本發(fā)明屬于化合物制備領(lǐng)域，提供了天然化合物—人參皂苷rk1（ginsenosiderk1）的制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人參皂苷rk1（ginsenosiderk1）是一種稀有人參皂苷，在人參中含量極少，在紅參或黑參熱加工過程中大量產(chǎn)生（jin,y.,j.piao,ands.m.lee.,evaluatingthevalidityofthebradenscaleusinglongitudinalelectronicmedicalrecords.jresnurshealth,2015,38,152-61;）。目前，利用高壓酸水解可以高效制備人參皂苷rk1。
在人參加工過程中，二醇類皂苷rb1、rb2、rc、rd等受熱或在微酸環(huán)境中，部分水解可生成人參皂苷20(s，r)-rg3，人參皂苷20(s，r)-rg3在20位碳上的-oh和22位碳上的-h進(jìn)一步脫水而在20位和22位碳之間形成雙鍵，最終生成人參皂苷rk1。
“藥物性肝病”是指由藥物或其代謝產(chǎn)物引起的肝損害。大約75%的肝臟血來自胃腸道和脾臟，經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟。這些血液帶來了大量經(jīng)胃腸道吸收的藥物和外源性毒物。肝臟在解毒這些物質(zhì)的同時(shí)，產(chǎn)生的毒性物質(zhì)造成肝損害（毛穎婕，等.肝損傷的中藥治療研究進(jìn)展，江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011年）
對(duì)乙酰基氨基酚（acetaminophen,apap），又稱“撲熱息痛”，在臨床應(yīng)用中常作為止痛和退燒的藥物。apap在治療劑量時(shí)是安全的，但是急性或蓄積性的過量則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，并有可能進(jìn)一步發(fā)展成肝衰竭。在美國(guó)和英國(guó)，apap過量是肝損傷最常見的原因。apap致急性肝損傷不同于常規(guī)化學(xué)物質(zhì)致肝損傷，其病因較為復(fù)雜和特殊。apap在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生自由基而引起肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，并且通過鈣穩(wěn)態(tài)而產(chǎn)生細(xì)胞毒素，導(dǎo)致嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷，通過肝臟病理切片可以看到嚴(yán)重的炎性浸潤(rùn)和大面積的細(xì)胞壞死（顧興麗，等.撲熱息痛肝損傷機(jī)制研究進(jìn)展，中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2009年）。
目前，對(duì)于apap肝損傷的治療藥物研究最透徹是n-乙酰半胱氨酸，在美國(guó),該藥為口服，而在大多數(shù)國(guó)家(尤其是歐洲)則喜歡靜脈用藥，療效比較顯著，患者死亡率低。但長(zhǎng)期應(yīng)用容易產(chǎn)生副作用，如可引起咳嗆、支氣管痙攣、惡心、嘔吐、胃炎等不良反應(yīng)。近年來，從天然藥中發(fā)現(xiàn)許多天然化合物具有良好的抗apap肝損傷作用，如中藥菟絲子的乙醇提取物和甘草素被用來治療apap肝損害（yenfl,wuth,linlt,et.al.,hepatoprotectiveandantioxidanteffectsofcuscutachinensisagainstacetaminophen-inducedhepatotoxicityinrats.jethnopharmacol,2007,111,123-128;kimyw,kish,leejr,etal.liquiritigenin,anaglyconeofliquiritininglycyrrhizaeradix,preventacuteliverinratsinducedbyacetaminophenwithorwithoutbuthioninesulfoximine.chembiolinteract,2006,161,125-138）。不難看出，天然藥安全，可靠，廉價(jià)易得，從天然藥物中尋找預(yù)防和治療apap誘導(dǎo)肝損傷具有廣闊的前景。
研究發(fā)現(xiàn)：人參皂苷rk1具有多種藥理活性，如抗癌，提高免疫力及益智等功能（關(guān)大鵬，等.高溫?zé)崃呀馊藚⒃碥誶k1和rg5的制備工藝優(yōu)化，上海中醫(yī)藥雜志，2015年）。到目前為止，未見有關(guān)人參皂苷rk1（ginsenosiderk1）對(duì)“對(duì)乙?；被印彼录毙愿螕p傷保護(hù)作用的報(bào)道，本發(fā)明創(chuàng)造性的提出并證明了該成分可以預(yù)防和治療急性肝損傷。
人參皂苷rk1可以通過化學(xué)處理廉價(jià)易得的人參莖葉皂苷生產(chǎn)二醇型皂苷，進(jìn)而水解產(chǎn)生而獲得，是一種非常有前途和開發(fā)價(jià)值的肝損傷保護(hù)劑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了人參皂苷rk1（以下簡(jiǎn)稱“rk1”）在制備預(yù)防對(duì)乙酰基氨基酚（apap）誘導(dǎo)的急性肝損傷藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的人參皂苷rk1在用于上述用途時(shí)，其口服或胃腸外給藥，均是安全的，在口服情況下，其可以以任何常規(guī)的形式給藥，如片劑，膠囊劑，粉針劑，注射劑，丸劑，軟膠囊，顆粒劑和貼劑等。
本發(fā)明制備保護(hù)急性肝損傷藥物是由有效單體或有效成分與固體或液體的賦形劑一起構(gòu)成的，這里使用的固體或液體的賦形劑在本領(lǐng)域是眾所周知的，下面舉幾個(gè)例子，散劑是內(nèi)服的粉末劑，它的賦形劑有乳糖，淀粉，糊精，碳酸鈣，合成或天然硫酸鋁，氧化鎂，硬脂酸鎂，碳酸氫鈉，干燥酵母等；溶液劑的賦形劑有水，甘油，1，2-丙二醇，單糖漿，乙醇，乙二醇，聚乙二醇，山梨糖醇等；軟膏劑的賦形劑可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蠟、木蠟、液體石蠟等組合成的疏水劑或親水劑。本發(fā)明的藥物組合物可以按現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法如混合、制粒、壓片來制備。本發(fā)明藥物組合物還可以包括各種藥學(xué)使用的任何組分，如香味劑、著色劑、甜味劑等。
本發(fā)明的有益效果在于，人參皂苷rk1可以利用富含人參皂苷的提取物進(jìn)行酸水解而得到，其容易獲得，工業(yè)化前景好，同時(shí)具有療效顯著和毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明可以通過下面的實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步說明。
實(shí)驗(yàn)例.人參皂苷rk1的制備方法
1、選用比例為10%的冰醋酸水溶液1.0l作為反應(yīng)液，保持冰乙酸水溶液處于0~4℃，之后添加100g人參二醇組皂苷，二醇組皂苷經(jīng)hplc分析主要含有人參皂苷rb1,rb2,rc和rd等，總含量約為92%，邊加邊攪動(dòng)。將反應(yīng)液置于80~90℃水浴反應(yīng)2小時(shí)，靜置取沉淀即得兩種構(gòu)型的人參皂苷rg3粗品59.5g，再經(jīng)80℃含0.1%吡啶的熱乙醇溶解、冷卻及重結(jié)晶即得50.2g的人參皂苷rk1，得率>50%。
2、選用比例為20%的冰醋酸水溶液1.0l作為反應(yīng)液，保持冰乙酸水溶液處于0~4℃，之后添加100g人參二醇組皂苷，二醇組皂苷經(jīng)hplc分析主要含有人參皂苷rb1,rb2,rc和rd等，總含量約為92%，邊加邊攪動(dòng)。將反應(yīng)液置于80~90℃水浴反應(yīng)2小時(shí)，靜置取沉淀即得兩種構(gòu)型的人參皂苷rg3粗品62.5g，再經(jīng)80℃含0.3%吡啶的熱乙醇溶解、冷卻及重結(jié)晶即得52.5g的人參皂苷rk1，得率>50%。
3、選用比例為30%的冰醋酸水溶液1.0l作為反應(yīng)液，保持冰乙酸水溶液處于0~4℃，之后添加100g人參二醇組皂苷，二醇組皂苷經(jīng)hplc分析主要含有人參皂苷rb1,rb2,rc和rd等，總含量約為92%，邊加邊攪動(dòng)。將反應(yīng)液置于80~90℃水浴反應(yīng)2小時(shí)，靜置取沉淀即得兩種構(gòu)型的人參皂苷rk1粗品65.2g，再經(jīng)80℃含0.5%吡啶的熱乙醇溶解、冷卻及重結(jié)晶即得56.1g的人參皂苷rk1，得率>50%。
上述制備方法優(yōu)選含0.1-0.5的吡啶溶劑，經(jīng)hplc分析，不加吡啶處理，其rk1得率在37-42%，明顯少于加吡啶溶劑的熱乙醇。
實(shí)驗(yàn)例.人參皂苷rk1對(duì)apap誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)作用
1材料和方法
1.1材料、試劑及儀器
人參皂苷rk1，ginsenosiderk1，純度>98.5%(hplc)；對(duì)乙?；被?apap,純度>99%)。
谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)、還原型谷胱甘肽(gsh)和丙二醛(mda)試劑盒等均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、白介素1β(il-1β)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)r&d公司。
bp211d電子天平，德國(guó)sartorius公司；dk-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；hc-2517高速離心機(jī)，安徽中科中佳公司；epoch超微量微孔板分光光度計(jì)，美國(guó)伯騰儀器有限公司；fsh-2a可調(diào)高速勻漿機(jī)，金壇市華城海龍實(shí)驗(yàn)儀器廠。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
雄性icr小鼠32只，體重（25±2g）購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。所有小鼠允許自由進(jìn)食水和維持飼料，25±2℃的溫度，50±10%的相對(duì)濕度下晝夜交替循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)必須按照中華人民共和國(guó)國(guó)家科技委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行。
1.3動(dòng)物分組與給藥：
給藥組按劑量每天灌胃給藥一次，連續(xù)7天，正常對(duì)照組和模型組灌胃等體積純凈水。末次給藥后開始斷糧，1h后對(duì)模型組和給藥組小鼠一次性腹腔注射250mg/kg的apap生理鹽水溶液，造模24h后依次對(duì)各組小鼠進(jìn)行眼球取血，3000r/min離心10min分離血清，4℃保存?zhèn)溆?；迅速解剖取肝臟及脾臟。經(jīng)4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重，取部分肝臟于10%的甲醛溶液中固定，待切片，剩余肝臟-80℃低溫冰箱中保存。
1.4血清中生化指標(biāo)的測(cè)定：
采集小鼠血液分離血清，按照試劑盒方法測(cè)定，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)，腫瘤壞死因子(tnf-α)，白細(xì)胞介素-1β(il-1β)。
1.5肝臟中生化指標(biāo)的測(cè)定：
取部分肝臟稱重，加入9倍體積的冰生理鹽水，用組織勻漿機(jī)制得10%的肝組織勻漿，離心取上清液。按照試劑盒方法點(diǎn)板，在450nm處測(cè)定od值，根據(jù)公式計(jì)算肝臟中mda的含量和gsh的活性。
1.6肝組織病理學(xué)觀察
取部分肝臟組織置于10%的中性甲醛溶液中固定，低濃度到高濃度酒精脫水，二甲苯中透明，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟后用h&e染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化。
1.7數(shù)據(jù)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(
結(jié)果：
2.1人參皂苷rk1對(duì)小鼠一般狀態(tài)、體重及肝指數(shù)的影響
與正常對(duì)照組小鼠相比，apap模型組小鼠攝食量和飲水量均減少，肝脾指數(shù)顯著升高(p<0.01)，肝臟有損傷現(xiàn)象，代謝器官受損嚴(yán)重；rk1給藥組，小鼠狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，可以明顯改善apap所致的肝指數(shù)下降(p<0.01,p<0.05)，結(jié)果如表1所示。
表1人參皂苷rk1對(duì)apap致肝損傷小鼠體重、臟器指數(shù)的影響(n=8)
注：與空白組相比**p<0.01；與模型組相比##p<0.01,#p<0.05
2.2人參皂苷rk1有效減少apap致血清alt和ast的水平
從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，apap會(huì)導(dǎo)致血清中的alt和ast活性明顯升高(p<0.01)，rk1給藥組與模型組比alt和ast活性均有顯著的降低(p<0.01)。結(jié)果如表2所示。
表2.人參皂苷rk1對(duì)apap誘導(dǎo)的肝損傷小鼠alt和ast的影響
注：與空白組相比**p<0.01；與模型組相比##p<0.01
2.3人參皂苷rk1有效減少apap致血清tnf-α和il-1β水平
tnf-α是細(xì)胞信號(hào)因子，可以促進(jìn)急性反應(yīng)的發(fā)生，il-1β被認(rèn)為是細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，正常細(xì)胞中升高會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。apap使血清中tnf-α和il-1β的濃度明顯升高(p<0.01,p<0.05)。給予rk1治療后tnf-α和il-1β與模型組比明顯的下降（p<0.01,p<0.05），降低了炎癥反應(yīng)。結(jié)果如表3.
表3.人參皂苷rg3對(duì)apap導(dǎo)致急性肝損傷小鼠tnf-α和il-1β的影響
注：與空白組相比**p<0.01,*p<0.05；與模型組相比##p<0.01,#p<0.05
2.4人參皂苷rk1有效減少apap致肝組織氧化應(yīng)激損傷
與空白組相比，模型組小鼠肝組織勻漿中mda含量明顯的上升，gsh水平顯著下降(p<0.01)，使小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物累積，抗氧化代謝水平降低；與模型組相比，人參皂苷rk1給藥組mda含量明顯的下降(p<0.01,p<0.05)，gsh水平均顯著升高(p<0.05)，表明人參皂苷rk1可以在一定程度上緩解apap引起的脂質(zhì)過氧化，調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化代謝水平，結(jié)果如表4所示。
表4.人參皂苷rk1對(duì)apap肝損傷小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化影響
注：與空白組相比**p<0.01；與模型組相比##p<0.01,#p<0.05
2.5人參皂苷rk1有效減少apap致肝組織壞死和炎性浸潤(rùn)
通過對(duì)肝臟組織病理學(xué)的觀察，空白組具有完整的肝小葉和圓潤(rùn)而飽滿的肝細(xì)胞。模型組的細(xì)胞發(fā)生了結(jié)構(gòu)的變化，主要的特征是細(xì)胞水腫和變性，出現(xiàn)大面積的炎性浸潤(rùn)和細(xì)胞壞死，rk1的給藥組有效的減輕了apap的損傷，炎性浸潤(rùn)明顯降低，細(xì)胞壞死的區(qū)域明顯減少，也使肝細(xì)胞數(shù)量明顯增加，圖略。
人參皂苷rk1有效減少apap致肝細(xì)胞凋亡
為了確定rk1對(duì)apap導(dǎo)致的小鼠肝組織肝毒性的保護(hù)作用，進(jìn)行了肝組織的hoechst染色。結(jié)果表明：對(duì)照組小鼠肝組織中細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，經(jīng)hoechst染色后未見細(xì)胞皺縮及凋亡發(fā)生；而經(jīng)apap處理的模型組，可以明顯看見細(xì)胞核皺縮，可見部分碎片，呈致密濃染，推測(cè)apap會(huì)誘導(dǎo)小鼠腎組織細(xì)胞凋亡。與比模型組比較，rk1給藥組明顯改善，圖略。
人參皂苷rk1顯著減少apap所致的硝基化
通過免疫組織化學(xué)染色分析，空白組3-nt(3-硝基酪氨酸)表達(dá)幾乎不可見，而模型組肝組織中3-nt(3-硝基酪氨酸)表達(dá)明顯增加。經(jīng)過rk1預(yù)給藥治療后，rk1兩個(gè)劑量組的肝組織中3-硝基酪氨酸表達(dá)明顯減弱，表明rk1能夠有效減少apap所致的硝基化。
結(jié)論
人參皂苷rk1在10和20mg/kg劑量范圍內(nèi)，可以顯著改善對(duì)乙?；被诱T導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，主要通過改善急性氧化應(yīng)激水平、降低炎癥因子及抗凋亡等，是一種很有前景的藥物肝損傷保護(hù)劑。
實(shí)施例藥物的實(shí)施例
制備藥劑的實(shí)施例一
膠囊劑的制備200g人參皂苷rk1，藥用淀粉適量，兩者充分混勻，裝膠囊，制成1000粒膠囊，每粒重0.25g，每粒含人參皂苷rk1200mg?？诜?，每次4粒，每日三次。
制備藥劑的實(shí)施例二
片劑的制備200g人參皂苷rk1，藥用淀粉適量，兩者充分混勻，用乙醇做粘合劑制濕顆粒，干燥，過120目篩整粒，裝膠囊，每粒200mg，每次口服1-2粒，每日2次。
制備藥劑的實(shí)施例三
滴丸劑的制備聚乙二醇4000300g，在水浴上熔化，加入人參皂苷rk1原料200g，攪拌均勻，傾入保溫管中，調(diào)節(jié)恒溫裝置，使藥液在80-90℃下滴入冷卻過的液體石蠟中（溫度±4℃），滴完后，將藥丸傾入濾紙上吸干石蠟油，再加入少量滑石粉，混勻，得人參皂苷rk1滴丸1000粒?？诜?，一次4粒，每日三次，飯后服用。
以上根據(jù)上述實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的人參皂苷rk1在制備預(yù)防急性肝損傷藥物的應(yīng)用進(jìn)行了說明，但本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，在不脫離其要旨的范圍內(nèi)，可在各種方式中實(shí)施本發(fā)明。除了上述實(shí)施方式之外，其它等同技術(shù)方案也應(yīng)當(dāng)在其保護(hù)范圍之內(nèi)，在此不再一一敘述。