggaagttaccgagaagctgagcaaatacgaagtgccg1980ccggagaagctggttattcacgaacaaatcacccgtgacctgaaggattataaagcgacc2040ggtccgcacgtggcggttgcgaaacgtctggcggcgcgtggtgtgaagatccgtccgggc2100accgtgattagctacatcgttctgaaaggtagcggccgtattggcgatcgtgcgatcccg2160ttcgacgagtttgatccgaccaagcacaaatatgacgcggaatactatattgagaaccag2220gtgctgccggcggttgaacgtatcctgcgtgcgttcggttaccgtaaagaggacctgcgt2280tatcagaagacccgtcaagttggtctgagcgcgtggctgaagccgaaaggcacc2334<210>16<211>2538<212>DNA<213>SEQIDNO.3<400>16atggcgagcgcgattctggacaccgattacatcaccgaggatggtaaaccggtgattcgt60atcttcaagaaagagaacggcgaatttaagatcgaatatgaccgtaccttcgagccgtac120ttttatgcgctgctgaaggacgatagcgcgattgaggaagttaagaaaatcaccgcggaa180cgtcacggtaccgtggttaccgtgaagcgtgttgagaaagtgcagaagaaattcctgggc240cgtccggtggaagtttggaaactgtactttacccacccgcaagaccagccggcgattcgt300gataagatccgtgaacacccggcggttattgacatctacgagtatgatattccgttcgcg360aagcgttacctgatcgacaaaggtctggtgccgatggagggcgatgaggaactgaagatg420ctggcgttcgacattgaaaccctgtaccacgagggcgaggaatttgcggaaggcccgatt480ctgatgatcagctatgcggatgaggaaggtgcgcgtgtgatcacctggaaaaacgtggac540ctgccgtacgttgatgtggttagcaccgaacgtgagatgattaagcgtttcctgcgtgtg600gttaaggagaaagacccggatgttctgatcacctacaacggtgacaacttcgattttgcg660tatctgaagaaacgttgcgaaaaactgggcattaactttgcgctgggtcgtgatggcagc720gagccgaaaatccagcgtatgggtgaccgtttcgcggtggaagttaagggccgtattcac780tttgacctgtacccggtgattcgtcgtaccatcaacctgccgacctacaccctggaagcg840gtgtatgaggcggttttcggtcaaccgaaggaaaaagtttatgcggaggaaatcaccacc900gcgtgggagaccggcgaaaacctggagcgtgtggcgcgttacagcatggaggatgcgaaa960gttacctatgaactgggcaaggagttcctgccgatggaagcgcagctgagccgtctggtg1020ggtcaaccgctgtgggacgttagccgtagcagcaccggcaacctggtggagtggtttctg1080ctgcgtaaagcgtacgaacgtaacgaggttgcgccgaacaagccgagcgaggaagagtac1140cagcgtcgtctgcgtgagagctataccggtggcttcgtgaaggaaccggagaaaggcctg1200tgggaaaacattgtttacctggattttcacgcgctgtatccgagcatcattatcacccac1260aacgtgagcccggataccctgaacctggagggttgcaagaactacgacatcgcgccgcag1320gttggccacaagttctgcaaagacattccgggttttatcccgagcctgctgggccacctg1380ctggaagagcgtcagaagattaaaaccaagatgaaagaaacccaagacccgattgagaaa1440atcctgctggattaccgtcaaaaggcgatcaaactgctggcgaacagcttctacggttac1500tatggctatgcgaaggcgcgttggtactgcaaagaatgcgcggagagcgtgaccgcgtgg1560ggtcgtaaatatattgaactggtttggaaggagctggaagagaagttcggttttaaagtg1620ctgtacatcgacaccgatggcctgtatgcgaccattccgggtggcgaaagcgaagagatc1680aagaaaaaggcgctggagtttctgaagtacatcaacgcgaaactgccgggcgcgctggaa1740ctggagtacgaaggtttctataaacgtggcctgtttgtgaccaaaaagaaatatgcggtt1800attgatgaagagggtaaaatcaccacccgtggcctggagattgttcgtcgtgactggagc1860gaaatcgcgaaagagacccaggcgcgtgtgctggaagcgctgctgaaggacggtgatgtt1920gagaaagcggttcgtatcgtgaaggaagttaccgagaagctgagcaaatacgaagtgccg1980ccggagaagctggttattcacgaacaaatcacccgtgacctgaaggattataaagcgacc2040ggtccgcacgtggcggttgcgaaacgtctggcggcgcgtggtgtgaagatccgtccgggc2100accgtgattagctacatcgttctgaaaggtagcggccgtattggcgatcgtgcgatcccg2160ttcgacgagtttgatccgaccaagcacaaatatgacgcggaatactatattgagaaccag2220gtgctgccggcggttgaacgtatcctgcgtgcgttcggttaccgtaaagaggacctgcgt2280tatcagaagacccgtcaagttggtctgagcgcgtggctgaagccgaaaggcaccggtggc2340ggtggcgctacggttaagtttaaatataagggcgaagaactggaagtggacatttctaaa2400atcaaaaaagtgtggcgcgtgggcaagatgatctcttttacctatgatctgggcggcggc2460aaaacgggccgcggtgcagtgagcgaaaaagatgctcctaaagaactgctgcaaatgctg2520gaaaaacagaaaaaataa2538<210>17<211>845<212>PRT<213>SEQIDNO.4<400>17MetAlaSerAlaIleLeuAspThrAspTyrIleThrGluAspGlyLys151015ProValIleArgIlePheLysLysGluAsnGlyGluPheLysIleGlu202530TyrAspArgThrPheGluProTyrPheTyrAlaLeuLeuLysAspAsp354045SerAlaIleGluGluValLysLysIleThrAlaGluArgHisGlyThr505560ValValThrValLysArgValGluLysValGlnLysLysPheLeuGly65707580ArgProValGluValTrpLysLeuTyrPheThrHisProGlnAspGln859095ProAlaIleArgAspLysIleArgGluHisProAlaValIleAspIle100105110TyrGluTyrAspIleProPheAlaLysArgTyrLeuIleAspLysGly115120125LeuValProMetGluGlyAspGluGluLeuLysMetLeuAlaPheAsp130135140IleGluThrLeuTyrHisGluGlyGluGluPheAlaGluGlyProIle145150155160LeuMetIleSerTyrAlaAspGluGluGlyAlaArgValIleThrTrp165170175LysAsnValAspLeuProTyrValAspValValSerThrGluArgGlu180185190MetIleLysArgPheLeuArgValValLysGluLysAspProAspVal195200205LeuIleThrTyrAsnGlyAspAsnPheAspPheAlaTyrLeuLysLys210215220ArgCysGluLysLeuGlyIleAsnPheAlaLeuGlyArgAspGlySer225230235240GluProLysIleGlnArgMetGlyAspArgPheAlaValGluValLys245250255GlyArgIleHisPheAspLeuTyrProValIleArgArgThrIleAsn260265270LeuProThrTyrThrLeuGluAlaValTyrGluAlaValPheGlyGln275280285ProLysGluLysValTyrAlaGluGluIleThrThrAlaTrpGluThr290295300GlyGluAsnLeuGluArgValAlaArgTyrSerMetGluAspAlaLys305310315320ValThrTyrGluLeuGlyLysGluPheLeuProMetGluAlaGlnLeu325330335SerArgLeuValGlyGlnProLeuTrpAspValSerArgSerSerThr340345350GlyAsnLeuValGluTrpPheLeuLeuArgLysAlaTyrGluArgAsn355360365GluValAlaProAsnLysProSerGluGluGluTyrGlnArgArgLeu370375380ArgGluSerTyrThrGlyGlyPheValLysGluProGluLysGlyLeu385390395400TrpGluAsnIleValTyrLeuAspPheHisAlaLeuTyrProSerIle405410415IleIleThrHisAsnValSerProAspThrLeuAsnLeuGluGlyCys420425430LysAsnTyrAspIleAlaProGlnValGlyHisLysPheCysLysAsp435440445IleProGlyPheIleProSerLeuLeuGlyHisLeuLeuGluGluArg450455460GlnLysIleLysThrLysMetLysGluThrGlnAspProIleGluLys465470475480IleLeuLeuAspTyrArgGlnLysAlaIleLysLeuLeuAlaAsnSer485490495PheTyrGlyTyrTyrGlyTyrAlaLysAlaArgTrpTyrCysLysGlu500505510CysAlaGluSerValThrAlaTrpGlyArgLysTyrIleGluLeuVal515520525TrpLysGluLeuGluGluLysPheGlyPheLysValLeuTyrIleAsp530535540ThrAspGlyLeuTyrAlaThrIleProGlyGlyGluSerGluGluIle545550555560LysLysLysAlaLeuGluPheLeuLysTyrIleAsnAlaLysLeuPro565570575GlyAlaLeuGluLeuGluTyrGluGlyPheTyrLysArgGlyLeuPhe580585590ValThrLysLysLysTyrAlaValIleAspGluGluGlyLysIleThr595600605ThrArgGlyLeuGluIleValArgArgAspTrpSerGluIleAlaLys610615620GluThrGlnAlaArgValLeuGluAlaLeuLeuLysAspGlyAspVal625630635640GluLysAlaValArgIleValLysGluValThrGluLysLeuSerLys645650655TyrGluValProProGluLysLeuValIleHisGluGlnIleThrArg660665670AspLeuLysAspTyrLysAlaThrGlyProHisValAlaValAlaLys675680685ArgLeuAlaAlaArgGlyValLysIleArgProGlyThrValIleSer690695700TyrIleValLeuLysGlySerGlyArgIleGlyAspArgAlaIlePro705710715720PheAspGluPheAspProThrLysHisLysTyrAspAlaGluTyrTyr725730735IleGluAsnGlnValLeuProAlaValGluArgIleLeuArgAlaPhe740745750GlyTyrArgLysGluAspLeuArgTyrGlnLysThrArgGlnValGly755760765LeuSerAlaTrpLeuLysProLysGlyThrGlyGlyGlyGlyAlaThr770775780ValLysPheLysTyrLysGlyGluGluLeuGluValAspIleSerLys785790795800IleLysLysValTrpArgValGlyLysMetIleSerPheThrTyrAsp805810815LeuGlyGlyGlyLysThrGlyArgGlyAlaValSerGluLysAspAla820825830ProLysGluLeuLeuGlnMetLeuGluLysGlnLysLys835840845當前第1頁1 2 3