本發(fā)明涉及一種裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的方法，具體的涉及一種基于裂蓋馬鞍菌生物學(xué)特性、通過子實(shí)體的原產(chǎn)地采集及單次生子囊孢子菌株的分離與鑒定、低能離子束注入及透明圈和營養(yǎng)缺陷型選擇性篩選、總RNA的提取及檢測(cè)、cDNA的合成及文庫構(gòu)建、原始文庫重組率的滴度測(cè)定、EST序列分析的方法。

背景技術(shù)：

裂蓋馬鞍菌(Helvella leucopus Pers.) 俗名巴楚蘑菇、地木耳，屬子囊菌亞門(Ascomycotina)、盤菌目(Pizizales)、馬鞍菌科(Helvellaceae)、馬鞍菌屬(Helvella)，原產(chǎn)于新疆巴楚縣原始胡楊林場(chǎng)，是葉爾羌河水、千年胡楊樹、干旱少雨的大漠氣候條件經(jīng)大自然融合孕育出的一種綠色珍稀食用菌，素以純天然、質(zhì)嫩味美、營養(yǎng)豐富而著稱，它不但具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，還有提高人體免疫力、促進(jìn)大腦發(fā)育、防止腦動(dòng)脈硬化、促進(jìn)副腎皮質(zhì)激素分泌、增強(qiáng)人體應(yīng)激能力、溶血栓、降血壓、降低膽固醇等多種保健作用，市場(chǎng)上干品價(jià)格居高不下仍供不應(yīng)求。

近年來，由于對(duì)裂蓋馬鞍菌人為過渡采收加之其生長環(huán)境不斷惡化等原因其產(chǎn)量逐年下降，而人工馴化和栽培至今尚未獲實(shí)質(zhì)性突破，急需對(duì)裂蓋馬鞍菌進(jìn)行區(qū)域普查、育種技術(shù)及栽培技術(shù)進(jìn)行深入研究。但國內(nèi)外對(duì)裂蓋馬鞍菌的研究甚少，近年來只有國內(nèi)學(xué)者朱銘莪、孟慶玲、胡建偉等對(duì)裂蓋馬鞍菌的營養(yǎng)成分、免疫功能、抗氧化及抗腫瘤活性、孢子萌發(fā)及環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)行了初步研究。因此，為了更好的保護(hù)野生裂蓋馬鞍菌種群及生物遺傳多樣性和可持續(xù)開發(fā)利用，急需對(duì)離子注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的方法進(jìn)行深入研究。

離子束誘變技術(shù)是上世紀(jì)80年代中期由我國科學(xué)家開創(chuàng)的新興研究領(lǐng)域，是育種方法學(xué)的重要?jiǎng)?chuàng)新并從國內(nèi)走向世界。在離子注入生物效應(yīng)的研究中，呈現(xiàn)出一些獨(dú)特性，它主要包括能量沉積、動(dòng)量傳遞、質(zhì)量沉積和電荷交換這4個(gè)原初過程，這4個(gè)過程在很短的時(shí)間內(nèi)同時(shí)發(fā)生，很難區(qū)分各自的獨(dú)立作用。離子注入產(chǎn)生的生物效應(yīng)的因素與輻射不同，離子注入除了具有能量沉積引起機(jī)體損傷的特征外，還具有動(dòng)量傳遞產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)損傷，表現(xiàn)為遺傳物質(zhì)的原子移位、重排或基因缺失，還有沉積離子、移位原子和本底元素復(fù)合反應(yīng)造成的化學(xué)損傷以及電荷交換引起的生物分子電子轉(zhuǎn)移造成的損傷。注入的荷能離子的電信號(hào)和所形成的微電場(chǎng)影響著生物體生命過程中的基因表達(dá)和調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)外的能量交換、物質(zhì)運(yùn)輸、信息傳遞，并刺激損傷DNA 的修復(fù)、生物體的生長和發(fā)育。因此，離子束誘變技術(shù)已成為擁有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的定向遺傳育種的新方法、新途徑。

人類對(duì)于基因組進(jìn)化的興趣最早可以追溯到20世紀(jì)70-80年代選擇學(xué)說和中性學(xué)說的逐漸形成和爭(zhēng)論。雖然至今還沒有完全弄清基因進(jìn)化的具體過程和機(jī)制，但目前已經(jīng)普遍認(rèn)為廣泛存在的點(diǎn)突變和插入/缺失突變是基因組進(jìn)化的重要驅(qū)動(dòng)力。自1927年Muller發(fā)現(xiàn)X射線能誘發(fā)果蠅產(chǎn)生大量多種類型突變和20世紀(jì)40年代初Fresjeben和Lein利用誘變劑在植物上獲得有益突變以來，突變被廣泛應(yīng)用于生物的遺傳育種及定向進(jìn)化研究。隨著DNA高精度高通量快速測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和完善，測(cè)序成本大幅度降低，促進(jìn)了全基因組突變技術(shù)和方法的發(fā)展和應(yīng)用(Nature Genetics, publish online, 20 june 2007)。較早用于全基因組突變技術(shù)TILLING，是將誘發(fā)產(chǎn)生高頻率點(diǎn)突變的化學(xué)誘變方法與PCR篩選技術(shù)和Li-Cor公司生產(chǎn)的4300DNA遺傳分析系統(tǒng)的雙色紅外熒光高通量檢測(cè)技術(shù)有效結(jié)合，快速有效的從化學(xué)誘變劑（EMS）誘變產(chǎn)生的突變?nèi)后w中鑒定出點(diǎn)突變。

本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過近年來深入裂蓋馬鞍菌發(fā)生地對(duì)當(dāng)?shù)匚锖驐l件、發(fā)生基質(zhì)、發(fā)生方式的野外實(shí)地考察結(jié)合在實(shí)驗(yàn)室對(duì)其生物學(xué)特性、離子束誘變育種方法深入細(xì)致的研究，設(shè)計(jì)了一種離子束注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的方法，實(shí)驗(yàn)業(yè)已證實(shí)該方法是一種簡(jiǎn)便實(shí)用的裂蓋馬鞍菌的離子束誘變育種方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種離子束注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的方法，該方法包括子實(shí)體的原產(chǎn)地采集及單次生子囊孢子菌株的分離與鑒定、低能離子束注入及透明圈和營養(yǎng)缺陷型選擇性篩選、總RNA的提取及檢測(cè)、cDNA的合成及文庫構(gòu)建、原始文庫重組率的滴度測(cè)定、EST序列分析等步驟。優(yōu)選地，在離子束注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的步驟中還包括離子束注入組合參數(shù)的優(yōu)化、選擇性篩選方法的設(shè)計(jì)和全基因組測(cè)序及分析的步驟，經(jīng)過上述處理可獲得裂蓋馬鞍菌創(chuàng)新突變菌株并揭示全基因組突變及定向進(jìn)化的分子機(jī)制。

鑒于裂蓋馬鞍菌種群及生物遺傳多樣性保護(hù)和綠色開發(fā)的現(xiàn)實(shí)需要，以原產(chǎn)地采集的裂蓋馬鞍菌子實(shí)體為出發(fā)菌種，將單次生子囊孢子菌株分離與鑒定、離子束注入誘變、透明圈和營養(yǎng)缺陷型篩選方法與全基因組測(cè)序及分析相融合篩選裂蓋馬鞍菌創(chuàng)新突變菌株，為裂蓋馬鞍菌的原產(chǎn)地保護(hù)和人工栽培提供育種方法和種質(zhì)保證。

其中，出發(fā)菌種的優(yōu)劣是影響離子束注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的首要因素，而原產(chǎn)地采集的時(shí)間和地點(diǎn)、采集和保存方式以及單次生子囊孢子菌株的分離與鑒定等環(huán)節(jié)都對(duì)出發(fā)菌種的品質(zhì)有影響?；谖墨I(xiàn)資料報(bào)道結(jié)合對(duì)裂蓋馬鞍菌主要發(fā)生地南疆葉爾羌流域的巴楚縣和塔里木河流域的輪臺(tái)縣的物候條件、發(fā)生基質(zhì)、發(fā)生方式的野外實(shí)地考察，每年4月下旬-5月中旬為新疆裂蓋馬鞍菌的菌絲體扭結(jié)、子實(shí)體發(fā)育成熟適宜采集的季節(jié)，可以利用五一長假期間趕赴巴楚縣或輪臺(tái)縣胡楊林場(chǎng)尋找、觀察、采集裂蓋馬鞍菌子實(shí)體，并通過就地的酒精表層無菌處理及低溫保鮮處理后快速運(yùn)返實(shí)驗(yàn)室，從中分別選取幾片成熟耳片經(jīng)1.0KGy的γ射線輻照處理后置于無菌培養(yǎng)皿中收集彈射子囊孢子，然后用無菌水分別洗脫、收集彈射子囊孢子，經(jīng)熒光標(biāo)記、計(jì)數(shù)、稀釋后分別取 0.2mL子囊孢子懸液一一對(duì)應(yīng)涂布在無菌空白培養(yǎng)皿和水瓊脂分離培養(yǎng)基平板上，涂菌的空白培養(yǎng)皿自然風(fēng)干以備后續(xù)離子束注入誘變之用。

低能離子束注入的組合參數(shù)是影響離子束注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的關(guān)鍵因素。以分離鑒定的裂蓋馬鞍菌單次生子囊孢子為靶材，經(jīng)不同能量、劑量、脈沖時(shí)間及正交組合的N⁺注入后，用含有多態(tài)性DNA的緩沖液對(duì)離子注入的涂菌培養(yǎng)皿進(jìn)行洗脫、復(fù)活和培養(yǎng)，并與未經(jīng)離子束注入的對(duì)照對(duì)比，考察不同注入能量、劑量、脈沖時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響，并以Loewer等人的“突變累計(jì)”方法計(jì)算突變率，獲得低能離子注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的最佳N⁺注入?yún)?shù)。

選擇性篩選方法也是影響離子束注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的關(guān)鍵因素。低能離子束注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變是隨機(jī)的，而選擇性篩選方法卻是定向的。挑取經(jīng)離子束注入后PDA平板培養(yǎng)基上長出的單菌落初生菌絲體分別轉(zhuǎn)接到CMC平板培養(yǎng)基和氨基酸缺陷型平板培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)，通過透明圈和營養(yǎng)缺陷型選擇性篩選方法篩選突變菌株。

全基因組測(cè)序和分析是影響離子束注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的重要因素。采用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)構(gòu)建的野生型和突變菌株文庫進(jìn)行測(cè)序，利用生物信息學(xué)方法可獲得裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的分子機(jī)制。

該方法已在實(shí)驗(yàn)室得到成功實(shí)踐，結(jié)果表明該方法是一種簡(jiǎn)便實(shí)用的裂蓋馬鞍菌的離子束誘變育種方法。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例 離子束注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的方法

離子束注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的方法包括子實(shí)體的原產(chǎn)地采集及單次生子囊孢子菌株的分離與鑒定、低能離子束注入及透明圈和營養(yǎng)缺陷型選擇性篩選、總RNA的提取及檢測(cè)、cDNA的合成及文庫構(gòu)建、原始文庫重組率的滴度測(cè)定、EST序列分析幾個(gè)階段。選擇裂蓋馬鞍菌大量發(fā)生的季節(jié)，深入裂蓋馬鞍菌原產(chǎn)地采集發(fā)育成熟的子實(shí)體，通過單次生子囊孢子菌株的分離與鑒定、低能離子束注入及透明圈和營養(yǎng)缺陷型選擇性篩選以及全基因組測(cè)序和分析可獲得裂蓋馬鞍菌創(chuàng)新突變菌株及其全基因組突變和定向進(jìn)化的分子機(jī)制。

（1）子實(shí)體的原產(chǎn)地采集及單次生子囊孢子菌株的分離與鑒定

五一期間分赴裂蓋馬鞍菌發(fā)生地葉爾羌流域的巴楚縣和塔里木河流域的輪臺(tái)縣林區(qū)采集裂蓋馬鞍菌子實(shí)體，并通過就地的酒精表層無菌處理及低溫保鮮處理后快速運(yùn)返實(shí)驗(yàn)室，從中分別取幾片裂蓋馬鞍菌子實(shí)體成熟耳片經(jīng)1.0KGy的γ射線輻照處理后置于無菌培養(yǎng)皿中收集彈射子囊孢子，然后用無菌水分別洗脫收集的彈射子囊孢子經(jīng)熒光標(biāo)記、計(jì)數(shù)、稀釋后分別取 0.2mL子囊孢子懸液一一對(duì)應(yīng)涂布在無菌空白培養(yǎng)皿和水瓊脂分離培養(yǎng)基平板上，涂菌的空白培養(yǎng)皿自然風(fēng)干以備后續(xù)離子束注入誘變之用，涂菌的水瓊脂分離培養(yǎng)基25℃恒溫培養(yǎng)，并鏡檢水瓊脂分離培養(yǎng)基平板上單次生子囊孢子的動(dòng)態(tài)萌發(fā)過程，待平板上出現(xiàn)單菌落之后挑取初生菌絲體到 PDA平板培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)，鏡檢菌絲體的微觀形態(tài)并動(dòng)態(tài)觀察其生長過程。

（2）低能離子束注入及透明圈和營養(yǎng)缺陷型選擇性篩選

以分離鑒定的裂蓋馬鞍菌單次生子囊孢子為靶材，經(jīng)不同能量、劑量脈沖時(shí)間及正交組合的N⁺注入后，用含有多態(tài)性DNA的緩沖液對(duì)離子注入的涂菌培養(yǎng)皿進(jìn)行洗脫、復(fù)活和培養(yǎng)，并與未經(jīng)離子束注入的對(duì)照對(duì)比，考察不同注入能量、劑量、脈沖時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響，并以Loewer等人的“突變累計(jì)”方法計(jì)算突變率，獲得低能離子注入裂蓋馬鞍菌全基因組突變及定向進(jìn)化的最優(yōu)N+注入?yún)?shù)為：注入能量15keV、注入劑量1.0×10¹⁶cm^-2、真空度2.5×10^-3Pa、脈沖時(shí)間5s/次。然后，挑取PDA平板培養(yǎng)基上單菌落初生菌絲體分別轉(zhuǎn)接到CMC平板培養(yǎng)基和氨基酸及維生素缺陷型平板培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)，通過測(cè)定透明圈直徑和營養(yǎng)缺陷型選擇性篩選方法篩選裂蓋馬鞍菌創(chuàng)新突變菌株。其中，營養(yǎng)缺陷型平板培養(yǎng)基是在質(zhì)量百分比為1.0%玉米淀粉、2.0%葡萄糖、0.2%磷酸二氫鉀、0.15%硫酸鎂、2.0%瓊脂、pH自然的基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基上分別添加0.2mL質(zhì)量百分比為70ppm的天門冬氨酸Asp、70ppm亮氨酸 Leu、50ppm絲氨酸Ser、70ppm異亮氨酸Ile、90ppm谷氨酸Glu、90ppm酪氨酸Tyr、60ppm脯氨酸Pro、80ppm苯丙氨酸Phe、40ppm甘氨酸Gly、70ppm賴氨酸Lys、40ppm丙氨酸Ala、100ppm色氨酸Trp、80ppm組氨酸His、120ppm胱氨酸Cys、20ppm精氨酸Arg、60ppm纈氨酸Va、60ppm蘇氨酸Thr、70ppm蛋氨酸Met、100ppm維生素B1、100ppm維生素B2、100ppm維生素B6溶液，本方法所用的多態(tài)性DNA片段包括12種單鏈小分子DNA及以其為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的雙鏈小分子DNA，12種單鏈小分子DNA序列如下（N表示任意相同堿基）：

5^、ATGCNNNNNNNNNNNNNNNN3^、

5^、ATCGNNNNNNNNNNNNNNNN3^、

5^、AGCTNNNNNNNNNNNNNNNN3^、

5^、AGTCNNNNNNNNNNNNNNNN3^、

5^、ACTGNNNNNNNNNNNNNNNN3^、

5^、ACGTNNNNNNNNNNNNNNNN3^、

3^、ATGCNNNNNNNNNNNNNNNN5^、

3^、ATCGNNNNNNNNNNNNNNNN5^、

3^、AGCTNNNNNNNNNNNNNNNN5^、

3^、AGTCNNNNNNNNNNNNNNNN5^、

3^、ACTGNNNNNNNNNNNNNNNN5^、

3^、ACGTNNNNNNNNNNNNNNNN5^、。

（3）總RNA的提取及檢測(cè)

將裂蓋馬鞍菌野生型和突變菌株菌絲體接種到 PDA 平板培養(yǎng)基上，置于 25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 10d，取適量初生菌絲體立即凍存于液氮中，在液氮中研細(xì)轉(zhuǎn)至勻漿管中，加入1mL RNA-solv Reagent試劑，按北京華越洋生物科技有限公司RNA試劑盒說明書操作提取總RNA，然后，自然干燥后溶于0.1 mL無RNase的H₂O中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量所提RNA的純度(OD260／OD280)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2％的瓊脂糖電泳檢測(cè)所提RNA的完整性。

（4）cDNA的合成及文庫構(gòu)建

取2 μg mRNA在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，42℃溫浴l h，合成cDNA第一鏈；取2 μL單鏈cDNA通過LD-PCR法合成第二鏈，所用程序?yàn)?5℃ l min預(yù)變性，95℃ 15s，24個(gè)循環(huán)，68℃延伸6 min；所有的第二鏈產(chǎn)物經(jīng)過蛋白酶K及Sfi I限制性內(nèi)切酶消化后用Chroma SPIN-400凝膠柱將cDNA片段按分子大小分布，收集大于500 bp的片段經(jīng)乙醇沉淀后重新溶于7μL去離子水中；最后，將片段連入pDNR-LIB載體。其中，CDS III／3'-PCR引物：5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3'；SMART IV低聚核苷酸：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCTTACGGCCGGG-3'；第二鏈合成所用引物：5'-PCR引物：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，3'-PCR引物：5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3'。

（5）原始文庫重組率的滴度測(cè)定

于氯霉素抗性培養(yǎng)基上任意挑取24個(gè)重組子，通過質(zhì)粒酶切，電泳檢測(cè)得到文庫重組率，其中，重組率=(有插入片段的反應(yīng)個(gè)數(shù)／反應(yīng)總數(shù))×100％。

（6）EST序列分析

利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同文庫進(jìn)行測(cè)序，將所得序列去除大腸桿菌DNA序列、載體序列、接頭序列和短于100 bp的序列，并將所得序列應(yīng)用CAP3序列軟件進(jìn)行拼接，參數(shù)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)是2個(gè)片段至少100 bp范圍內(nèi)有大于95％的一致性序列。處理后的EST序列與本地化的GMGI(Glyeine Max Gene Index，Release 16)、AGI(Arabidopsis Gene Index，Release 12)和OGI(Oryza Sativa Gene Index，Release 16)基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast N分析，E值設(shè)定為E-value<10^-15。根據(jù)功能注釋信息和GI號(hào)，采用國際標(biāo)準(zhǔn)基因分類體系(Gene Ontology，GO)進(jìn)行分類，獲得裂蓋馬鞍菌基因突變的位點(diǎn)并揭示其全基因組突變及定向進(jìn)化的分子機(jī)制。

通過上述具體的實(shí)施例，更容易理解本發(fā)明。上述實(shí)施例只是舉例性的描述，而不應(yīng)當(dāng)被理解為用來限制本發(fā)明的范圍。