本發(fā)明涉及一種黑木耳SSR分子標(biāo)記的反應(yīng)體系的優(yōu)化。

背景技術(shù)：

分子標(biāo)記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA 水平遺傳變異的直接反映。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)開發(fā)了幾十種基于DNA 多態(tài)性的分子標(biāo)記，如RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、STS、SNP、SCAR、CAPS 等，但是，RFLP 標(biāo)記所需 DNA量大，步驟多，周期長，制備探針及檢測中要用到放射性同位素，成本高；RAPD標(biāo)記因使用的引物較短，對反應(yīng)條件極為敏感，稍有改變便影響擴(kuò)增產(chǎn)物的重現(xiàn)，重復(fù)性較差，穩(wěn)定性不好。另外，RAPD 是顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純合與雜合基因型，無法直接用于基因型分析；AFLP標(biāo)記對DNA 的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高，方法復(fù)雜，條帶多且密集，使統(tǒng)計分析困難，且費(fèi)用比較昂貴；SNP 提供的信息較少，且費(fèi)用較高。相比之下SSR標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：等位基因變異多，信息含量高；單基因座，多態(tài)性高；以孟德爾方式分離、呈共顯性遺傳；種族特異性強(qiáng)、進(jìn)化所受選擇壓小，在種屬間有良好的通用性；對 DNA 質(zhì)量要求低，用量少，即使是部分降解的樣品也可進(jìn)行分析；可利用PCR進(jìn)行分析，操作簡便，穩(wěn)定性、重復(fù)性好?；谏鲜鎏攸c(diǎn)，SSR已成為在生物上應(yīng)用最廣、最為重要的分子標(biāo)記。與其他分子標(biāo)記一樣，SSR標(biāo)記需配置大量的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，但與其他分子標(biāo)記不一樣的是SSR分子標(biāo)記一般用丙烯酰胺凝膠檢測而非瓊脂糖凝膠檢測，點(diǎn)樣量較少，如配置與其他分子標(biāo)記相同的PCR反應(yīng)體系過多將造成嚴(yán)重的浪費(fèi)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種黑木耳SSR-PCR的優(yōu)化反應(yīng)體系，以解決目前SSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系過大，各種試劑用量過多而造成浪費(fèi)和成本較高的問題。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：SSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系采用的10ul體系，其中：

10×Taq DNA聚合酶Buffer緩沖液（含Mg+） 1× 1.0uL

2.5mmol/L dNTPs 混合溶液(2.5mmol/L) 0.25mmol/L 1.0uL

10uLmol/L上游引物 0.2mmol/L 0.2uL

10uLmol/L下游引物 0.2mmol/L 0.2uL

DNA模版 20ng～50ng 1.0uL

其余為Taq DNA聚合酶1.0U和水。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的情況下將黑木耳SSR-PCR反應(yīng)體系由20ul優(yōu)化減半為10ul,減少了試劑使用量，避免試劑不必要的浪費(fèi)，大大降低實(shí)驗(yàn)成本。

附圖說明

圖1 普通20ul SSR-PCR反應(yīng)體系電泳圖；

圖2 優(yōu)化10ul SSR-PCR反應(yīng)體系電泳圖。

具體實(shí)施方式

SSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系采用的10ul體系，其中：

10×Taq DNA聚合酶Buffer緩沖液（含Mg+） 1× 1.0uL

2.5mmol/L dNTPs 混合溶液(2.5mmol/L) 0.25mmol/L 1.0uL

10uLmol/L上游引物 0.2mmol/L 0.2uL

10uLmol/L下游引物 0.2mmol/L 0.2uL

DNA模版 20ng～50ng 1.0uL

其余為Taq DNA聚合酶1.0U和水。

以優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行黑木耳菌株SSR分子標(biāo)記試驗(yàn)按以下步驟實(shí)現(xiàn)：

一、提取選定黑木耳菌株菌絲體總DNA；

二、按比例配制黑木耳SSR優(yōu)化PCR反應(yīng)體系；

三、進(jìn)行PCR反應(yīng)；

四、PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

下邊通過對比效果實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明本發(fā)明。

1 黑木耳菌株菌絲體總DNA提取：

1.1 稱取0.2g菌絲，置于研缽中，加入液氮充分研磨成粉末。

1.2 將菌絲粉末迅速轉(zhuǎn)入2.0mL離心管中，加入900uL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液。

1.3 置于65℃水浴40min～60min,不時輕輕地?fù)u動混勻。

1.4 12000rpm 離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至已滅菌的2.0mL離心管中，棄沉淀。

1.5 加等體積的苯酚-氯仿-異戊醇溶液，輕輕搖勻，室溫靜置5min。

1.6 12000rpm 離心10min，觀察分界面有無沉淀，將上清轉(zhuǎn)移至已滅菌的2.0mL離心管中，棄下層有機(jī)相。

1.7 加等體積的氯仿-異戊醇溶液，輕輕搖勻，室溫靜置5min。12000rpm 離心10min

1.8 12000rpm 離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至已滅菌的2.0mL離心管中，棄下層有機(jī)相。（吸取上清液時注意避免吸到中間層）

1.9 根據(jù)需要，重復(fù)D.1.7-D.1.8，直至中間層無明顯沉淀。

1.10 加2倍體積的 -20℃ 預(yù)冷的無水乙醇，-20℃ 沉淀 30min。

1.11 8000 rpm 離心5 min，棄上清。

1.12 加70% 乙醇洗滌沉淀2～3次。

1.13 待沉淀干燥后（約5min～10min）,加滅菌的去離子水100uL，使DNA充分溶解。

1.14 加RNase酶1uL，37℃ 水浴10h～12h，去除RNA。

1.15 -20℃保存。

2 配制黑木耳SSR- PCR反應(yīng)體系

按表1分別配置普通20ul PCR反應(yīng)體系和優(yōu)化10ul PCR反應(yīng)體系，所用引物序列為：

SSR1-F 5’- CGACATGCTGGAGAAGACTG-3’；

SSR1-R 5’- GCATTCCAACGAGGATTCTG-3’。

3 PCR反應(yīng)條件

反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性5min；95℃變性50s，以低于引物Tm值溫度5℃退火45s，72℃延伸50s，35個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。

4 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

4.1 清洗玻璃板

將玻璃板清洗干凈，用去離子水沖凈后晾干。用無水乙醇擦洗2遍，吸水紙擦干。在帶毛玻璃凸邊的板上涂0.5mL親和硅烷工作液，在不帶毛玻璃凹槽的板上涂0.5mL剝離硅烷。操作過程中防止兩塊玻璃板相互污染。

4.2 組裝玻璃板

待玻璃板徹底干燥后，組裝電泳玻璃板，注意玻璃板的邊緣對其。

4.3 制膠

在100mL燒杯中加入36.8mL 去離子水，18.6 mL 30%丙烯酰胺溶液，14mL 5×TBE溶液，490uL 10%過硫酸銨溶液和45uL TEMED。輕輕搖勻，將膠緩緩灌入玻璃膠室。待膠室灌滿后，在凹槽處輕輕插入樣品梳，室溫下聚合1h以上。聚合完成后，輕輕拔出梳子。

4.4 預(yù)電泳

將膠板安裝到電泳槽上，向槽上加入約500mL的0.5×TBE緩沖液，使其超出凝膠頂部約1cm。向下槽中加入約500mL的0.5×TBE緩沖液，用注射器吸取緩沖液沖洗點(diǎn)樣孔清除氣泡和丙烯酰胺碎片。20V/cm恒電場中預(yù)電泳30min.

4.5 樣品制備

按樣本：加樣緩沖液5:1的比例加入上樣緩沖液，混勻。

4.6 電泳

每個點(diǎn)樣孔加入2uL～3uL樣品。出待測樣品外，還應(yīng)同時加入?yún)⒄掌贩N擴(kuò)增產(chǎn)物和空白對照擴(kuò)增樣品。在16V/cm恒電場中電泳至指示帶（二甲苯氰）到達(dá)膠板的中部，電泳結(jié)束，關(guān)閉電源。小心分開兩塊玻璃板，取下凝膠附著的玻璃板準(zhǔn)備染色。

4.7 銀染

4.7.1 漂洗：取出膠板，在去離子水中漂洗1min～2min。

4.7.2 染色：將膠板放入約1000mL染色液中，是染色液沒過凝膠，在脫色搖床輕搖8min。

4.7.3 漂洗：取出膠板，用去離子水快速沖洗，時間不超過10s。

4.7.4 顯影：將膠板放入1000mL顯影液中，在脫色搖床輕搖至條帶顯出（約3min～5min左右）。

4.7.5 漂洗：在去離子水中漂洗膠板2min，取出后將玻璃板放入凝膠成像儀觀察，記錄結(jié)果，拍照保存。

5. 結(jié)果

由圖1，圖2可知普通20ul SSR-PCR反應(yīng)體系與優(yōu)化10ul SSR-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果差別不明顯，都可以用于黑木耳SSR分子標(biāo)記后續(xù)分析。