本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域:
,特別是用于人二倍體細(xì)胞在生物反應(yīng)器微載體放大培養(yǎng)過程中的一種有效傳代的方法。
背景技術(shù):
:MRC-5,KMB17,WI-38等人二倍體細(xì)胞是來源于人體正常組織的體外培養(yǎng)細(xì)胞,無潛在致癌性,無外源因子污染,而且具有廣泛的病毒敏感譜,目前被認(rèn)為是最安全的、最適宜的細(xì)胞基質(zhì),已被廣泛應(yīng)用于疫苗的生產(chǎn)。動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于生物制品的生產(chǎn)。20世紀(jì)80年代以來,集生物反應(yīng)器和微載體為一體的培養(yǎng)技術(shù)已逐步建立,此技術(shù)兼具單層貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì),微載體的比表面積大,可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng);同時(shí)生物反應(yīng)器容易測(cè)量與監(jiān)控工藝參數(shù),重現(xiàn)性好,生產(chǎn)效率高,可實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。使用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行生物制品的生產(chǎn)是生物制藥行業(yè)的必然趨勢(shì)。放大培養(yǎng)是生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。微載體培養(yǎng)放大到下一級(jí)反應(yīng)器的基本轉(zhuǎn)移模式有胰酶消化轉(zhuǎn)移和球轉(zhuǎn)球轉(zhuǎn)移。球轉(zhuǎn)球轉(zhuǎn)移是指在直接將上一級(jí)培養(yǎng)物(長滿細(xì)胞的微載體)作為種子接入到下一級(jí)生物反應(yīng)器中,通過細(xì)胞在舊球和新球之間的重新分配而實(shí)現(xiàn)放大培養(yǎng),這種放大方法的優(yōu)點(diǎn)在于操作步驟少,污染機(jī)會(huì)小,微載體利用率高。但是對(duì)于平板效率比較低的細(xì)胞而言,細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率低,空球率高,而且新舊載體上的細(xì)胞生長狀態(tài)不同步,代次不一,因此球轉(zhuǎn)球的放大方式不能滿足大規(guī)模藥品生產(chǎn)的要求。胰酶消化轉(zhuǎn)移是貼壁依賴型細(xì)胞最常用的消化模式,利用胰酶將細(xì)胞從微載體上消化下來,然后將細(xì)胞懸液加入到下一級(jí)生物反應(yīng)器,粘附到新的微載體上進(jìn)行培養(yǎng)。人二倍體細(xì)胞的生物反應(yīng)器的放大培養(yǎng)一直是疫苗規(guī)?;a(chǎn)中的難點(diǎn)。人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)難度大,平板效率低,除了對(duì)培養(yǎng)基和牛血清等營養(yǎng)成分的要求比較高外,對(duì)pH、滲透壓、胰酶作用、剪切力等環(huán)境刺激也非常敏感。在物反應(yīng)器微載體放大培養(yǎng)過程中,尤其消化過程中,消化超出一定時(shí)限后胰酶引起的損傷,攪拌和通氣造成的剪切力,微載體沉淀時(shí)對(duì)細(xì)胞的機(jī)械擠壓,更換清洗液、消化液和培養(yǎng)液時(shí)pH、滲透壓的變化,都容易使細(xì)胞遭到損傷,造成細(xì)胞活力降低,粘附效率下降、傳代后細(xì)胞生長緩慢,從而對(duì)放大培養(yǎng)造成了限制,阻礙了生產(chǎn)效率的提高。因此摸索合適的胰酶消化方法和作用時(shí)間、微載體與細(xì)胞的分離方法、放大培養(yǎng)過程中有效傳代后合適的起始培養(yǎng)條件,提高細(xì)胞活力、細(xì)胞收獲率和細(xì)胞粘附率是人二倍體細(xì)胞微載體放大培養(yǎng)的關(guān)鍵,目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有生物反應(yīng)器和微載體培養(yǎng)人二倍體細(xì)胞的消化傳代方法中細(xì)胞活力、收獲率和粘附率低,以及粘附不均勻的不足,提供一種人二倍體細(xì)胞在生物反應(yīng)器和微載體放大培養(yǎng)過程中有效傳代的方法,該方法能提高傳代過程中細(xì)胞的活力、粘附率和粘附均勻度,使傳代效率得到提高,廣泛用于疫苗規(guī)?;a(chǎn)。本發(fā)明用微載體培養(yǎng)人二倍體細(xì)胞種子,在種子培養(yǎng)體系中預(yù)平衡空白微載體,用含檸檬酸鈉的胰酶消化液消化微載體上的種子細(xì)胞,在種子反應(yīng)器中溫和地間歇攪拌培養(yǎng)3-6小時(shí),再轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增反應(yīng)器中擴(kuò)增培養(yǎng),得到人二倍體細(xì)胞微載體放大培養(yǎng)過程中有效的傳代。本發(fā)明人二倍體細(xì)胞微載體培養(yǎng)有效傳代的方法,該方法人二倍體細(xì)胞為MRC-5或KMB17細(xì)胞,微載體為cytodex1,用微載體培養(yǎng)人二倍體細(xì)胞種子,當(dāng)種子反應(yīng)器中微載體上培養(yǎng)的人二倍體細(xì)胞長至匯合度80%以上時(shí),將預(yù)處理好的空白微載體加入到種子反應(yīng)器中與細(xì)胞種子培養(yǎng)物共同培養(yǎng)6小時(shí)以上或過夜,用含檸檬酸鈉的胰酶消化液消化微載體上的種子細(xì)胞,加入完全培養(yǎng)基中和后在種子反應(yīng)器中溫和地間歇攪拌,起始培養(yǎng)3-6小時(shí),再將起始培養(yǎng)物從種子反應(yīng)器轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增反應(yīng)器中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),得到人二倍體細(xì)胞微載體放大培養(yǎng)過程中有效的傳代。本發(fā)明微載體的濃度為1-10克/升,空白微載體的預(yù)處理是指干的cytodex1微載體經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)水化過夜、洗滌3-5次、121℃高壓滅菌處理后,用預(yù)熱至37℃的基礎(chǔ)培養(yǎng)基潤洗置換1-2次;空白微載體和種子反應(yīng)器中原有的微載體的比例為2:1-5:1。本發(fā)明所述的消化微載體上的種子細(xì)胞,包括以下步驟:①停止種子生物反應(yīng)器的攪拌,使反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞種子培養(yǎng)物和新加入的微載體自然沉降,排去上清培養(yǎng)液,用預(yù)熱至37℃洗滌液攪拌洗滌微載體及細(xì)胞1-3次。所述的洗滌液為含0.01%EDTA-2Na的D-Hanks,洗滌液和微載體的比例為100-200毫升/克cytodex1,攪拌速度為30-50rpm,洗滌時(shí)間為5-10分鐘。②用預(yù)熱至37℃的消化液間歇攪拌消化細(xì)胞,取樣鏡檢觀察細(xì)胞消化狀態(tài)、檢測(cè)脫落細(xì)胞濃度和活率從而控制消化時(shí)間。消化液的組成成份為:0.8%氯化鈉、0.02%氯化鉀、0.005%二水磷酸氫二鈉、0.1%葡萄糖、0.1%碳酸氫鈉、0.3%二水檸檬酸鈉、0.25%胰酶、0.002%酚紅;消化液和微載體的比例為:20-30毫升/克cytodex1;消化pH值:7.4-8.0;消化攪拌轉(zhuǎn)速:50-150rpm,每5分鐘攪拌1分鐘間歇攪拌;消化溫度:36-38℃;消化總時(shí)間:5-20分鐘;每5分鐘取樣觀察消化程度,90%以上的細(xì)胞從微載體上脫落后,加入完全培養(yǎng)基中和,50-100rpm攪拌1-3分鐘混勻載體和細(xì)胞。本發(fā)明起始培養(yǎng)在種子反應(yīng)器中進(jìn)行,按照每15-45分鐘攪拌1-3分鐘的頻率進(jìn)行溫和地間歇攪拌,攪拌速度為20-50rpm,采取能攪起全部微載體的最小速度和最短時(shí)間。培養(yǎng)參數(shù)為溫度35-37℃,pH值7.2-7.4,溶氧(DO)30%-50%。起始培養(yǎng)時(shí)間為3-6小時(shí),期間每3小時(shí)取樣觀察細(xì)胞粘附情況;再將起始培養(yǎng)物從種子反應(yīng)器轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增反應(yīng)器中進(jìn)行放大有效傳代培養(yǎng)。本發(fā)明具體技術(shù)方案如下:1.人二倍體細(xì)胞在生物反應(yīng)器微載體放大培養(yǎng)過程中有效傳代的方法,包括下列步驟:⑴在種子反應(yīng)器中用微載體培養(yǎng)人二倍體細(xì)胞;⑵在種子培養(yǎng)體系中預(yù)平衡微載體;⑶洗滌、消化種子細(xì)胞;⑷在種子反應(yīng)器中起始培養(yǎng);⑸在擴(kuò)增反應(yīng)器中擴(kuò)增培養(yǎng)。本發(fā)明所述步驟⑴中人二倍體細(xì)胞為MRC-5或KMB17細(xì)胞,該種子培養(yǎng)物中微載體為cytodex1,微載體的濃度為1-10克/升,所述細(xì)胞在微載體上的匯合度不小于80%。本發(fā)明技術(shù)方案所述步驟⑵的預(yù)平衡是指空白的微載體經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)水化過夜、洗滌3-5次和121℃高壓滅菌處理后,用預(yù)熱至37℃的基礎(chǔ)培養(yǎng)基潤洗置換1-2次,當(dāng)種子反應(yīng)器的細(xì)胞在微載體上生長至匯合度為80%以上時(shí),將空白微載體加入到種子反應(yīng)器中與細(xì)胞種子培養(yǎng)物共同培養(yǎng)6小時(shí)以上或過夜。新加入的空白微載體和種子反應(yīng)器中原有的微載體的比例為2:1-5:1。本發(fā)明技術(shù)方案所述步驟⑶中洗滌消化細(xì)胞,包括以下步驟:①停止種子生物反應(yīng)器的攪拌,使反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞種子培養(yǎng)物和新加入的微載體自然沉降,排去上清培養(yǎng)液,用預(yù)熱至37℃洗滌液洗滌微載體及細(xì)胞1-3次,洗滌液為含0.01%EDTA-2Na的D-Hanks,微載體和洗滌液的比例為100-200毫升/克cytodex1,攪拌速度為30-50rpm,洗滌時(shí)間為5-10分鐘。②用預(yù)熱至37℃的消化液消化細(xì)胞,消化液的組成成份為:含0.8%氯化鈉、0.02%氯化鉀、0.005%二水磷酸氫二鈉、0.1%葡萄糖、0.1%碳酸氫鈉、0.3%二水檸檬酸鈉、0.25%胰酶(1:250)、0.002%酚紅(pH7.5-8.0);消化液和微載體的比例為:20-30毫升/克cytodex1;消化pH值:7.4-8.0;消化攪拌轉(zhuǎn)速:50-150rpm,每隔4分鐘攪拌1分鐘間歇攪拌;消化溫度:36-38℃;消化總時(shí)間:5-20分鐘;每5分鐘取樣觀察消化程度,90%以上的細(xì)胞從微載體上脫落后,加入完全培養(yǎng)基中和,50-100rpm攪拌1-3分鐘混勻載體和細(xì)胞;取樣鏡檢觀察細(xì)胞消化狀態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞濃度及活率。本發(fā)明技術(shù)方案所述步驟⑷中在種子反應(yīng)器中起始培養(yǎng):加入完全培養(yǎng)基至種子反應(yīng)器的培養(yǎng)體積,按照每15-45分鐘攪拌1-3分鐘的頻率進(jìn)行溫和地的間歇攪拌,攪拌速度為20-50rpm,采取能攪起全部微載體的最小速度和最短時(shí)間;其它培養(yǎng)參數(shù)為溫度35-37℃,pH值7.2-7.4,溶氧(DO)30%-50%;起始培養(yǎng)時(shí)間為3-6小時(shí),期間每3小時(shí)取樣觀察細(xì)胞粘附情況。本發(fā)明技術(shù)方案所述步驟⑸中擴(kuò)增培養(yǎng):擴(kuò)增反應(yīng)器事先加入完全培養(yǎng)基按照培養(yǎng)參數(shù)(37℃,pH7.2-7.4,DO50-70%,30-70rpm)進(jìn)行預(yù)熱。種子經(jīng)起始培養(yǎng)3-6小時(shí),細(xì)胞95%以上粘附至微載體后,將起始培養(yǎng)物從種子反應(yīng)器轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增反應(yīng)器中進(jìn)行放大培養(yǎng),定期檢測(cè)細(xì)胞生長及代謝情況,根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行培養(yǎng)基補(bǔ)給。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在如下幾個(gè)方面:1、本發(fā)明中新微載體用培養(yǎng)基進(jìn)行潤洗和加入到種子培養(yǎng)物中預(yù)平衡,使新載體在合適的pH、滲透壓及含有粘附分子、細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)液中平衡到最適于細(xì)胞粘附和生長的微環(huán)境,有利于粘附效率的提高和縮短接種后的延滯期。同時(shí),新加入的空白微載體與原有的微載體在同一環(huán)境中培養(yǎng),使其趨于一致,也有利于提高粘附的均勻度。2、本消化液成分以及檸檬酸鈉和氯化鉀代替EDTA,有利于提高消化效率,增加細(xì)胞分散度,縮短消化時(shí)間,減少對(duì)細(xì)胞的損害,提高細(xì)胞活力。3、預(yù)平衡、洗滌、消化和傳代后的起始培養(yǎng)都在種子反應(yīng)器中進(jìn)行,避免了載體和細(xì)胞在不同容器中的多次轉(zhuǎn)移,減少了細(xì)胞的損失,降低了污染的風(fēng)險(xiǎn);種子反應(yīng)器中原有的微載體在放大培養(yǎng)后繼續(xù)使用,提高了載體的利用率。4、起始培養(yǎng)在種子反應(yīng)器中進(jìn)行,縮小了培養(yǎng)體積,提高了細(xì)胞和微載體的濃度,從而增加了細(xì)胞和微載體接觸粘附的機(jī)會(huì);對(duì)于貼壁效率低的人二倍體細(xì)胞,在早期階段,間歇溫和地?cái)嚢瑁峁┮欢〞r(shí)間的靜止培養(yǎng),細(xì)胞的粘附速率和粘附比例將會(huì)增加。5、本發(fā)明具有提高傳代過程中細(xì)胞的活力、粘附率和粘附均勻度,使傳代效率得到提高,解決了人二倍體細(xì)胞在生物反應(yīng)器和微載體上放大培養(yǎng)困難的問題,能廣泛用于疫苗規(guī)模化生產(chǎn)。附圖說明圖1是本發(fā)明KMB17細(xì)胞在5升生物反應(yīng)器中起始培養(yǎng)3小時(shí)后的粘附結(jié)果示意圖;圖2是本發(fā)明KMB17細(xì)胞在5升生物反應(yīng)器中起始培養(yǎng)6小時(shí)后的粘附結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方案為了更清楚的理解本發(fā)明,以下用實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例僅用于進(jìn)一步具體說明本發(fā)明,而不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施1MRC-5細(xì)胞的微載體有效傳代培養(yǎng)⑴在1.5升生物反應(yīng)器中微載體培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞種子:將干的2.0克cytodex1微載體加入到合適的硅化過的玻璃瓶中,加入200毫升無Ca2+、Mg2+的PBS混勻后在室溫下水化過夜,用上述PBS洗滌3次,121℃、30分鐘高壓濕熱滅菌后備用。靜置使無菌的微載體沉降,傾去上清,用溫?zé)岬腗EM培養(yǎng)基潤洗置換2次。將微載體轉(zhuǎn)移到1.5升生物反應(yīng)器中,加入500毫升MEM完全培養(yǎng)基,設(shè)置好培養(yǎng)參數(shù):溫度37℃,pH7.2,DO50%,轉(zhuǎn)速30rpm平衡過夜。將7個(gè)T225細(xì)胞瓶的MRC-5細(xì)胞消化后,將細(xì)胞懸液加入到生物反應(yīng)器中,根據(jù)細(xì)胞懸液的量調(diào)整生物反應(yīng)器內(nèi)預(yù)留培養(yǎng)基的體積,至總體積1000毫升。設(shè)置好培養(yǎng)參數(shù):溫度37℃,pH7.2,DO50%,轉(zhuǎn)速30rpm進(jìn)行培養(yǎng),每天兩次檢測(cè)細(xì)胞生長及代謝情況,當(dāng)乳酸濃度大于1.5克/升時(shí),更換一半體積的培養(yǎng)基。(2)空白微載體的預(yù)平衡:將干的10克cytodex1微載體加入到合適的硅化過的玻璃瓶中,加入800毫升無Ca2+、Mg2+的PBS混勻后在室溫下水化過夜,用上述PBS洗滌3次,121℃、30分鐘高壓濕熱滅菌后備用。靜置使無菌的微載體沉降,傾去上清,用溫?zé)岬腗EM培養(yǎng)基潤洗置換3次。在種子反應(yīng)器的細(xì)胞在微載體上生長至匯合度80%以上時(shí),將新載體加入到種子反應(yīng)器中在培養(yǎng)體系中按照種子培養(yǎng)參數(shù)平衡過夜。(3)洗滌、消化種子細(xì)胞:①停止種子生物反應(yīng)器的攪拌,使反應(yīng)器內(nèi)的粘附細(xì)胞的微載體和新加入的微載體自然沉降,排去上清培養(yǎng)液,用1200毫升預(yù)熱至37℃洗滌液洗滌微載體及細(xì)胞,洗滌液為含0.01%EDTA-2Na的D-Hanks,30rpm攪拌重懸微載體及細(xì)胞,攪拌時(shí)間為10分鐘,停止攪拌靜置沉淀后去上清,洗滌3次。②用250毫升預(yù)熱至37℃的消化液(含0.8%氯化鈉、0.02%氯化鉀、0.005%二水磷酸氫二鈉、0.1%葡萄糖、0.1%碳酸氫鈉、0.3%二水檸檬酸鈉、0.25%胰酶(1:250)、0.002%酚紅)消化細(xì)胞,100rpm每5分鐘攪拌1分鐘,37℃消化10-20分鐘。每5分鐘取樣觀察消化程度,10分鐘后,90%以上的細(xì)胞從微載體上脫落,加入300毫升的MEM完全培養(yǎng)基中和,60rpm攪拌1分鐘混勻載體和細(xì)胞。取樣檢測(cè)細(xì)胞濃度及活率。(4)在種子反應(yīng)器中起始培養(yǎng):加入預(yù)熱至37℃的MEM完全培養(yǎng)基至1000毫升,按照每30分鐘攪拌2分鐘的頻率進(jìn)行溫和的間歇攪拌,攪拌速度為30rpm。其它培養(yǎng)參數(shù)為37℃,pH7.2,DO50%,三通氣模式,壓縮空氣、氧氣、二氧化碳(CO2),期間每3小時(shí)取樣觀察細(xì)胞粘附情況。(5)5升生物反應(yīng)器中的擴(kuò)增培養(yǎng):5升生物反應(yīng)器提前5天加入MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基按照培養(yǎng)參數(shù)(37℃,pH7.2,DO50%)進(jìn)行無菌試驗(yàn)。無菌試驗(yàn)通過后,加入3升完全MEM培養(yǎng)基37℃,pH7.2,DO50%進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),種子罐中的培養(yǎng)物起始培養(yǎng)6小時(shí)后,絕大部分細(xì)胞已經(jīng)均勻地粘附到微載體上,將起始培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到5升生物反應(yīng)器中,60rpm攪拌1分鐘攪拌均勻后,37℃,pH7.2,DO50%,三通氣模式,壓縮空氣、氧氣、二氧化碳(CO2),30-50rpm攪拌培養(yǎng),每天取樣檢測(cè)pH值、葡萄糖和乳酸濃度,顯微鏡觀察細(xì)胞在微載體上的生長情況及形態(tài),低滲破細(xì)胞后計(jì)數(shù)細(xì)胞核。根據(jù)細(xì)胞的生長及代謝情況,調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)、灌注新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)給營養(yǎng)。實(shí)施例2KMB17細(xì)胞的微載體有效傳代培養(yǎng)(1)在5.0升生物反應(yīng)器中微載體培養(yǎng)KMB17細(xì)胞種子:將干的10.0克cytodex1微載體加入到合適的硅化過的玻璃瓶中,加入1000毫升無Ca2+、Mg2+的PBS混勻后在室溫下水化過夜,用上述PBS洗滌5次,121℃、30分鐘高壓濕熱滅菌后備用。靜置使無菌的微載體沉降,傾去上清,用溫?zé)岬腗199培養(yǎng)基潤洗置換2次。將微載體轉(zhuǎn)移到1.5升生物反應(yīng)器中,加入500毫升M199完全培養(yǎng)基,設(shè)置好培養(yǎng)參數(shù):溫度37℃,pH7.2,DO50%,轉(zhuǎn)速30rpm平衡過夜。5.0升生物反應(yīng)器提前5天加入M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基按照培養(yǎng)參數(shù)(37℃,pH7.2,DO50%)進(jìn)行無菌試驗(yàn)。無菌試驗(yàn)通過后,加入3.0升M199完全培養(yǎng)基37℃,pH7.2,DO50%進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。將一個(gè)10層細(xì)胞工廠的KMB17細(xì)胞消化后,將細(xì)胞懸液加入到生物反應(yīng)器中,根據(jù)細(xì)胞懸液的量調(diào)整生物反應(yīng)器內(nèi)預(yù)留培養(yǎng)基的體積,至總體積3.5升。設(shè)置好培養(yǎng)參數(shù)(37℃,pH7.2,DO50%,轉(zhuǎn)速30rpm)進(jìn)行培養(yǎng),每天兩次檢測(cè)細(xì)胞生長及代謝情況,2天后開始灌流培養(yǎng),灌流的速度以能維持乳酸濃度低于1.5克/升為準(zhǔn)。(2)空白微載體的預(yù)平衡:將干的20.0克cytodex1微載體加入到合適的硅化過的玻璃瓶中,加入2000毫升無Ca2+、Mg2+的PBS混勻后在室溫下水化過夜,用上述PBS洗滌5次,121℃、30min高壓濕熱滅菌后備用。靜置使無菌的微載體沉降,傾去上清,用溫?zé)岬腗199培養(yǎng)基潤洗置換3次。在種子反應(yīng)器的細(xì)胞在微載體上生長至匯合度80%以上時(shí),將新載體加入到種子反應(yīng)器中在培養(yǎng)體系中按照種子培養(yǎng)參數(shù)平衡過夜。(3)洗滌、消化種子細(xì)胞:①停止種子生物反應(yīng)器的攪拌,使反應(yīng)器內(nèi)的粘附細(xì)胞的微載體和新加入的微載體自然沉降,排去上清培養(yǎng)液,用3.0升預(yù)熱至37℃洗滌液洗滌微載體及細(xì)胞,洗滌液為含0.01%EDTA-2Na的D-Hanks,30rpm攪拌重懸微載體及細(xì)胞,停止攪拌靜置沉淀后去上清,洗滌3次。②用600毫升37℃預(yù)熱的消化液(含0.8%氯化鈉、0.02%氯化鉀、0.005%二水磷酸氫二鈉、0.1%葡萄糖、0.1%碳酸氫鈉、0.3%二水檸檬酸鈉、0.25%胰酶(1:250)、0.002%酚紅)消化細(xì)胞,100rpm每5分鐘攪拌1分鐘,37℃消化10-20分鐘。每5分鐘取樣觀察消化程度,15分鐘后,90%以上的細(xì)胞從微載體上脫落,加入2.5升的M199完全培養(yǎng)基中和,100rpm攪拌2分鐘混勻載體和細(xì)胞;取樣鏡檢觀察細(xì)胞消化狀態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞濃度及活率。(4)在種子反應(yīng)器中起始培養(yǎng):按照每15分鐘攪拌2分鐘的頻率進(jìn)行溫和的間歇攪拌,攪拌速度為30rpm。其它培養(yǎng)參數(shù)為37℃,pH7.2,DO50%,三通氣模式(壓縮空氣、O2、CO2),期間每3小時(shí)取樣觀察細(xì)胞粘附情況。(5)14.0升生物反應(yīng)器中的擴(kuò)增培養(yǎng):14.0升生物反應(yīng)器提前5天加入10.0升M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基按照培養(yǎng)參數(shù):溫度37℃,pH值7.2,溶氧(DO)50%進(jìn)行無菌試驗(yàn)。無菌試驗(yàn)通過后,置換為6.5升M199完全培養(yǎng)基37℃,pH7.2,DO50%進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。種子罐中的培養(yǎng)物起始培養(yǎng)6小時(shí)后,絕大部分細(xì)胞已經(jīng)均勻地粘附到微載體上,將起始培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到14.0升生物反應(yīng)器中,60rpm攪拌2分鐘攪拌均勻后,37℃,pH7.2,DO50%,三通氣模式(壓縮空氣、氧氣、二氧化碳),30-60rpm攪拌培養(yǎng),每天取樣檢測(cè)pH值、葡萄糖和乳酸濃度,顯微鏡觀察細(xì)胞在微載體上的生長情況及形態(tài);根據(jù)細(xì)胞的生長及代謝情況,調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)、灌注新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)給營養(yǎng)。實(shí)施例3傳代過程中細(xì)胞活力,細(xì)胞脫落百分率、細(xì)胞粘附率和細(xì)胞回收率的測(cè)定及計(jì)算(1)在細(xì)胞消化步驟前,取1毫升均勻懸浮的培養(yǎng)物,1000rpm離心5分鐘使載體細(xì)胞沉降,小心移除上清,加入含0.1%結(jié)晶紫的0.1摩爾/升的檸檬酸溶液重懸沉淀,37℃孵育10分鐘后在漩渦混合儀上振蕩5分鐘,然后取樣在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)被染色的釋放的細(xì)胞核,測(cè)得細(xì)胞核濃度乘以培養(yǎng)體積即為消化前細(xì)胞總數(shù);(2)在消化的每5分鐘一次的取樣時(shí),吸取上清,加入含血清完全培養(yǎng)基中和胰酶后,取樣1:1加入臺(tái)盼藍(lán)染色液,作用5分鐘后在TC20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上檢測(cè)細(xì)胞活力;(3)起始培養(yǎng)6小時(shí)后,取2毫升均勻懸浮的培養(yǎng)物,其中1毫升1000rpm離心5分鐘使載體細(xì)胞沉降,同方法⑴計(jì)數(shù)細(xì)胞核濃度,乘以培養(yǎng)體積即為傳代后細(xì)胞總數(shù);另外1毫升靜置5分鐘左右使載體沉降,小心移除上清,同方法⑴計(jì)數(shù)細(xì)胞核濃度,乘以培養(yǎng)體積即為傳代后粘附到微載體上的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞活率:TC20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀直接顯示檢測(cè)結(jié)果;細(xì)胞粘附率:傳代后粘附到微載體上的細(xì)胞數(shù)/傳代后細(xì)胞總數(shù)×100%;細(xì)胞回收率:傳代后細(xì)胞總數(shù)/消化前細(xì)胞總數(shù)×100%。表1傳代效果評(píng)價(jià)結(jié)果實(shí)施例1實(shí)施例2細(xì)胞MRC-5KMB17微載體Cytodex1Cytodex1種子反應(yīng)器體積/培養(yǎng)體積(升)1.5/1.05.0/3.5種子反應(yīng)器微載體濃度(克/升)2.02.9擴(kuò)增反應(yīng)器體積/培養(yǎng)體積(升)5.0/3.514.0/10.0擴(kuò)增反應(yīng)器微載體濃度(克/升)3.43.0細(xì)胞活力(%)9896起始培養(yǎng)6小時(shí)細(xì)胞粘附率(%)10097細(xì)胞回收率(%)9591由表1和圖1、圖2的結(jié)果可以看出,傳代后細(xì)胞活力在95%以上,起始培養(yǎng)3小時(shí),細(xì)胞絕大部分均勻粘附到微載體上,上清中僅觀察到極少量的游離細(xì)胞,起始培養(yǎng)6小時(shí),粘附到微載體的細(xì)胞已經(jīng)伸展開來,細(xì)胞粘附率達(dá)到97%以上,傳代過程的細(xì)胞總回收率在90%以上。本發(fā)明針對(duì)人二倍體細(xì)胞的平板效率低和對(duì)環(huán)境敏感的特性,通過改變或優(yōu)化消化前空白微載體預(yù)平衡的方法、消化液配方和起始培養(yǎng)條件,提高了細(xì)胞在微載體上的粘附效率,減少了傳代過程中對(duì)細(xì)胞造成的損傷,實(shí)現(xiàn)了人二倍體細(xì)胞在生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)過程中的有效傳代,為人二倍體細(xì)胞高密度培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化放大打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。當(dāng)前第1頁1 2 3