本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因的定量的分析方法。

背景技術(shù)：

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，全球轉(zhuǎn)基因植物種植面積已累積超過(guò)20億公頃。但其在許多國(guó)家和地區(qū)還未進(jìn)入商業(yè)化發(fā)展，仍處于限制性的發(fā)展階段。國(guó)際上很多國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施限量標(biāo)識(shí)和進(jìn)口，而我國(guó)尚無(wú)具體的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)閾值。轉(zhuǎn)基因植物的種類和數(shù)量越來(lái)越多的同時(shí)，對(duì)發(fā)展轉(zhuǎn)基因成分含量檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)的要求不斷增加和提升，篩選性方法的重要性亦越來(lái)越凸顯。比如針對(duì)轉(zhuǎn)基因常用的35S啟動(dòng)子、NOS終止子等通用元件特異性以及Bt，bar/pat等外源基因特異性的檢測(cè)技術(shù)在高通量的檢測(cè)工作中已發(fā)揮了重要作用。但是這些單個(gè)元件特異性的檢測(cè)方法的重要弊端就是無(wú)法避免因天然污染物存在時(shí)引發(fā)假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生。結(jié)構(gòu)特異性PCR檢測(cè)技術(shù)是基于結(jié)合元件與元件之間結(jié)構(gòu)的篩選性方法，兼具篩選和對(duì)某元件特異性的優(yōu)點(diǎn)，它可以有效解決這樣的問(wèn)題。不僅如此，因?yàn)橄嗤瑯?gòu)建結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因事件通常都是由同一家公司生產(chǎn)的，對(duì)某結(jié)構(gòu)的檢測(cè)可直接溯源到它所屬的生產(chǎn)機(jī)構(gòu)?；蛟S這已為人們所共識(shí)，現(xiàn)在關(guān)于結(jié)構(gòu)特異性PCR檢測(cè)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中的應(yīng)用報(bào)道也逐漸增多。

98140玉米、356043大豆、73496油菜都是由美國(guó)先鋒公司生產(chǎn)的含有相同(似)構(gòu)建結(jié)構(gòu)的抗除草劑轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化事件。迄今為止，僅Dreo etal(2012)報(bào)道過(guò)對(duì)所有含有g(shù)at-tpriⅡ結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)方法，但他使用的Green染料進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。眾所周知，染料法沒(méi)有涉及特異性探針，任何雙鏈核酸片段的存在都會(huì)因非特異的燃料嵌入而產(chǎn)生熒光信號(hào)，因此，PCR反應(yīng)過(guò)程中非特異性擴(kuò)增或者引物二聚體的產(chǎn)生都可能被當(dāng)做陽(yáng)性信號(hào)，出現(xiàn)假陽(yáng)性情況，準(zhǔn)確性低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的主要是提供一種擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高的檢測(cè)特異性某特定位點(diǎn)的定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。

本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

含有g(shù)at-tpinⅡ結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)時(shí)PCR精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針：

上游引物序列，gat-tpinⅡ-F1：5'-AGTTRGGMTTCAGYGAGCARGGAGA-3'；

下游引物序列，gat-tpinⅡ-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTC-3'；

熒光探針序列，

gat-tpinⅡ-P2：5'-FAM-CCKCCAGTWGGACCTCACATCCTGATGTAT-TAMRA-3'。

上述含有g(shù)at-tpinⅡ結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)時(shí)PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，

上游引物序列，gat-tpinⅡ-F1：5'-AGTTRGGMTTCAGYGAGCARGGAGA-3'；

下游引物序列，gat-tpinⅡ-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTC-3'；

熒光探針序列，

gat-tpinⅡ-P2：5'-FAM-CCKCCAGTWGGACCTCACATCCTGATGTAT-TAMRA-3'；

(2)制備DNA稀釋液；

(3)配制PCR反應(yīng)體系；

(4)定量PCR檢測(cè)。

進(jìn)一步地，步驟(1)中合成的引物及熒光探針的濃度均為10μmol/l，步驟(2)中制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/μl。

再進(jìn)一步地，步驟(3)中所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將DNA稀釋液加入到反應(yīng)體系中，所述反應(yīng)體系包括以下組分：

更進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15s，56℃退火60s，45個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明所示的探針?lè)梢杂行П苊饧訇?yáng)性情況的產(chǎn)生，具有很高的準(zhǔn)確性，可精準(zhǔn)檢測(cè)含有g(shù)at-tpinⅡ結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

(1)本發(fā)明打破歐盟等國(guó)家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘；

(2)本發(fā)明彌補(bǔ)和完善我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測(cè)技術(shù)體系；

(3)本發(fā)明提供的檢測(cè)技術(shù)可更好地保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)；

(4)本發(fā)明特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明對(duì)非目標(biāo)轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此。

實(shí)施例

含有g(shù)at-tpinⅡ結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)時(shí)PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，在檢測(cè)gat基因與pinⅡ終止子相接處時(shí)，步驟如下：

(a1)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，

上游引物序列，gat-tpinⅡ-F1：5'-AGTTRGGMTTCAGYGAGCARGGAGA-3'；

下游引物序列，gat-tpinⅡ-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTC-3'；

熒光探針序列，

gat-tpinⅡ-P2：5'-FAM-CCKCCAGTWGGACCTCACATCCTGATGTAT-TAMRA-3'。

本實(shí)施例引物及熒光探針的合成濃度均為10μmol/l。

以上引物和熒光探針的核苷酸序列是基于構(gòu)建結(jié)構(gòu)中g(shù)at基因與pinⅡ終止子相連位點(diǎn)的特定位點(diǎn)設(shè)計(jì)；通過(guò)該設(shè)計(jì)就可以精準(zhǔn)檢測(cè)到所有含有g(shù)at-tpinⅡ結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品。

(2)制備DNA稀釋液；即采用常規(guī)的DNA提取手段，從轉(zhuǎn)基因玉米98140、大豆356043、油菜73496中提取出DNA，并將濃度稀釋為50ng/μl的DNA稀釋液。

(3)配制PCR反應(yīng)體系；即將制備好的DNA稀釋液加入反應(yīng)體系中即可。

以上反應(yīng)體系包括以下組分：

(4)定量PCR檢測(cè)。

根據(jù)上述PCR反應(yīng)體系，在以下PCR反應(yīng)條件下對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)，所述PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15s，56℃退火60s，45個(gè)循環(huán)。本實(shí)施例中采用的是ABI公司生產(chǎn)的7500型熒光定量PCR儀器。

采用本發(fā)明的方法對(duì)非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15個(gè)其他玉米轉(zhuǎn)化體，3個(gè)水稻轉(zhuǎn)化體，6個(gè)大豆轉(zhuǎn)化體，5個(gè)棉花轉(zhuǎn)化體，8個(gè)油菜轉(zhuǎn)化體和1個(gè)甜菜轉(zhuǎn)化體進(jìn)行特異性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，從圖1可看出本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針對(duì)以上非轉(zhuǎn)基因作物及除98140玉米、356043大豆、73496油菜外的其他轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體均沒(méi)有特異擴(kuò)增信號(hào)，圖1中△Rn代表熒光原始信號(hào)減去背景信號(hào)的值。

同時(shí)，用無(wú)菌水將0.5％98140轉(zhuǎn)基因玉米梯度稀釋至相應(yīng)的目標(biāo)轉(zhuǎn)化體含量的拷貝數(shù)分別為200、100、40、10、5、2、1個(gè)拷貝；將1％356043轉(zhuǎn)基因大豆和1％73496轉(zhuǎn)基因油菜分別梯度稀釋至相應(yīng)的目標(biāo)轉(zhuǎn)化體含量的拷貝數(shù)分別為1000、100、40、10、5、2、1個(gè)拷貝。每個(gè)濃度梯度設(shè)置15次重復(fù)，對(duì)本發(fā)明的靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)見表1。

表1

ND：沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)。

另外，采用本發(fā)明的方法對(duì)0.5％98140玉米、1％356043大豆以及1％73496油菜幾種標(biāo)準(zhǔn)品(歐盟)作為未知樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，分別編號(hào)為S1、S2、S3。每個(gè)樣品檢測(cè)反應(yīng)重復(fù)三次，每次3個(gè)平行，以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性數(shù)據(jù)見表2。

表2

采用本發(fā)明能夠精準(zhǔn)檢測(cè)三種轉(zhuǎn)基因事件中g(shù)at基因與pinⅡ終止子相連位點(diǎn)的構(gòu)建結(jié)構(gòu)及其外源基因含量。獲得98140轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，在-3.50～-3.37之間；356043轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，在-3.40～-3.22之間；73496轉(zhuǎn)基因油菜標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，在-3.50～-3.44之間。相關(guān)系數(shù)均大于0.99，在90％～110％的范圍內(nèi)。對(duì)待檢樣品S1的定量檢測(cè)結(jié)果為0.564％，對(duì)待檢樣品S2的定量檢測(cè)結(jié)果為1.024％，對(duì)待檢樣品S3的定量檢測(cè)結(jié)果為1.092％，三個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果與其證書含量值(分別為0.5％、1.0％、1.0％)的偏差率分別為12.76％、2.38％、9.18％，均小于國(guó)際認(rèn)可偏差標(biāo)準(zhǔn)25％。本發(fā)明靈敏度測(cè)定結(jié)果表明，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體含量最低檢測(cè)限5個(gè)拷貝。

由以上檢測(cè)結(jié)果可得知，本方法的各指標(biāo)均滿足國(guó)際認(rèn)可的精準(zhǔn)基因定量檢驗(yàn)方法的范圍，本發(fā)明的擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心

<120> 含有g(shù)at-tpinⅡ結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)時(shí)PCR精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針及方法

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物（gat-tpinⅡ-F1）

<400> 1

agttrggmtt cagygagcar ggaga 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物（gat-tpinⅡ-R）

<400> 2

ccaatccaga agatggacaa gtc 23

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 熒光探針（gat-tpinⅡ-P2）

<400> 3

cckccagtwg gacctcacat cctgatgtat 30