本發(fā)明涉及生物醫(yī)學光學與分子影像學
技術領域：
，具體而言，涉及一種遠紅色熒光蛋白、融合蛋白、分離的核酸、載體和應用。
背景技術：
：熒光蛋白可以通過基因調控使其在特定的時間和空間上進行表達，它能夠與其它的蛋白序列融合從而被用作光學探針或者生物光學反應器的組成成分。但熒光蛋白應用于活體內成像時，常常存在組織細胞自發(fā)熒光、光散射以及血紅蛋白光吸收等干擾，導致成像效率低、成像效果差等問題。遠紅色熒光蛋白由于它的激發(fā)峰和發(fā)射峰的波長較長(600nm以上)，因此，它可以很好的解決上述問題。但是，現(xiàn)有的遠紅色熒光蛋白存在較為典型的缺陷：蛋白呈二聚體或四聚體，這將導致其融合性能差，不利于檢測蛋白間的相互作用；此外，還存在蛋白具有較低的消光系數(shù)和量子產率，這將導致成像效果差，清晰度低，敏感性弱等問題。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種遠紅色熒光蛋白，該遠紅色熒光蛋白具有較好的單體性，融合性能好，有助于檢測蛋白間的相互作用。本發(fā)明的再一目的在于提供一種融合蛋白，該融合蛋白含有上述的遠紅色熒光蛋白。本發(fā)明的另一目的在于提供一種分離的核酸，用于編碼上述的遠紅色熒光蛋白。本發(fā)明的另一目的在于提供一種載體，其含有上述的核酸。本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述載體的重組細胞。本發(fā)明的另一目的在于提供上述的遠紅色熒光蛋白在作為熒光共振能量轉移受體或供體中的應用。本發(fā)明的另一目的在于提供上述的遠紅色熒光蛋白在活體成像中的應用。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：一種遠紅色熒光蛋白，其相對于熒光蛋白mMaroon1包括以下氨基酸突變位點：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失。一種融合蛋白，其含有上述的遠紅色熒光蛋白。一種分離的核酸，其編碼上述的遠紅色熒光蛋白。一種載體，其含有上述的核酸。含有上述載體的重組細胞。上述的遠紅色熒光蛋白在作為熒光共振能量轉移受體或供體中的應用。上述的遠紅色熒光蛋白在活體成像中的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的一種遠紅色熒光蛋白、融合蛋白、分離的核酸、載體和應用的有益效果是：本發(fā)明提供的遠紅色熒光蛋白，其相對于現(xiàn)有的熒光蛋白mMaroon1包括S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失等氨基酸突變位點，通過上述氨基酸位點的突變和缺失，避免了二聚體的形成，大大地改善了遠紅色熒光蛋白的單體性，是的該遠紅色熒光蛋白具有了良好的單體性能，使其易于與其他蛋白融合或相互作用，有助于提高成像效率和改善成像效果。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關的附圖。圖1為本發(fā)明實施例4提供的遠紅色熒光蛋白與熒光蛋白mMaroon1的氨基酸序列對比結果；圖2為本發(fā)明實施例4提供的遠紅色熒光蛋白的HPLC檢測結果；圖3為本發(fā)明實施例4提供的遠紅色熒光蛋白的光譜圖。具體實施方式為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。下面對本發(fā)明實施例的一種遠紅色熒光蛋白、融合蛋白、分離的核酸、載體和應用進行具體說明。熒光蛋白可以作為光學探針或者生物光學反應器的組成成分來檢測生物體內的各種各樣生理生化反應。20世紀初，來自多管水母屬的綠色熒光蛋白第一次被突變?yōu)樗{色、青色和黃色熒光蛋白，且突變后的熒光蛋白的發(fā)射峰位于424到530nm之間，在這些突變體中，青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白可配對在活細胞中進行雙通道熒光成像，從而實現(xiàn)了熒光蛋白的雙色同步成像，解決了在活細胞內同時檢測兩個生化反應的難題。后來，人們在海洋里的珊瑚蟲屬中發(fā)現(xiàn)了一系列發(fā)射峰位于537至660nm范圍內的橙色熒光蛋白和紅色熒光蛋白。其中，一種具有代表性的單體紅色熒光蛋-mCherry可以與青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白結合進行三色成像，應用于活細胞內觀察細胞周期的三個不同時期的變化?，F(xiàn)有的遠紅色熒光蛋白(如mMaroon系列等)雖然具有較高的消光系數(shù)和量子產率，但大都為二聚體，并不適用于細胞內融合蛋白等實驗。2015年發(fā)現(xiàn)的一株遠紅色熒光蛋白-mGarnet已被證實具有良好的單體性，但它的量子產率相較于其他二聚體遠紅色熒光蛋白卻比較低，并不十分適用于活體內的多色成像?？傊F(xiàn)有的遠紅色熒光蛋白均不能同時滿足單體性能好以及高量子產率和消光系數(shù)的條件，導致其無法同時兼顧良好的融合性能和較高的成像效率等，因此，無法高質量的應用于活體內同步多色成像?；诖耍景l(fā)明的發(fā)明人在現(xiàn)有的遠紅色熒光蛋白mMaroon1的基礎上，通過對mMaroon1的氨基酸序列(如SEQIDNO:1所示)和結構的分析，采用定點誘變技術，將mMaroon1基因通過聚合酶鏈式反應擴增，然后在組成型表達載體pNCS上對突變體進行表達和篩選，所用表達菌株為Stellar(購買自安捷倫科技公司)，為確保文庫的完整性，每個突變體設置10個克隆，最后通過肉眼分辨以及CCD相機DCU223C檢測突變體的熒光性質，篩選得到了新的且具有較好單體性能、較高成熟率和亮度，以及較高消光系數(shù)和量子產率的遠紅色熒光蛋白，命名為mMaroon2。因此，在本發(fā)明的一方面提供了遠紅色熒光蛋白，其相對于熒光蛋白mMaroon1包括以下氨基酸突變位點：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失。通過對mMaroon1的第128位的絲氨酸突變?yōu)楸彼?，?57位的精氨酸突變?yōu)槔野彼?，?94位的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼嵋约巴ㄟ^上述氨基酸位點的突變以及第226-234位氨基酸片段的缺失，使得本發(fā)明的遠紅色熒光蛋白不會形成二聚體，其單體性遠遠地強于現(xiàn)有的遠紅色熒光蛋白mMaroon1，且易于與其他蛋白融合或相互作用，將其用于成像領域中，有助于提高成像效率和改善成像效果。進一步地，在上述mMaroon2的序列基礎上，發(fā)明人為改善mMaroon2的其他方面的性能如成熟率，采用定點誘變技術，在mMaroon2序列的基礎上進一步進行定點誘變，得到了同時具有單體好和成熟率高的mMaroon2。其相對于熒光蛋白mMaroon1還包括以下氨基酸突變位點：E2R、E3L、N8E、H10T、T38K、C114V、H214Y、V216H、Y221H、C222T以及L224V。將第2位的谷氨酸突變?yōu)榫彼?，?位的谷氨酸突變?yōu)榱涟彼?，?位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝彼幔?0位的組氨酸突變?yōu)樘K氨酸，第38位的蘇氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，?14位的半胱氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第214位的組氨酸突變?yōu)槔野彼?，?16位的纈氨酸突變?yōu)榻M氨酸，第221位的酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸，第222位的半胱氨酸為蘇氨酸，第224位的亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸。由于這些位點位于熒光蛋白的碳端與氮端，因此可以使蛋白結構折疊更為緊密，不僅可以提高熒光蛋白的成熟率，還能進一步提高其單體性。進一步地，在上述得到單體性好的mMaroon2的基礎上，發(fā)明人為改善mMaroon2的其他方面的性能如提高亮度，采用定點誘變技術，在mMaroon2序列的基礎上進一步進行定點誘變，得到了具有亮度高的mMaroon2。其相對于熒光蛋白mMaroon1還包括以下氨基酸突變位點：V46I、Q134R、L138R、V165E、L170Y以及E175V。將mMaroon1的第46位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?34位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?，?38位的亮氨酸突變?yōu)榫彼?，?65位的纈氨酸突變?yōu)楣劝彼?，?70位的亮氨酸突變?yōu)槔野彼幔?75位的谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸。這些位點的突變可以使單體遠紅色熒光蛋白氨基酸之間的靜電相互作用更加緊密，從而穩(wěn)定結構，提高亮度。經過上述的定點誘變，本發(fā)明的遠紅色熒光蛋白不僅具有良好的單體性能，可避免二聚體的形成，同時還具有成熟率和亮度高等特點，以及還具有高量子產率和高消光系數(shù)等光物理性質，使其具有了良好的融合性能，易于與其他蛋白融合或相互作用，提高了成像效率和改善成像效果。一方面，本發(fā)明提供的遠紅色熒光蛋白mMaroon2可用于作為熒光共振能量轉移受體或供體。若將本發(fā)明的紅色熒光蛋白作為熒光共振能量轉移受體時，可將其他蛋白例如發(fā)射光譜與mMaroon2的激發(fā)光譜重疊的蛋白作為熒光共振能量轉移供體。若將本發(fā)明的紅色熒光蛋白作為熒光共振能量轉移供體時，可將其他蛋白例如激發(fā)光譜與mMaroon2的光譜重疊的蛋白作為熒光共振能量轉移受體。另一方面，mMaroon2也可以用于到活體內成像中，具有良好的成像率和成像效果，尤其適用于活體內進行多色成像中；更適用于在活體內與青色、黃色以及紅色熒光蛋白組合或者配對進行同步四色成像中。其與其他蛋白進行融合或單獨作為光學探針或者生物光學反應器的組成成分來檢測生物體內的各種各樣生理生化反應例如通過對該遠紅色熒光蛋白的成像來檢測活細胞內基因表達、蛋白定位、細胞分化發(fā)育以及疾病等方面。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種融合蛋白，其含有上述的遠紅色熒光蛋白。由于本發(fā)明提供的遠紅色熒光蛋白具有良好的單體性，因此，可通過基因工程的技術將其與其他感興趣的蛋白進行融合，也或者是將遠紅色熒光蛋白標記其他感興趣的蛋白。得到的融合蛋白同樣具有良好的融合性能，不會形成多聚體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種分離的核酸，該核酸可編碼上述的遠紅色熒光蛋白。根據(jù)密碼子的簡并性，在遠紅色熒光蛋白的氨基酸序列確定的情況下，其相應的編碼核酸序列也有很多種情況，其均屬于本發(fā)明的保護范圍。需要說明的是，這類核酸的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。在本發(fā)明的另一方面，還提供了含有上述核酸的載體。載體可以是克隆載體或表達載體等，優(yōu)選為表達載體。其中，表達載體可以是真核表達載體或原核表達載體，優(yōu)選為真核表達載體。又或者是其他類型的載體，均屬于本發(fā)明的保護范圍。在本發(fā)明的另一方面，還提供了含有上述載體的重組細胞。重組細胞可以是原核細胞也可以是真核細胞。當然，重組細胞也可以是大腸桿菌、酵母菌或動物細胞或人類細胞，或者是其他類型的細胞或細菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。綜上，所述本發(fā)明提供的遠紅色熒光蛋白，通過在mMaroon1的第128位的絲氨酸突變?yōu)楸彼幔?57位的精氨酸突變?yōu)槔野彼?，?94位的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼嵋约耙约暗?26-234位氨基酸片段的缺失，改變了其原蛋白的二聚體性質，使得本發(fā)明的遠紅色熒光蛋白不會形成二聚體，成為了一個具有良好單體性好的遠紅色熒光蛋白，其有利于蛋白間的相互作用，可適用于眾多領域的成像檢測中。以下結合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。實施例1本實施例提供的遠紅色熒光蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，其相對于熒光蛋白mMaroon1(SEQIDNO:1)具有以下氨基酸突變位點：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失。即本實施例的遠紅色熒光蛋白的氨基酸序列由mMaroon1第128位的絲氨酸突變?yōu)楸彼?，?57位的精氨酸突變?yōu)槔野彼?，?94位的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼嵋约巴ㄟ^上述氨基酸位點的突變以及第226-234位氨基酸片段的缺失后得到。通過上述位點的氨基酸位點突變以及第226-234位氨基酸片段的缺失，改變了原先的熒光蛋白mMaroon1二聚體性質，使得本實施例的遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:2)具有了較好的單體性能，易于和其他蛋白融合或相互作用，有助于提高成像率和成像效果。實施例2在實施例1的遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:2)的基礎上，對其進行進一步的定點突變，以提高其成熟率。本實施例提供的遠紅色熒光蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，其相對于熒光蛋白mMaroon1(其氨基酸序列如SEQIDNO:1)不僅具有以下氨基酸突變：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失；還具有以下氨基酸突變位點：E2R、E3L、N8E、H10T、T38K、C114V、H214Y、V216H、Y221H、C222T以及L224V；即第2位的谷氨酸突變?yōu)榫彼?，?位的谷氨酸突變?yōu)榱涟彼?，?位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝彼?，?0位的組氨酸突變?yōu)樘K氨酸，第38位的蘇氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，?14位的半胱氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第214位的組氨酸突變?yōu)槔野彼?，?16位的纈氨酸突變?yōu)榻M氨酸，第221位的酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸，第222位的半胱氨酸為蘇氨酸，第224位的亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸。由于這些位點位于熒光蛋白的碳端與氮端，因此可以使蛋白結構折疊更為緊密，不僅可以提高本實施例的遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:3)的成熟率，還能進一步提高其單體性。實施例3在實施例1的遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:2)的基礎上，對其進行進一步的定點突變，以提高其亮度。本實施例提供的遠紅色熒光蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，其相對于熒光蛋白mMaroon1不僅具有以下氨基酸突變：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失；還具有以下氨基酸突變位點：V46I、Q134R、L138R、V165E、L170Y以及E175V，即mMaroon1的第46位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?34位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?，?38位的亮氨酸突變?yōu)榫彼?，?65位的纈氨酸突變?yōu)楣劝彼?，?70位的亮氨酸突變?yōu)槔野彼幔?75位的谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸。這些位點的突變可以使本實施例的遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:4)氨基酸之間的靜電相互作用更加緊密，從而穩(wěn)定結構，不僅具有良好的單體性，還具有較高的亮度。實施例4在實施例1的遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:2)的基礎上，對其進行進一步的定點突變，以提高其成熟率和亮度。本實施例提供的遠紅色熒光蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。本實施例的遠紅色熒光蛋白與熒光蛋白mMaroon1的氨基酸序列比對結果如圖1所示。其相對于熒光蛋白mMaroon1不僅具有以下氨基酸突變：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失(如圖1中方框標注所示)；還具有以下氨基酸突變位點：V46I、Q134R、L138R、V165E、L170Y和E175V(如圖1中下劃線標注所示)，以及E2R、E3L、N8E、H10T、T38K、C114V、H214Y、V216H、Y221H、C222T和L224V(如圖1中圓點標注所示)。通過上述幾個氨基酸位點突變的綜合作用，使得本實施例的遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:5)不僅同時具有了良好單體性、較高的成熟率和亮度，以及還具有了較高的量子產率和消光系數(shù)等特性。實施例5本實施例提供了獲得實施例4的遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:5)的方法，當然，實施例1-3所提供的遠紅色熒光蛋白的獲得方法也可可參考本實施例。需要說明的是，本發(fā)明的遠紅色熒光蛋白的獲得方法并不限于本實施例所提供的方法，在其他的實施例中，采用其他方法所得到的本發(fā)明的遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:2-5)同樣屬于本發(fā)明的保護范圍。本實施例提供的獲得遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:5)的方法，如下。(1)根據(jù)實施例4提供的遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:5)的氨基序列設計出相應的核酸序列。該核酸編碼遠紅色熒光蛋白(SEQIDNO:5)。優(yōu)選地，在本實施例中，編碼該紅色熒光蛋白mMaroon2的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。為了便于后續(xù)純化，可在紅色熒光蛋白mMaroon2的N端連接一個六組氨酸標簽。(2)通過基因合成方法獲得上述編碼mMaroon2的核酸片段(SEQIDNO:6)，將該核酸片段連接至表達載體上，并轉化感受態(tài)細胞，并涂布培養(yǎng)。(3)挑取單菌落，接種培養(yǎng)，然后測序，取測序正確的單克隆繼續(xù)培養(yǎng)。(4)對培養(yǎng)液進行離心、純化，得到遠紅色熒光蛋白。實施例6對實施例4提供的遠紅色熒光蛋白的單體性檢測HPLC檢測遠紅色熒光蛋白的單體性，樣品上樣濃度為5mg/mL，上樣量為100uL，流動相為50mM的PBS，流速設置為0.5mL/min。相關檢測方法及參數(shù)可參考相關文獻(Shemiakina,I.I等，Amonomericredfluorescentproteinwithlowcytotoxicity.NatCommun,2012.3)。結果如圖2所示(圖中：a代表mKate2；b代表mMmaroon1；c代表FusionRed；d代表mMaroon2)，HPLC采用的是分子篩的原理，分子越大出峰時間越早，分子越小出峰時間越晚，二聚體是兩個單體的組合，分子自然比單體大的多，因此二聚體的出峰時間比單體要快?；谝陨显恚b于Fusionred已被證實是目前已知的一個單體性非常好的熒光蛋白，mMaroon2的出峰時間與它相近，因此可說明mMaroon2的單體性如Fusionred一樣好。另外，mKate2已被證實是一個公認的二聚體蛋白，mMaroon1的出峰時間遠遠早于mMaroon2，且在mKate2的出峰時間附近出現(xiàn)第一個峰，在mMaroon2的出峰時間附近出現(xiàn)第二個峰，因此判定mMaroon1為一個單體與二聚體混合的蛋白。實施例7實施例4提供的遠紅色熒光蛋白的光物理性質檢測激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的相關檢測步驟：采用B-PERII(購買自皮爾斯公司)對表達目的蛋白的菌株進行裂解，然后采用HisPurCobaltResin(購買自皮爾斯公司)純化蛋白，緊接著通過Econo-Pac10DG重力流色譜柱(購買自美國Bio-Rad公司)去鹽。完成以上蛋白純化步驟后，使用愛丁堡FS920熒光光譜儀檢測目的蛋白的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。mMaroon2的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜如圖3所示。圖中：ex為激發(fā)光譜，em為發(fā)射光譜，橫坐標為波長(λ)，縱坐標為歸一化的熒光強度值。圖3的結果顯示，mMaroon2的激發(fā)光譜為450～670nm；發(fā)射光譜為550～800nm，其激發(fā)峰(607nm)和發(fā)射峰(652nm)的波長較長(600nm以上)，由此說明，本發(fā)明提供的遠紅色熒光蛋白很好的解決現(xiàn)有熒光蛋白組織細胞自發(fā)熒光、光散射以及血紅蛋白光吸收等干擾導致的成像效率低、成像效果差等問題。此外，三色同步成像技術已較為成熟(由青色、黃色、紅色熒光蛋白組成的系統(tǒng))，但是，為了能夠在活體內同步觀察更多的生理生化反應，引入本發(fā)明提供的遠紅色熒光蛋白，其光譜明顯區(qū)別于青色、黃色、紅色熒光蛋白，因此，本發(fā)明的遠紅色熒光蛋白可以與青色、黃色、紅色熒光蛋白組合或配對實現(xiàn)活體內的四色同步成像。(1)熒光蛋白的摩爾消光系數(shù)、量子產率和亮度的測量由于熒光蛋白的N-末端連接有六個組氨酸，所以使用鈷樹脂純化(HisPurCobaltResin)。消光系數(shù)通過變性方法(對于每個蛋白樣品，準備完全一樣兩份溶液，蛋白溶解在PBS中。其中一份測量吸收峰，另外一份在1NNaOH作用下測量吸收峰，通過公式“變性前/變性后*44000”計算出消光系數(shù))測出，而量子產率則分別測量待測樣品和參考蛋白的發(fā)射譜和吸收譜，然后分別計算發(fā)射譜面積和獲得發(fā)射譜的吸收值，然后將發(fā)射譜面積除以吸收值，然后將待測樣品的上述比值除以參考蛋白的比值，然后乘以參考蛋白的量子產率，即可得知待測蛋白的量子產率，具體值見表1。熒光蛋白的亮度值則由消光系數(shù)與量子產率的乘積計算得出。(2)熒光蛋白的酸解離常數(shù)(Pka)測量完成以上蛋白純化步驟后，得到純度很高的蛋白液，將蛋白的濃度調到同一濃度。配置不同PH值的(PH＝1.5～13，每種反應液PH相差0.5)的檢測液，分別將各種PH的檢測液加入到96孔板(黑色，底透明，康寧生產)中，每孔120ul，然后每孔再加入30ul熒光蛋白液，搖床搖5分鐘混勻，然后放到多功能酶標儀上(Tecan)檢測蛋白激發(fā)峰出處的熒光強度。熒光強度隨著PH由小到大逐漸增強再減弱，在由小到大過程中，當熒光強度達到最大值和最小值之和二分之一處所對應的PH值即為該蛋白的酸解離常數(shù)(PKa)，具體值見表1。結果如表1所示表1實施例4提供的遠紅色熒光蛋白mMaroon2的光物理性質蛋白名稱mMaroon1mMaroon2mGarnet激發(fā)峰(nm)607607600發(fā)射峰(nm)652656656消光系數(shù)(M-1cm-1)840007200029000量子產率0.110.120.09亮度9.248.642.61pKa6.16.57.5mGarnet是目前已被報道的唯一的一個600nm以上的單體遠紅色熒光蛋白，但由表1可知，mGarnet的量子產率和消光系數(shù)均較低，且pKa值較高，這意味著mGarnet更易受環(huán)境酸堿度改變的影響；相較于現(xiàn)有的遠紅色熒光蛋白mGarnet，實施例4提供的遠紅色熒光蛋白mMaroon2都具有較高的消光系數(shù)(72000)、量子產率(0.12)和亮度(8.64)以及較低的pKa(6.5)，這些指標的值與現(xiàn)有的二聚體熒光蛋白mMaroon1接近，這表明，實施例4提供的遠紅色熒光蛋白mMaroon2在成像率和成像效果方面更好，且不易受受環(huán)境酸堿度改變的影響。也進一步說明本發(fā)明得到的遠紅色熒光蛋白mMaroon2與青色、黃色、紅色熒光蛋白結合進行活體內四色同步成像時更具優(yōu)勢。綜上所述，本發(fā)明提供的遠紅色熒光蛋白mMaroon2具有以下優(yōu)點：(1)相較于二聚體熒光蛋白mMaroon1，該遠紅色熒光蛋白mMaroon2具有很好的單體性，有利于和其他蛋白間的相互作用；(2)相對于其它單體遠紅色熒光蛋白來說，本發(fā)明提供的遠紅色熒光蛋白mMaroon2的消光系數(shù)、量子產率和亮度高，具有更好的成像率和成像效果；(3)該遠紅色熒光蛋白mMaroon2與其它蛋白質具有良好的融合性，不會干擾到被研究的蛋白在細胞內的定位；(4)該遠紅色熒光蛋白mMaroon2的pKa值比目前已知的唯一一個600nm以上的單體遠紅色熒光蛋白mGarnet低，更不易受酸堿環(huán)境的影響；(5)該遠紅色熒光蛋白mMaroon2可以與常用的青色、黃色、紅色熒光蛋白結合，形成一種新的活體內四色同步成像系統(tǒng)。總之，本發(fā)明提供的新的遠紅色熒光蛋白，能夠同時滿足單體性能好以及高量子產率和消光系數(shù)這兩個條件，可較好的應用于活體內的同步多色成像。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>深圳先進技術研究院<120>一種遠紅色熒光蛋白、融合蛋白、分離的核酸、載體和應用<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>240<212>PRT<213>人工序列<400>1MetGluGluLeuIleLysGluAsnMetHisThrLysLeuTyrLeuThr151015GlyThrValAsnAsnHisTyrPheGluCysThrAlaGluGlyGluGly202530LysProTyrGluGlyThrGlnThrAsnArgIleLysValValArgGly354045GlyProLeuProPheAlaPheAspIleLeuAlaProCysPheMetTyr505560GlySerLysThrPheIleAsnHisProProAspIleProAspTyrPhe65707580LysGlnSerPheProGluGlyPheThrTrpGluArgThrThrValTyr859095GluAspGlyGlyThrLeuThrAlaThrGlnAspThrSerLeuGlnAsp100105110GlyCysLeuIleTyrAsnValGlnValArgGlyGluAsnPheProSer115120125AsnGlyProValMetGlnLysLysThrLeuGlyTrpGluAlaSerThr130135140GluThrLeuTyrProAlaAspGlySerLeuGluGlyArgLeuAspTrp145150155160AlaLeuLysLeuValGlyGlyGlyHisLeuHisCysArgLeuGluThr165170175ThrTyrArgSerLysLysProAlaLysAsnLeuLysMetProGlyVal180185190TyrPheIleAspArgArgLeuGluArgIleLysGluAlaAspAsnGlu195200205ThrTyrValGluGlnHisGluValAlaValAlaArgTyrCysAspLeu210215220ProSerLysLeuGlyHisLysLeuAsnGlyMetAspGluLeuTyrLys225230235240<210>2<211>231<212>PRT<213>人工序列<400>2MetGluGluLeuIleLysGluAsnMetHisThrLysLeuTyrLeuThr151015GlyThrValAsnAsnHisTyrPheGluCysThrAlaGluGlyGluGly202530LysProTyrGluGlyThrGlnThrAsnArgIleLysValValArgGly354045GlyProLeuProPheAlaPheAspIleLeuAlaProCysPheMetTyr505560GlySerLysThrPheIleAsnHisProProAspIleProAspTyrPhe65707580LysGlnSerPheProGluGlyPheThrTrpGluArgThrThrValTyr859095GluAspGlyGlyThrLeuThrAlaThrGlnAspThrSerLeuGlnAsp100105110GlyCysLeuIleTyrAsnValGlnValArgGlyGluAsnPheProAla115120125AsnGlyProValMetGlnLysLysThrLeuGlyTrpGluAlaSerThr130135140GluThrLeuTyrProAlaAspGlySerLeuGluGlyTyrLeuAspTrp145150155160AlaLeuLysLeuValGlyGlyGlyHisLeuHisCysArgLeuGluThr165170175ThrTyrArgSerLysLysProAlaLysAsnLeuLysMetProGlyVal180185190TyrAlaIleAspArgArgLeuGluArgIleLysGluAlaAspAsnGlu195200205ThrTyrValGluGlnHisGluValAlaValAlaArgTyrThrThrVal210215220GlyMetAspGluLeuTyrLys225230<210>3<211>231<212>PRT<213>人工序列<400>3MetGluGluLeuIleLysGluAsnMetHisThrLysLeuTyrLeuThr151015GlyThrValAsnAsnHisTyrPheGluCysThrAlaGluGlyGluGly202530LysProTyrGluGlyThrGlnThrAsnArgIleLysValIleArgGly354045GlyProLeuProPheAlaPheAspIleLeuAlaProCysPheMetTyr505560GlySerLysThrPheIleAsnHisProProAspIleProAspTyrPhe65707580LysGlnSerPheProGluGlyPheThrTrpGluArgThrThrValTyr859095GluAspGlyGlyThrLeuThrAlaThrGlnAspThrSerLeuGlnAsp100105110GlyCysLeuIleTyrAsnValGlnValArgGlyGluAsnPheProAla115120125AsnGlyProValMetArgLysLysThrArgGlyTrpGluAlaSerThr130135140GluThrLeuTyrProAlaAspGlySerLeuGluGlyTyrLeuAspTrp145150155160AlaLeuLysLeuGluGlyGlyGlyHisTyrHisCysArgLeuValThr165170175ThrTyrArgSerLysLysProAlaLysAsnLeuLysMetProGlyVal180185190TyrAlaIleAspArgArgLeuGluArgIleLysGluAlaAspAsnGlu195200205ThrTyrValGluGlnHisGluValAlaValAlaArgTyrThrThrVal210215220GlyMetAspGluLeuTyrLys225230<210>4<211>231<212>PRT<213>人工序列<400>4MetArgLeuLeuIleLysGluGluMetThrThrLysLeuTyrLeuThr151015GlyThrValAsnAsnHisTyrPheGluCysThrAlaGluGlyGluGly202530LysProTyrGluGlyLysGlnThrAsnArgIleLysValValArgGly354045GlyProLeuProPheAlaPheAspIleLeuAlaProCysPheMetTyr505560GlySerLysThrPheIleAsnHisProProAspIleProAspTyrPhe65707580LysGlnSerPheProGluGlyPheThrTrpGluArgThrThrValTyr859095GluAspGlyGlyThrLeuThrAlaThrGlnAspThrSerLeuGlnAsp100105110GlyValLeuIleTyrAsnValGlnValArgGlyGluAsnPheProAla115120125AsnGlyProValMetGlnLysLysThrLeuGlyTrpGluAlaSerThr130135140GluThrLeuTyrProAlaAspGlySerLeuGluGlyTyrLeuAspTrp145150155160AlaLeuLysLeuValGlyGlyGlyHisLeuHisCysArgLeuGluThr165170175ThrTyrArgSerLysLysProAlaLysAsnLeuLysMetProGlyVal180185190TyrAlaIleAspArgArgLeuGluArgIleLysGluAlaAspAsnGlu195200205ThrTyrValGluGlnTyrGluHisAlaValAlaArgHisThrThrVal210215220GlyMetAspGluLeuTyrLys225230<210>5<211>231<212>PRT<213>人工序列<400>5MetArgLeuLeuIleLysGluGluMetThrThrLysLeuTyrLeuThr151015GlyThrValAsnAsnHisTyrPheGluCysThrAlaGluGlyGluGly202530LysProTyrGluGlyLysGlnThrAsnArgIleLysValIleArgGly354045GlyProLeuProPheAlaPheAspIleLeuAlaProCysPheMetTyr505560GlySerLysThrPheIleAsnHisProProAspIleProAspTyrPhe65707580LysGlnSerPheProGluGlyPheThrTrpGluArgThrThrValTyr859095GluAspGlyGlyThrLeuThrAlaThrGlnAspThrSerLeuGlnAsp100105110GlyValLeuIleTyrAsnValGlnValArgGlyGluAsnPheProAla115120125AsnGlyProValMetArgLysLysThrArgGlyTrpGluAlaSerThr130135140GluThrLeuTyrProAlaAspGlySerLeuGluGlyTyrLeuAspTrp145150155160AlaLeuLysLeuGluGlyGlyGlyHisTyrHisCysArgLeuValThr165170175ThrTyrArgSerLysLysProAlaLysAsnLeuLysMetProGlyVal180185190TyrAlaIleAspArgArgLeuGluArgIleLysGluAlaAspAsnGlu195200205ThrTyrValGluGlnTyrGluHisAlaValAlaArgHisThrThrVal210215220GlyMetAspGluLeuTyrLys225230<210>6<211>705<212>DNA<213>人工序列<400>6atggtgagcaagggccggctcctgatcaaggaggagatgaccaccaagctgtacctgaca60ggcaccgtgaacaaccactacttcgaatgcaccgccgaaggggagggcaaaccctacgag120ggcaagcagaccaacaggatcaaggtgatccgcggaggccccctgccgttcgcattcgac180atcctggccccctgctttatgtacgggagcaagaccttcattaaccatccacctgacatt240cccgattattttaagcagtccttccctgagggcttcacatgggagagaaccaccgtttac300gaggacgggggcacactcactgctacacaggacaccagcctccaggacggcgtgctgatc360tacaacgtccaagtcagaggggagaacttcccagccaacggccctgtgatgcggaagaaa420acaagaggctgggaggcaagtaccgagaccctgtaccccgccgacggcagcctggaaggc480tacctggactgggccctgaagctcgagggcgggggccactaccactgcaggctggtgacc540acatacagatccaagaaacccgcaaagaacctcaagatgcccggcgtctatgccattgac600aggagactggaaagaatcaaggaggccgacaatgagacctacgtcgagcagtacgagcac660gctgtggccagacacaccaccgtcggcatggacgagctgtacaag705當前第1頁1 2 3