本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，涉及一種人癌胚抗原576-669(cea576-669)和熱休克蛋白70樣分子1(hsp70l1)融合基因的重組腺病毒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：熱休克蛋白(heatshockprotein，hsp)是一類在生物進(jìn)化中高度保守、廣泛存在于原核及真核生物中的一類蛋白質(zhì)，在細(xì)胞受到應(yīng)激后表達(dá)增加。hsp在細(xì)胞內(nèi)作為伴侶分子，參與抗原的加工和形成mhc-抗原肽復(fù)合物。近年來，hsp家族明顯的佐劑樣作用引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界的關(guān)注。研究表明，hsp在細(xì)胞受到應(yīng)激后，可以釋放到細(xì)胞外，誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞和t細(xì)胞成熟活化等重要的生理過程，因此與機(jī)體的抗腫瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫性疾病等生理及病理機(jī)制密切相關(guān)，是一類重要的免疫分子(srivastavapk,annurevimmunol.2002；20:395–425)。熱休克蛋白家族按照分子量可以分為四類：hsp90家族、hsp70家族、hsp60家族和小分子hsp家族，其中hsp70家族是hsp中最保守和最主要的一類。許多研究表明，腫瘤細(xì)胞或者病毒感染細(xì)胞來源的hsp70-肽復(fù)合物、hsp70分子聯(lián)合多肽抗原、或者與多肽抗原交聯(lián)的復(fù)合物，能夠明顯誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的cd8+的ctl，單獨(dú)使用hsp70或者單獨(dú)應(yīng)用多肽抗原則無此效應(yīng)，因此hsp在抗原遞呈過程中的佐劑樣作用及小分子肽的免疫原性是hsp介導(dǎo)的免疫治療所不可缺少的兩個(gè)重要部分(todryksm等,immunology.2003；110:1-9；manjilimh等,expertopinbiolther.2004；4:363-373；blacherene等,jimmunotheremphasistumorimmunol.1993；14:352-356；liz等,behringinstmitt.1994；94:37-47；moroiy等,procnatlacadsciusa.2000；97:3485–90)。hsp誘導(dǎo)的特異性ctl反應(yīng)是由于專職抗原遞呈細(xì)胞(apc)上存在hsp的受體，可以使apc特異性地通過hsp受體介導(dǎo)抗原肽的內(nèi)吞(arnold-schildd等,jimmunol.1999；162:3757-3760)；hsp結(jié)合的抗原在胞內(nèi)是通過tap依賴及tap非依賴途徑，被遞呈到mhc-i類分子上，并誘導(dǎo)隨后的ctl反應(yīng)，這種受體被證明存在于dc、巨噬細(xì)胞及b細(xì)胞等apc上，而不存在于t細(xì)胞上(castellinof,jexpmed.2000；191:1957-1964)；因此可以認(rèn)為，hsp通過hsp受體與apc相互作用是hsp作為佐劑的一個(gè)重要機(jī)理。研究表明，這種受體介導(dǎo)的抗原遞呈方式的效率比吞噬高10000倍。hsp70分子在胞外可以行使類似細(xì)胞因子樣作用。hsp70可與單核細(xì)胞產(chǎn)生高親和力的結(jié)合，誘導(dǎo)其產(chǎn)生il-6、il-1等活性細(xì)胞因子，并可以誘導(dǎo)dc成熟，上調(diào)其mhc-ii和cd86分子表達(dá)，分泌il-12和tnf-α，從而增強(qiáng)dc的抗原遞呈能力(svenssonpa等；atherosclerosis.2006；185:32-38)。因此，采用hsp作為免疫佐劑協(xié)同腫瘤抗原誘導(dǎo)dc，可以靶向性介導(dǎo)抗原的遞呈，增強(qiáng)抗原的遞呈效率，從而誘導(dǎo)更強(qiáng)的ctl反應(yīng)。在明確了hsp的獨(dú)特佐劑效應(yīng)的基礎(chǔ)上，利用hsp的佐劑作用誘導(dǎo)抗腫瘤和抗感染免疫因此成為熱點(diǎn)，基于hsp的新一代疫苗紛紛進(jìn)入臨床試驗(yàn)研究?；趆sp的疫苗構(gòu)成概括起來主要有以下幾種方式：1、從腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞純化hsp-肽復(fù)合物，用純化的hsp-肽復(fù)合物體內(nèi)免疫激發(fā)抗腫瘤或抗感染免疫。hsp肽復(fù)合物用于腫瘤治療具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樘崛〉膆sp肽復(fù)合物可以直接用于免疫治療，不需要鑒定其中所包含的腫瘤特異性抗原表位。不足的是，此方案多采用個(gè)體化治療方案，即免疫所用的hsp-肽復(fù)合物需要來源于自體腫瘤細(xì)胞。2、通過原核和真核表達(dá)得到hsp，通過體外交聯(lián)使合成的表位肽結(jié)合于hsp肽結(jié)合袋，再用交聯(lián)的hsp-肽復(fù)合物誘導(dǎo)抗腫瘤或抗感染免疫。3、hsp抗原的融合蛋白免疫。4、hsp抗原基因融合表達(dá)的dna疫苗或腺病毒疫苗。自體腫瘤來源的gp96-肽復(fù)合物(hsppc-96)已進(jìn)入以腎細(xì)胞癌為代表的多種惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)，目前已證實(shí)病人對(duì)多個(gè)不同應(yīng)用劑量均有良好的耐受性(caudillmm和liz.expertopinbiolther.2001；1(3):539-47.)。cohen等用hsppc-96治療36例iv期腎細(xì)胞癌的臨床i期和iii-iv期黑色素瘤的ii期臨床結(jié)果顯示，治療組生存質(zhì)量顯著提高(cohenl等；melanomares.200212(5):505-11.)。belli用hsppc-96治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，未見明顯毒副作用，28例病人中，2例cr(completeresponse)，3例sd(stabledisease)，cr持續(xù)時(shí)間分別超過了559和703天；取經(jīng)治病人的外周血單個(gè)核細(xì)胞作elispot檢測(cè)，23例中11例黑色素瘤特異性t細(xì)胞顯著增加(bellif等,jclinoncol.2002；20(20):4169-80.)。stressgen公司用hsp65和hpve7抗原的融合蛋白構(gòu)成的疫苗hspe7(sgn-00101)對(duì)hpv感染和相關(guān)腫瘤的治療已被證實(shí)安全有效，現(xiàn)正進(jìn)行臨床iii期試驗(yàn)?？梢?，基于hsp的新一代疫苗具有非常好的臨床應(yīng)用前景(maciagpc,patersony.curropinmolther.2005；7(3):256-263；hunts.curropinmolther.2001；3(4):413-417.)。中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室通過對(duì)重要的抗原遞呈細(xì)胞——樹突狀細(xì)胞cdna文庫(kù)大規(guī)模測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一種人hsp70家族的新分子，將之命名hsp70l1，并克隆了其全長(zhǎng)cdna(genbank登錄號(hào)為af143723)，其表達(dá)產(chǎn)物已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)枺?9124271.8)。由于hsp70l1在氨基酸序列上與小鼠hsp70具有90％以上的序列一致性和相似性，序列中含有經(jīng)典的hsp70家族的序列標(biāo)簽，已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)dc-hsp可以通過熱誘導(dǎo)、pma/tnfα刺激及細(xì)菌等誘導(dǎo)表達(dá)，與經(jīng)典熱休克蛋白的特性相似。生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)提示該蛋白具有一定的免疫佐劑樣作用，可以誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，通過fitc標(biāo)記及已知hsp家族成員的作用，初步證實(shí)dc表面存在dc-hsp結(jié)合位點(diǎn)，具有與經(jīng)典hsp70家族非常相似的特點(diǎn)。研究表明，hsp70l1對(duì)于模擬腫瘤抗原具有良好的佐劑樣作用(want等,blood，2004；103:1747-1754)；hsp70l1與特異性腫瘤抗原cea576-669的融合原核蛋白也能誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的抗腫瘤免疫反應(yīng)(中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)枺?00410053313.x；wuy等,cancerres，2005；65:4947-4954)。本領(lǐng)域中仍然迫切需要開發(fā)出可高效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移及表達(dá)、并可用作有效抗腫瘤的基因轉(zhuǎn)移載體及其產(chǎn)品。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一正是提供一種通過同源重組獲得的重組腺病毒，使用該重組腺病毒可實(shí)現(xiàn)對(duì)hsp70l1與人癌胚抗原融合蛋白基因的有效攜帶、轉(zhuǎn)移和表達(dá)。本發(fā)明的另一目的是提供一種由該重組腺病毒轉(zhuǎn)染的人樹突狀細(xì)胞，其可用于動(dòng)物的腫瘤治療。本發(fā)明的又一目的是提供本發(fā)明的重組腺病毒或其致敏的人樹突狀細(xì)胞在癌癥治療中的用途。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種通過同源重組獲得的重組腺病毒，其攜帶熱休克蛋白與癌胚抗原的融合蛋白的編碼序列，該腺病毒的基因組缺失e1區(qū)和e3區(qū)，并且在e1和/或e3區(qū)位置插入了所述融合蛋白編碼序列的表達(dá)盒，該表達(dá)盒依次包括：?jiǎn)?dòng)子序列、所述融合蛋白的編碼序列以及加尾信號(hào)序列，其中所述熱休克蛋白選自：hsp70或hsp70l1。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述熱休克蛋白為hsp70l1。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述癌胚抗原選自：人癌胚抗原的全長(zhǎng)序列或含人癌胚抗原的第576-669位的片段。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述癌胚抗原為人癌胚抗原的第576-669位的片段。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述融合蛋白的編碼序列從5'至3'依次具有：癌胚抗原編碼序列、任選的連接肽編碼序列和熱休克蛋白編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述融合蛋白具有seqidno:2所示的氨基酸序列，或由seqidno:1所示的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述連接肽的長(zhǎng)度為0-10個(gè)氨基酸，優(yōu)選1-5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選2-4個(gè)氨基酸，優(yōu)選所述連接肽的編碼序列為sali酶切位點(diǎn)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組腺病毒是通過選自下組的同源重組法獲得的：細(xì)胞內(nèi)同源重組、細(xì)菌內(nèi)同源重組、cos/tpc共轉(zhuǎn)染同源重組或位置特異性重組，優(yōu)選細(xì)胞內(nèi)病毒dna同源重組或細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒dna同源重組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述腺病毒為ad5型腺病毒。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述腺病毒基因組dna的兩端結(jié)合有末端肽tp。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組腺病毒是基于選自下組的腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建的：padeasy-1、pshuttle-cmv或pshuttle-ires。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述融合蛋白編碼序列的表達(dá)盒中所含的啟動(dòng)子序列是巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述加尾信號(hào)序列為sv40polya。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種用本發(fā)明的重組腺病毒致敏的樹突狀細(xì)胞。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種藥物組合物，它包括：(a)有效量的本發(fā)明所述的重組腺病毒、本發(fā)明所述的樹突狀細(xì)胞或用本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的t細(xì)胞，以及(b)藥學(xué)或免疫學(xué)上可接受的載體、賦形劑或佐劑。在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種制備重組腺病毒的方法，該重組腺病毒攜帶熱休克蛋白與癌胚抗原的融合蛋白的編碼序列，該方法包括如下步驟：(a)提供基因組中缺失e1區(qū)和e3區(qū)的復(fù)制缺陷型腺病毒；(b)提供攜帶熱休克蛋白與癌胚抗原的融合蛋白編碼序列表達(dá)盒的載體；(c)使步驟(a)的腺病毒與步驟(b)的載體進(jìn)行同源重組，以獲得重組腺病毒。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述方法還包括如下步驟：(d)用步驟(c)中所得的重組腺病毒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，和(e)從被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中獲得重組腺病毒。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞表達(dá)e1a基因，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為：hek293人胚胎腎細(xì)胞株。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述重組是通過細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法進(jìn)行的。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述復(fù)制缺陷型腺病毒選自：padeasy-1、pshuttle-cmv或pshuttle-ires。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述轉(zhuǎn)染所采用的方法是：磷酸鈣dna共沉淀轉(zhuǎn)染法或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，優(yōu)選脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。在另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(d)是通過裂解細(xì)胞、不連續(xù)cscl梯度離心、連續(xù)cscl梯度離心和透析的四步法純化獲得的。在本發(fā)明的第五方面中，提供了一種制備致敏的樹突狀細(xì)胞的方法，所述方法包括：用本發(fā)明的重組腺病毒或用本發(fā)明上述方法制備的重組腺病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述樹突狀細(xì)胞為人單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞。在本發(fā)明的第六方面中，提供了本發(fā)明1所述的重組腺病毒、本發(fā)明所述的樹突狀細(xì)胞或用本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的t細(xì)胞在制備用于預(yù)防或治療cea陽(yáng)性腫瘤的藥物組合物中的用途。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述藥物組合物是疫苗。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述cea陽(yáng)性腫瘤選自：直結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、乳腺癌或卵巢癌。在本發(fā)明的另一方面中還提供了一種cea陽(yáng)性腫瘤特異性t細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，包括以下步驟：采用本發(fā)明所述的致敏的樹突狀細(xì)胞體外刺激人外周血淋巴細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，該刺激步驟包括：(i)收集致敏的樹突狀細(xì)胞，并放射性滅活；(ii)將致敏后且滅活的樹突狀細(xì)胞按樹突狀細(xì)胞：t細(xì)胞為1:1-1000、優(yōu)選1：20的比例共同孵育，在完全培養(yǎng)基中添加10-200u/ml的il-2，培養(yǎng)7±2天；重復(fù)步驟(i)和(ii)3-10次，收集增殖的t細(xì)胞，即為cea陽(yáng)性腫瘤特異性t細(xì)胞。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。附圖說明圖1：本發(fā)明所制備adcea576-669hsp70l1病毒液的pcr鑒定結(jié)果。圖2：本發(fā)明所制備adcea576-669hsp70l1轉(zhuǎn)染人modc的rt-pcr和實(shí)時(shí)pcr鑒定結(jié)果。圖3：本發(fā)明所制備重組腺病毒轉(zhuǎn)染人單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞(modc)，輕度促進(jìn)modc的成熟活化。a：經(jīng)adcea576-669hsp70l1轉(zhuǎn)染后dc表達(dá)共刺激分子——cd40、cd54、cd80、cd86、cd83或hla-dr的水平；b：經(jīng)過adcea576-669hsp70l1轉(zhuǎn)染后，dc刺激同種t細(xì)胞增殖的水平輕度上調(diào)。圖4：本發(fā)明所制備重組腺病毒轉(zhuǎn)染人單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞(modc)，誘導(dǎo)cea抗原特異性ctl產(chǎn)生。a：adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc能夠明顯誘導(dǎo)hla-a2.1限制性cap-1抗原特異性cd8+t細(xì)胞的生成；b：adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc組誘導(dǎo)的cd8+t細(xì)胞在cea576-669抗原刺激后，出現(xiàn)ifn-γ斑點(diǎn)的數(shù)量和斑點(diǎn)大小明顯增加；c：adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc組誘導(dǎo)的cd8+t細(xì)胞殺傷cea+的ls174t和sw480腫瘤細(xì)胞的能力明顯增加。圖5：重組adcea576-669hsp70l1體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物誘導(dǎo)cea抗原特異性ctl的產(chǎn)生。a：adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導(dǎo)的cd8+cap-1-mhc四聚體+t細(xì)胞比例明顯增加；b：adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導(dǎo)的cd8+t細(xì)胞在cea576-669抗原刺激后，出現(xiàn)ifn-γ斑點(diǎn)的數(shù)量和斑點(diǎn)大小明顯增加；c：adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導(dǎo)的cd8+t細(xì)胞殺傷cea+的ls174t和sw480腫瘤細(xì)胞的能力明顯增加。圖6：重組adcea576-669hsp70l1治療cea陽(yáng)性腫瘤疾病。a：adcea576-669hsp70l1免疫小鼠來源細(xì)胞治療組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫小鼠來源細(xì)胞治療組的動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制；b：adcea576-669hsp70l1免疫小鼠來源細(xì)胞治療組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫小鼠來源細(xì)胞治療組的動(dòng)物生存期明顯延長(zhǎng)。圖7：用padeno-x體系構(gòu)建重組腺病毒的xhoi的限制性酶切分析(圖7a)和xbai/kpni雙限制性酶切(圖7b)結(jié)果。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期而深入的研究，通過同源重組方法構(gòu)建了攜帶hsp70l1與特異性腫瘤抗原cea576-669融合基因的腺病毒載體(adcea576-669hsp70l1)，并利用此重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染人樹突狀細(xì)胞(adcea576-669hsp70l1-dc)。研究證明：體內(nèi)外應(yīng)用adcea576-669hsp70l1或adcea576-669hsp70l1修飾的樹突狀細(xì)胞(adcea576-669hsp70l1-dc)可以有效誘導(dǎo)針對(duì)cea576-669抗原特異性的殺傷性t細(xì)胞生成，殺傷cea+的腫瘤細(xì)胞；并且過繼回輸adcea576-669hsp70l1或adcea576-669hsp70l1-dc免疫動(dòng)物的淋巴細(xì)胞可以延長(zhǎng)cea+腫瘤荷瘤動(dòng)物的生存期和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，adcea576-669hsp70l1或adcea576-669hsp70l1-dc可以作為治療性疫苗，應(yīng)用于cea+腫瘤的治療。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。在本發(fā)明中，術(shù)語“融合蛋白表達(dá)盒”指含有以下元件的表達(dá)盒：熱休克蛋白與癌胚抗原的融合蛋白的編碼序列，以及表達(dá)所需的組件包括啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)序列。此外，該表達(dá)盒還可以任選含有其它序列，其中包括但并不限于：增強(qiáng)子、分泌信號(hào)肽序列等。可以適用于本發(fā)明表達(dá)盒中的啟動(dòng)子可以是任何一種常見的啟動(dòng)子，它可以是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。較佳地，該啟動(dòng)子是組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子，如巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、牛乳頭瘤病毒啟動(dòng)子等其它適用于真核表達(dá)的啟動(dòng)子。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性dna序列的某些部分能夠影響同一線性dna序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽dna作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)dna就是可操作地連于多肽dna；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。熱休克蛋白與癌胚抗原融合蛋白如本文所用，術(shù)語“熱休克蛋白”包括熱休克蛋白和熱休克蛋白樣蛋白，代表性的例子包括(但并不限于)：hsp70、hsp70l1(hsp70-likeprotein1)及其它的熱休克蛋白，優(yōu)選為hsp70、hsp70l1。這些熱休克蛋白的序列可從genbank數(shù)據(jù)庫(kù)上獲得。如本文所用，術(shù)語“癌胚抗原和熱休克蛋白的融合蛋白”、“cea-hsp融合蛋白”等可互換使用，都指由癌胚抗原元件的氨基酸序列和熱休克蛋白(如hsp70或hsp70l1)的氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在兩者之間可以有或者沒有連接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或沒有起始的甲硫氨酸或信號(hào)肽。如本文所用，術(shù)語融合蛋白中“癌胚抗原元件”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，該序列與天然的或變異的全長(zhǎng)癌胚抗原或其免疫原性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有與天然癌胚抗原基本上相同的生物活性。優(yōu)選的癌胚抗原元件是人癌胚抗原或其免疫原性片段，更佳地是全長(zhǎng)的人癌胚抗原或其免疫原性片段(如含576-669位的cea氨基酸序列的片段)。癌胚抗原和熱休克蛋白的序列可以源自人，也可以源自非人的動(dòng)物。然而，優(yōu)選的是人的天然序列。應(yīng)理解本發(fā)明的癌胚抗原和熱休克蛋白的氨基酸序列或核苷酸序列還包括其同源序列(例如同源性高于90％、95％、98％或99％的序列)或由所述序列經(jīng)保守取代、刪除或添加獲得的具有相同或相似功能的序列。如本文所用，術(shù)語“連接肽”或“氨基酸連接臂”可互換使用，指位于癌胚抗原氨基酸序列和熱休克蛋白氨基酸序列之間的、起連接作用的短肽。連接肽可存在或不存在，其長(zhǎng)度通常為0-20個(gè)氨基酸，較佳地為2-10個(gè)氨基酸，最佳地為2-4個(gè)氨基酸。技術(shù)人員可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法(如參見pnas1998；95:5929-5934；proteineng，2000；13(5):309-312等文獻(xiàn))設(shè)計(jì)連接肽。通常，連接肽不影響或嚴(yán)重影響癌胚抗原與熱休克蛋白氨基酸序列形成正確的折疊和空間構(gòu)象。優(yōu)選的連接肽例子包括(但并不限于)：為了有利于蛋白折疊成相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，用sggggsgggg等序列作為連接臂是合適的；為了有利于蛋白酶把cea-hsp70l1切割兩個(gè)獨(dú)立的蛋白分子，可用活性ⅹ因子的酶切位點(diǎn)(iegr)作連接臂。相似的，糜蛋白酶1、木瓜蛋白酶、纖維蛋白溶酶、纖維蛋白酶、胰蛋白酶等的酶切位點(diǎn)也可設(shè)計(jì)作為氨基酸連接臂；為了有利于純化，可把6his作為連接臂，以用金屬親和層析純化cea-hsp70l1融合蛋白；上述三種方案的結(jié)合也可設(shè)計(jì)成新的氨基酸連接臂，如nvvvhqahhhhhheftyk連接臂就是融合了蛋白酶切位點(diǎn)(nia蛋白酶)和金屬親和層析位點(diǎn)6his。此外，另一種優(yōu)選方式是將癌胚抗原元件和熱休克蛋白元件直接連接，而不含任何連接肽。編碼本發(fā)明融合蛋白的dna序列，可以全部人工合成。也可用pcr擴(kuò)增或合成的方法獲得癌胚抗原和或熱休克蛋白的編碼dna序列，然后將其拼接在一起，形成編碼本發(fā)明融合蛋白的dna序列。腺病毒載體的構(gòu)建目前的腺病毒載體大多來源于腺病毒ad2和ad5這兩種血清型。適用于基因治療應(yīng)用的腺病毒載體屬于復(fù)制缺陷型病毒。由于e1編碼的蛋白功能是其它所有腺病毒基因有效表達(dá)所必須的，因此最常見的策略就是用外源dna替代病毒e1區(qū)序列，通過包裝細(xì)胞反式提供e1區(qū)序列而產(chǎn)生的復(fù)制缺陷腺病毒載體。在本發(fā)明中優(yōu)選采用δe1δe3復(fù)制缺陷型腺病毒表達(dá)載體，例如padeasy-1(可購(gòu)自strategen公司)?？捎糜诒景l(fā)明的宿主包裝細(xì)胞是可以表達(dá)腺病毒e1區(qū)基因的任何宿主細(xì)胞，因?yàn)樵摷?xì)胞能夠提供復(fù)制缺陷型腺病毒復(fù)制所需的e1區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物。一種優(yōu)選的常用包裝細(xì)胞是293細(xì)胞，該細(xì)胞由人胚腎細(xì)胞經(jīng)ad5腺病毒dna片段轉(zhuǎn)化而成，載有整合入細(xì)胞基因組的腺病毒e1區(qū)等病毒基因片段，并持續(xù)表達(dá)e1區(qū)蛋白，能為e1區(qū)置換型腺病毒載體提供反式補(bǔ)償。利用e3區(qū)缺失不影響病毒感染性，切去e3區(qū)可增加載體外源性dna容量。切去e1和e3區(qū)，外源基因插入容量可達(dá)約8kb。而克隆更大的外源dna片段則需切去其他的病毒序列，缺失的功能再通過互補(bǔ)細(xì)胞系或輔助病毒反式提供。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用本領(lǐng)域中推薦的細(xì)胞外病毒直接連接方法(例如采用adeno-x表達(dá)系統(tǒng))難以高效獲得本發(fā)明的含融合蛋白的重組腺病毒，線性pad骨架與含有該重組腺病毒的完整表達(dá)盒的線性片段在體外連接效率低，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后獲得同源重組的重組腺病毒的幾率極低。然而，本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期和反復(fù)的實(shí)驗(yàn)出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)，采用同源重組的方法反而可高效獲得本發(fā)明的重組腺病毒，且所得的重組腺病毒對(duì)靶細(xì)胞具有高感染性和低病源性，極顯著優(yōu)于采用細(xì)胞外病毒直接連接法所獲得的結(jié)果。因此，本發(fā)明的重組腺病毒宜采用同源重組的方法獲得?？梢圆捎眠x自下組的同源重組法，例如：(1)細(xì)胞內(nèi)同源重組，如細(xì)胞內(nèi)病毒dna同源性重組；(2)細(xì)菌內(nèi)同源重組，如細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒dna同源重組；(3)cos/tpc共轉(zhuǎn)染同源重組；或(4)位置特異性重組。本發(fā)明中優(yōu)選采用細(xì)菌內(nèi)同源重組法，例如采用padeasy-1、pshuttle-cmv或pshuttle-ires，并將含有融合蛋白表達(dá)盒的線性片段轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架的大腸桿菌(例如大腸桿菌bj5183)，使它們?cè)诩?xì)菌內(nèi)同源重組。重組腺病毒致敏的樹突狀細(xì)胞及由該細(xì)胞誘導(dǎo)的cea抗原特異性t細(xì)胞樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，dc)是正常人體內(nèi)存在的一種具有特殊功能的抗原提呈細(xì)胞，被喻為機(jī)體的“天然佐劑”，能夠直接攝取、加工、呈遞抗原，刺激體內(nèi)的初始型t細(xì)胞活化，是機(jī)體免疫應(yīng)答的“啟動(dòng)者”。此外，dc還可以通過直接或間接方式促進(jìn)b細(xì)胞的增殖與活化，調(diào)控體液免疫應(yīng)答；刺激記憶t細(xì)胞活化誘發(fā)再次免疫應(yīng)答；與nk相互作用影響非特異性的、天然免疫應(yīng)答。dc處于腫瘤免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，能攝取和加工處理腫瘤抗原并調(diào)動(dòng)機(jī)體主動(dòng)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明中提供了一種由本發(fā)明重組腺病毒致敏的樹突狀細(xì)胞，其可有效用于誘導(dǎo)cea抗原特異性t細(xì)胞?？刹捎帽绢I(lǐng)域中已知的用于致敏樹突狀細(xì)胞的常用方法使得本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞致敏，優(yōu)選用本發(fā)明的重組腺病毒對(duì)樹突狀細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域中常用的方法，用本發(fā)明致敏的樹突狀細(xì)胞進(jìn)一步誘導(dǎo)的cea抗原特異性t細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，采用本發(fā)明所述的致敏的樹突狀細(xì)胞體外刺激人外周血淋巴細(xì)胞。所述方法優(yōu)選包括如下步驟：(i)收集致敏的樹突狀細(xì)胞細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行滅活(例如放射性滅活)；(ii)將致敏且滅活的樹突狀細(xì)胞按樹突狀細(xì)胞：t細(xì)胞為1:1-1000、優(yōu)選1：20的比例共同孵育，優(yōu)選在完全培養(yǎng)基中添加10-200u/ml的il-2，培養(yǎng)7±2天；(iii)重復(fù)步驟(i)和(ii)3-10次，收集增殖的t細(xì)胞，即為cea陽(yáng)性腫瘤特異性t細(xì)胞。組合物本發(fā)明中還提供了一種藥物組合物，其包括：(a)有效量的本發(fā)明的重組腺病毒、樹突狀細(xì)胞或用本發(fā)明樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的t細(xì)胞，以及(b)藥學(xué)或免疫學(xué)上可接受的載體、賦形劑或佐劑。所述組合物可用于預(yù)防或治療cea陽(yáng)性腫瘤。如本文所用，術(shù)語“cea陽(yáng)性腫瘤”或“cea+腫瘤”包括指在腫瘤細(xì)胞膜上高度表達(dá)cea抗原的腫瘤，代表性的例子包括(但并不限于)：直結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤。如本文所用，“活性物質(zhì)”是指本發(fā)明的重組腺病毒、該重組腺病毒致敏的樹突狀細(xì)胞、cea抗原特異性t細(xì)胞或它們的組合。在制得本發(fā)明的重組腺病毒、該重組腺病毒致敏的樹突狀細(xì)胞或cea抗原特異性t細(xì)胞之后，可將所需純度的所述活性物質(zhì)與任選的生理上、藥學(xué)或免疫學(xué)上可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑(remington'spharmaceuticalsciences,16版，osol,a.,ed.,[1980])，以凍干形式或水溶液形式進(jìn)行混合，從而制得本發(fā)明的組合物?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑對(duì)接受者而言在所用的劑量和濃度下應(yīng)是無毒的，并且可含有緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑如維生素c；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如edta；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的反荷離子如鈉；和/或非離子型表面活性劑如tween、pluronics或聚乙二醇(peg)。作為最常見的例子，水和生理鹽水就可作為本發(fā)明制劑中的載體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的活性物質(zhì)占所述組合物總重量的0.001-99.9wt％，優(yōu)選1-95wt％，更優(yōu)選5-90wt％，再優(yōu)選10-80wt％。含本發(fā)明活性物質(zhì)的組合物(或制劑)可以用常規(guī)方式施用于需要治療的個(gè)體，這些方式包括(但并不限于)：肌內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射等。施予本發(fā)明活性物質(zhì)的量可由專業(yè)人員(如醫(yī)師)根據(jù)對(duì)象的具體情況，如病癥、病程、年齡、性別、其它相關(guān)治療等確定。通常，給予本發(fā)明活性物質(zhì)的量為：重組腺病毒：107-1011pfu/千克體重，較佳地108-5×1010pfu/千克體重，更佳地優(yōu)選109-1010pfu/千克體重；本發(fā)明重組腺表達(dá)致敏的dc細(xì)胞：103-107致敏dc細(xì)胞/千克體重，較佳地105-5×106致敏dc細(xì)胞/千克體重，更佳地105-106致敏dc細(xì)胞/千克體重；本發(fā)明cea抗原特異性t淋巴細(xì)胞：105-109cea抗原特異性t淋巴細(xì)胞/千克體重，較佳地106-108cea抗原特異性t淋巴細(xì)胞/千克體重,更佳地106-107cea抗原特異性t細(xì)胞/千克體重。本發(fā)明的組合物中還可包含治療和/或預(yù)防cea+腫瘤的其它活性物質(zhì)或與這些其它物質(zhì)聯(lián)合施用(如同時(shí)或先后施用)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述治療和/或預(yù)防cea+腫瘤的其它活性物質(zhì)選自：腫瘤化療藥，如奧沙利鉑；或腫瘤抗原沖擊的樹突狀細(xì)胞，腫瘤抗原可以是已知的抗原肽也可以是腫瘤細(xì)胞裂解物。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明的重組腺病毒通過感染細(xì)胞，表達(dá)于胞內(nèi)，克服了“cea-hsp融合蛋白”原核表達(dá)的以下不足之處：1)表達(dá)技術(shù)具有一定的難度，難以獲得大量產(chǎn)品用于將來臨床治療目的；2)該融合蛋白誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的能力過強(qiáng)，采用原核表達(dá)法很難控制體內(nèi)用量，易于出現(xiàn)免疫反應(yīng)過強(qiáng)的副作用；3)hsp70l1的天然形式為胞內(nèi)蛋白，或許在胞內(nèi)發(fā)揮主要作用；4)以原核表達(dá)形式產(chǎn)生的融合蛋白缺少正確的折疊和糖基化修飾等真核蛋白(其天然形式)的特點(diǎn)；5)融合蛋白通過在細(xì)胞外與受體結(jié)合內(nèi)吞形式進(jìn)入胞內(nèi)，根據(jù)免疫學(xué)原理，胞外蛋白主要通過mhc-ii類途徑遞呈抗原，也就是誘導(dǎo)抗原特異性的cd4+t細(xì)胞；而胞內(nèi)蛋白主要通過mhc-i類途徑遞呈抗原，也就是誘導(dǎo)抗原特異性的cd8+t細(xì)胞，本發(fā)明主要目的就是實(shí)現(xiàn)該mhc-i類途徑的抗原遞呈。2.本發(fā)明的重組腺病毒對(duì)靶細(xì)胞具有高感染性和低病源性，能安全、高效地介導(dǎo)基因表達(dá)轉(zhuǎn)移及表達(dá)，具有致癌、至突變幾率小等優(yōu)點(diǎn)，為抗腫瘤基因治療提供了理想的基因轉(zhuǎn)移載體；3.本發(fā)明的重組腺病毒及其致敏的樹突狀細(xì)胞可有效誘導(dǎo)cea抗原特異性的殺傷性t細(xì)胞生成，而后者具有殺傷cea陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞株和抑制cea陽(yáng)性腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物生存期的作用。從而，為cea陽(yáng)性腫瘤預(yù)防和治療提供了的新策略。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件(例如，基本分子生物學(xué)操作均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社，1992；基本細(xì)胞學(xué)操作均參照《細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)指南》第一版，科學(xué)出版社，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1.adcea576-669hsp70l1的設(shè)計(jì)與制備本實(shí)驗(yàn)中限制性內(nèi)切酶和taq酶購(gòu)自neb公司；pqe30和宿主菌m15購(gòu)自qiagen公司；預(yù)轉(zhuǎn)染adeasy-1的大腸桿菌bj5183、pshuttle-cmv購(gòu)自strategen公司；ls174t購(gòu)自atcc。人單核來源樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)：取健康志愿者抗凝血200ml，應(yīng)用ficoll1.077密度梯度離心，獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞；免疫磁珠法分離人單核細(xì)胞，簡(jiǎn)言之，將2×108人外周血單個(gè)核細(xì)胞與200μlcd14免疫磁珠于4℃孵育15分鐘；將結(jié)合了免疫磁珠的人外周血單個(gè)核細(xì)胞置于磁場(chǎng)中，洗去陰性細(xì)胞，從柱中沖出陽(yáng)性細(xì)胞，即為人外周血cd14+單核細(xì)胞；將新鮮分離的人cd14+單核細(xì)胞(mo)按照106個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)在含有10％fbs、人gm-csf(500u/ml)、人il-4(10ng/ml)的rpmi1640培養(yǎng)基中。6天后，收集懸浮細(xì)胞，即為人單核來源樹突狀細(xì)胞(modc)。從lps(脂多糖)刺激的人單核來源樹突狀細(xì)胞(modc)中擴(kuò)增獲得hsp70l1的全長(zhǎng)cdna(按照參考文獻(xiàn)16)。用rt-pcr的方法(上游引物5’-ctcgtcgacgcggccatcggagttcacctg-3’(seqidno:3)，下游引物5’-ggggtaccagatgctatctcaatagagattgct-3’(seqidno:4)；反應(yīng)參數(shù)：95℃15秒，53℃30秒，72℃40秒，29循環(huán)后72℃延伸10分鐘)克隆人hsp70l1cdna，上下游引物中引入sali和kpni酶切位點(diǎn)。從ls174t細(xì)胞中分離總rna，用rt-pcr的方法(上游引物5’-attgagctcgtgagtgcaaaccgcagtgacc-3’(seqidno:5)，下游引物為：5’-tatgtcgacgactatggaattattgcggcc-3’(seqidno:6)；反應(yīng)參數(shù)：95℃、15秒，56.5℃、30秒，72℃、45秒，29循環(huán)后72℃延伸10分鐘)克隆人cea576-669cdna，上下游引物中引入saci和sali酶切位點(diǎn)。將cea576-669cdna片斷插入到質(zhì)粒pqe30中，形成pqe30cea576-669；將hsp70l1cdna插入到pqe30cea576-669，形成重組pqe30cea576-669hsp70l1。由此獲得的重組pqe30cea576-669hsp70l1中，cea576-669的cdna位于hsp70l1cdna的5’端，中間由限制性酶切位點(diǎn)sali連接，其基因序列如seqidno:1所示。通過核苷酸序列分析驗(yàn)證cdna基因。以重組pqe30cea576-669hsp70l1為模板，擴(kuò)增cea576-669hsp70l1片段(反應(yīng)參數(shù)：95℃、15秒，57℃、30秒，72℃、90秒，29循環(huán)后72℃延伸10分鐘)，所用引物序列如下為上游：5’-ccggtaccatggtgagtgcaaaccgcagtgacc-3’(seqidno:7)；下游：5’-ccctcgagttaagatgctatctcaatagagattgc-3’(seqidno:8)。擴(kuò)增的cea576-669hsp70l1片斷經(jīng)kpni和xhoi酶切后插入到穿梭質(zhì)粒pshuttle-cmv，構(gòu)建成重組pshuttlecea576-669hsp70l1；經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，經(jīng)過pmei酶切線性化，轉(zhuǎn)化預(yù)轉(zhuǎn)染了復(fù)制缺陷型padeasy-1的大腸桿菌bj5183(常規(guī)cacl2、熱休克方法)；經(jīng)卡那抗性篩選獲得重組腺病毒質(zhì)粒padcea576-669hsp70l1，經(jīng)限制性酶切分析證實(shí)后，將獲得的陽(yáng)性克隆，進(jìn)一步擴(kuò)增，大量抽提padcea576-669hsp70l1，經(jīng)paci酶切線性化后，用于轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞，進(jìn)行腺病毒的包裝。(1)制備重組腺病毒粗提液本實(shí)驗(yàn)采用的dmem培養(yǎng)液、胎牛血清fbs購(gòu)自paa公司；轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自polyplus-transfection公司。hek293細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。將hek293細(xì)胞(表達(dá)腺病毒e1a、e1b蛋白的人胚腎細(xì)胞株293細(xì)胞)在10％fbs的dmem培養(yǎng)液、37℃、5％co2環(huán)境中培養(yǎng)至50-70％融合。采用脂質(zhì)體方法將線性化padcea576-669hsp70l1轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞，操作參照說明書進(jìn)行。2h后添加等體積的含10％fbs的dmem培養(yǎng)液，24h后更換新鮮的含10％fbs的dmem培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至10-14天時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，包括細(xì)胞黏附性降低、脫落、變圓、呈現(xiàn)串珠樣改變。收集出現(xiàn)病變的細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，制備成重組腺病毒粗提液，于-70℃保存?zhèn)溆谩?2)單個(gè)噬斑純化病毒本試驗(yàn)采用sigma公司的瓊脂糖。將hek293細(xì)胞(3×105個(gè)細(xì)胞/孔)接種于6孔板，至70％融合時(shí)，加入重組腺病毒粗提液，37℃感染2h，棄去病毒液，加入1.25％瓊脂糖半固體培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)30分鐘，待凝固后，放置37℃、5％co2環(huán)境中培養(yǎng)至出現(xiàn)噬斑。挑取單個(gè)噬斑(選取3個(gè)克隆)，重新感染hek293細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)擴(kuò)增，制備病毒液，進(jìn)行pcr鑒定(反應(yīng)參數(shù)：95℃、15秒，62℃、30秒，72℃、90秒，35循環(huán)后72℃延伸10分鐘)。結(jié)果顯示padcea576-669hsp70l1含有1812bp特征性條帶(圖1)。所用引物序列如下：上游：5’-ggaaatgcggccgcatggtgagtgcaaac-3’(seqidno:9)；下游：5’-aatcggctcgagttaagatgctatctcaat-3’(seqidno:10)。(3)adcea576-669hsp70l1的擴(kuò)增及純化padcea576-669hsp70l1的大量擴(kuò)增：將hek293細(xì)胞以50-70％的匯合率鋪于60mm培養(yǎng)皿中，以30-50％的體積比加入含病毒上清液。在cpe現(xiàn)象出現(xiàn)后，有1/3到1/2的細(xì)胞脫離漂浮時(shí)，離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于2.0mlpbs中。于液氮中凍結(jié)細(xì)胞，37℃水浴中溶解，劇烈振蕩。此步驟共進(jìn)行3次。將獲得的病毒上清進(jìn)一步感染100mm培養(yǎng)皿的hek293細(xì)胞，按前述方法收集病毒，并進(jìn)而將其感染多個(gè)100mm培養(yǎng)皿的hek293細(xì)胞，以獲得足夠量的病毒。重組腺病毒的純化：分別進(jìn)行不連續(xù)cscl梯度離心(密度分別為1.4g/ml和1.2g/ml)和連續(xù)cscl梯度離心(1.3g/ml)。透析去除cscl，將重組腺病毒保存于緩沖液(10mmtris,4％蔗糖,2mmmgcl2,ph8.0)。并且，多次實(shí)驗(yàn)證明了采用上述(1)～(3)中的方法獲得本發(fā)明的重組腺病毒具有很高的重現(xiàn)性。(4)測(cè)定adcea576-669hsp70l1滴度按常規(guī)噬斑分析法測(cè)定padcea576-669hsp70l1滴度為1.2х1012pfu/ml。實(shí)施例2.重組adcea576-669hsp70l1體外感染人單核來源樹突狀細(xì)胞與表達(dá)本實(shí)驗(yàn)中rpmi1640培養(yǎng)基和ficoll1.077購(gòu)自paa公司；人gm-csf和人il-4購(gòu)自peprotech公司；cd14免疫磁珠、ms柱和分離架購(gòu)自miltenylbiotec公司；adlacz購(gòu)自strategen公司。人單核來源樹突狀細(xì)胞(modc)的誘導(dǎo)方法如實(shí)施例1中所述。用含有10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基重懸收集的modc，調(diào)整濃度為107個(gè)細(xì)胞/ml。按照moi＝1000：1，用重組adcea576-669hsp70l1(如實(shí)施例1中所制備)感染modc。24h后收集細(xì)胞，提取總rna，進(jìn)行rt-pcr(cea576-669：反應(yīng)參數(shù)：94℃、30秒，54℃、30秒，72℃、30秒，35循環(huán)后72℃延伸10分鐘；hsp70l1：反應(yīng)參數(shù)：94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，35循環(huán)后72℃延伸10分鐘；cea576-669hsp70l1：反應(yīng)參數(shù)：94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，35循環(huán)后72℃延伸10分鐘)和實(shí)時(shí)pcr(各反應(yīng)參數(shù)同rt-pcr)的鑒定。另設(shè)置未感染、adlacz(購(gòu)自strategen公司，自行擴(kuò)增和純化如實(shí)施例1所述方法；moi＝1000：1)感染組對(duì)照。結(jié)果見圖2。該結(jié)果表明：adcea576-669hsp70l1感染的人modc后，表達(dá)cea576-669,hsp70l1,以及ceahsp70l1mrna的水平顯著高于未轉(zhuǎn)染組和adlacz轉(zhuǎn)染組。rt-pcr引物序列如下：cea576-669(279bp)：上游：5’-attgagctcgtgagtgcaaaccgcagtgacc-3’(seqidno:11)；下游：5’-tatgtcgacgactatggaattattgcggcc-3’(seqidno:12)hsp70l1(122bp)：上游：5’-cagcatgtgaggccgtcta-3’(seqidno:13)；下游：5’-tgctgccaatccaacaat-3’(seqidno:14)cea576-669hsp70l1(111bp)：上游：5’-aaatcacgccaaataataacgg-3’(seqidno:15)；下游：5’-tgcagcccaggtgaactcc-3’(seqidno:16)。實(shí)施例3.重組adcea576-669hsp70l1基因修飾促進(jìn)人modc的成熟活化本實(shí)施例中各抗體購(gòu)自b.d.pharmingen公司；cfse購(gòu)自calbiochem公司；cd3免疫磁珠購(gòu)自miltenylbiotech公司；原核蛋白cea576-669hsp70l1由本室采用常規(guī)方法純化并保存(挑取轉(zhuǎn)化有pqe30-cea576-669hsp70l1質(zhì)粒的m15菌，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后，其表達(dá)以包涵體形式存在于胞內(nèi)；包涵體經(jīng)過洗滌和溶解，上金屬離子螯合柱和deae柱層析純化cea576-669hsp70l1融合蛋白，透析后溶于pbs，保存于-80℃)。將新鮮分離的人外周血cd14+單核細(xì)胞(mo)以106個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)在含有10％fbs、人gm-csf(500u/ml)、人il-4(10ng/ml)的rpmi1640培養(yǎng)基中。6天后，收集懸浮細(xì)胞即為人單核來源樹突狀細(xì)胞(modc)。用含有10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基重懸收集的modc，調(diào)整濃度為107個(gè)細(xì)胞/ml；按照moi＝1000：1，分別用adlacz或adcea576-669hsp70l1感染modc，2h后洗去游離病毒，繼續(xù)培養(yǎng)在上述培養(yǎng)基中；cea576-669hsp70l1蛋白按照100μg/ml與modc孵育。48h后收集modc，進(jìn)行以下試驗(yàn)：(1)表型檢測(cè)用抗共刺激分子cd40、cd54、cd83、cd86和mhcii分子的抗體標(biāo)記modc細(xì)胞，并進(jìn)行流式細(xì)胞(facscalibur，bd公司)分析。結(jié)果顯示，與未感染組和adlacz組比較，重組腺病毒adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc表達(dá)共刺激分子cd54、cd86和mhc-ii分子的水平輕度上調(diào)；表達(dá)cd83和cd40的水平?jīng)]有改變(圖3a)。(2)刺激同種t淋巴細(xì)胞增殖的能力分離同種cd3+t淋巴細(xì)胞(應(yīng)用免疫磁珠方法，如實(shí)施例2)。將modc與同種cd3+t淋巴細(xì)胞按照modc：cd3+t淋巴細(xì)胞＝1:10的比例混合培養(yǎng)5天，檢測(cè)t細(xì)胞的增殖情況。t細(xì)胞預(yù)先用cfse標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)cfse低表達(dá)的t淋巴細(xì)胞％(反映增殖的t細(xì)胞)。結(jié)果顯示，與未感染組和adlacz組比較，重組腺病毒adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc刺激同種cd3+t淋巴細(xì)胞增殖的水平輕度上調(diào)(圖3b)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，重組adcea576-669hsp70l1基因修飾促進(jìn)了人modc的成熟活化。實(shí)施例4.重組adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc誘導(dǎo)cea抗原特異性ctl產(chǎn)生本實(shí)施例中，cap-1-mhc四聚體購(gòu)自proimmune公司；cd8免疫磁珠購(gòu)自miltenylbiotech公司；elispot培養(yǎng)板購(gòu)自millipore公司；抗人ifn-γ單抗購(gòu)自b.d.pharmingen公司；7-aad購(gòu)自sigma公司；重組cea576-669抗原由本室純化(原核表達(dá)載體pqe30-cea576-669在m15菌中誘導(dǎo)表達(dá)后，重組的cea576-669蛋白主要以包涵體的形式存在于細(xì)菌胞內(nèi)，包涵體經(jīng)過洗滌和溶解后，過金屬離子螯合柱層析初步純化重組cea576-669蛋白，然后經(jīng)過常規(guī)方法復(fù)性、透析、過濾除菌分裝保存于-80℃)。fitc-偶聯(lián)的抗人hla-a2.1抗體購(gòu)自b.d.pharmingen公司。人外周血單個(gè)核細(xì)胞預(yù)先經(jīng)fitc-偶聯(lián)的抗人hla-a2抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀分析選取hla-a2陽(yáng)性樣本，進(jìn)行免疫磁珠法分離cd14+單核細(xì)胞，和modc的誘導(dǎo)。按照實(shí)施例3感染人hla-a2+modc，48h后收集modc，分裝成4份；一份與自身cd3+t淋巴細(xì)胞按照1:20的比例混合培養(yǎng)，其余3份用含有5％dmso、95％fbs的凍存液凍存于-80℃。培養(yǎng)7天后，復(fù)蘇一支凍存的重組adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc，將其按照同樣比例加入到混合培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)3天后，添加人il-2(100u/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)。同法進(jìn)行第3個(gè)循環(huán)的刺激。在21天后，進(jìn)行如下試驗(yàn)：(1)hla-a2.1限制性cea605-613抗原肽(cap-1)特異性t淋巴細(xì)胞比例(cd8+cap-1-mhc四聚體+％)收集培養(yǎng)終止的細(xì)胞，用抗cd8和cap-1-mhc四聚體進(jìn)行雙色標(biāo)記，流式細(xì)胞儀分析cd8+cap-1-mhc四聚體+％。結(jié)果如圖4a所示，該結(jié)果表明：與未感染、adlacz感染組、cea576-669hsp70l1致敏dc組(圖中分別示為ctrl、adlacz和ceahsp70l1)比較，adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc(圖中示為adceahsp70l1)能夠明顯誘導(dǎo)cap-1抗原特異性cd8+t細(xì)胞的生成。(2)hla-a2.1限制性cea576-669抗原特異性cd8+t細(xì)胞分泌ifn-γ的水平分離共培養(yǎng)體系中的cd8+t淋巴細(xì)胞，與復(fù)蘇的自身modc按照5：1比例培養(yǎng)，體系中添加人cea576-669蛋白(10μg/ml)，培養(yǎng)至包被有抗人ifn-γ的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)3天后終止，按照elispot說明書進(jìn)行ifn-γ分泌斑點(diǎn)的檢測(cè)。結(jié)果如圖4b所示，該結(jié)果表明：與未感染、adlacz感染組和cea576-669hsp70l1致敏dc組(圖中分別示為ctrl、adlacz和ceahsp70l1)比較，adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc組(圖中示為adceahsp70l1)誘導(dǎo)的cd8+t細(xì)胞在cea576-669抗原刺激后，出現(xiàn)ifn-γ斑點(diǎn)的數(shù)量和斑點(diǎn)大小明顯增加，說明該培養(yǎng)體系中含有更多的cea特異性cd8+t細(xì)胞。(3)對(duì)cea+腫瘤細(xì)胞的殺傷作用分離共培養(yǎng)體系中的cd8+t淋巴細(xì)胞，與cfse標(biāo)記的cea+腫瘤細(xì)胞株(ls174t和sw480購(gòu)自atcc)按照10：1的比例共培養(yǎng)，4h后，加入7-aad，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的死亡(cfse+7-aad+％)。結(jié)果顯示，與未感染、adlacz感染組和cea576-669hsp70l1致敏dc組比較，adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc組誘導(dǎo)的cd8+t細(xì)胞殺傷cea+的ls174t和sw480腫瘤細(xì)胞的能力明顯增加(附圖4c)。綜上，重組adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc能夠更強(qiáng)的誘導(dǎo)cea576-669抗原特異性ctl產(chǎn)生。尤其是，adcea576-669hsp70l1修飾的人樹突狀細(xì)胞比原核蛋白cea576-669hsp70l1沖擊的人樹突狀細(xì)胞能夠更強(qiáng)烈的誘導(dǎo)cea特異性ctl的產(chǎn)生，表現(xiàn)在adcea576-669hsp70l1修飾的人樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的對(duì)cap-1(cea蛋白中的一種hla-a2限制性肽)特異性的cd8+t細(xì)胞、殺傷cea+腫瘤細(xì)胞的能力更強(qiáng)。實(shí)施例5.重組adcea576-669hsp70l1體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物誘導(dǎo)cea576-669抗原特異性ctl的產(chǎn)生取4周齡hla-a2.1/kb轉(zhuǎn)基因小鼠(購(gòu)自jacksonlaboratory)骨髓細(xì)胞，按照1х107個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)在含有10％fbs，鼠gm-csf(10ng/ml),鼠il-4(1ng/ml)的rpmi1640培養(yǎng)基中，三天后吸棄懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)在上述培養(yǎng)基中，在6天后，收集懸浮細(xì)胞，即為骨髓來源樹突狀細(xì)胞。用含有10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為1х107個(gè)細(xì)胞/ml，按照moi＝1000:1加入重組腺病毒adlacz或adcea576-669hsp70l1，2h后，洗去游離病毒，一部份用于免疫，其余凍存，用于后續(xù)免疫。將30只4周齡hla-a2.1/kb轉(zhuǎn)基因小鼠(雌雄比例1:1，購(gòu)自jacksonlaboratory)按照隨機(jī)原則分成五組；①未處理組；②adlacz免疫組，腹腔注射，109pfu/只；③adcea576-669hsp70l1免疫組，腹腔注射，109pfu/只；④adlacz基因修飾的小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞免疫組(adlacz-dc)，腹腔注射，106adlacz-dc細(xì)胞/只；⑦adcea576-669hsp70l1基因修飾的小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞免疫組(adcea576-669hsp70l1-dc),腹腔注射，106adcea576-669hsp70l1-dc細(xì)胞/只；免疫方案為每隔7天免疫一次，共免疫三次。21天后，進(jìn)行如下試驗(yàn)：(1)hla-a2.1限制性cap-1抗原肽特異性t淋巴細(xì)胞比例(cd8+cap-1-mhc四聚體+％)測(cè)定分離各組小鼠脾細(xì)胞，用抗cd8抗體和cap-1-mhc四聚體對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行雙色標(biāo)記，流式細(xì)胞儀分析cd8+cap-1-mhc四聚體+t淋巴細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，與未免疫組和adlacz或adlacz-dc免疫組比較，adceahsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導(dǎo)的cd8+cap-1-tcr+t細(xì)胞比例明顯增加(圖5a)。(2)hla-a2.1限制性cea576-669抗原特異性cd8+t細(xì)胞分泌ifn-γ的水平分離各組小鼠脾細(xì)胞中的cd8+t淋巴細(xì)胞，與自身骨髓來源dc按照5：1比例培養(yǎng)至包被有抗鼠ifn-γ的96孔培養(yǎng)板，體系中添加鼠il-2(100u/ml)，和cea576-669抗原(10μg/ml)；培養(yǎng)3天后終止，然后按照elispot說明書進(jìn)行ifn-γ分泌斑點(diǎn)的檢測(cè)。結(jié)果顯示，與未免疫組和adlacz或adlacz-dc免疫組比較，adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導(dǎo)的cd8+t細(xì)胞在cea576-669抗原刺激后，出現(xiàn)ifn-γ斑點(diǎn)的數(shù)量和斑點(diǎn)大小明顯增加，說明adcea576-669hsp70l1和adcea576-669hsp70l1-dc免疫能夠誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生更多的cea576-669抗原特異性cd8+t細(xì)胞(圖5b)。(3)對(duì)cea+腫瘤細(xì)胞的殺傷作用分離各組小鼠脾細(xì)胞中的cd8+t淋巴細(xì)胞，與cfse標(biāo)記的cea+腫瘤細(xì)胞株(ls174t和sw480)按照10：1的比例共培養(yǎng)，4h后，加入7-aad，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的死亡(cfse+7-aad+％)。結(jié)果顯示，與未免疫組和adlacz或adlacz-dc免疫組比較，adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導(dǎo)的cd8+t細(xì)胞殺傷cea+的ls174t和sw480腫瘤細(xì)胞的能力明顯增加，表明adcea576-669hsp70l1或adcea576-669hsp70l1-dc免疫能夠誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生更多的cea抗原特異性cd8+ctl(圖5c)。綜上，adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組能夠明顯誘導(dǎo)cea抗原特異性ctl的產(chǎn)生。實(shí)施例6.重組adcea576-669hsp70l1治療cea陽(yáng)性腫瘤疾病將50只4周齡hla-a2.1/kb轉(zhuǎn)基因小鼠(雌雄比例1:1，購(gòu)自jacksonlaboratory)按照隨機(jī)原則分成五組；①未處理組；②adlacz免疫組，腹腔途徑，109pfu/只；③adcea576-669hsp70l1免疫組，腹腔途徑，109pfu/只；④adlacz基因修飾的小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞免疫組(adlacz-dc)；腹腔途徑，106adlacz-dc/只；⑤adcea576-669hsp70l1基因修飾的小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞免疫組腹腔途徑，106adcea576-669hsp70l-dc/只；免疫方案為每隔7天免疫一次，共免疫三次。21天后，分離小鼠脾細(xì)胞、腋窩、腹骨溝腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，去除紅細(xì)胞后，用pbs重懸，按照5х107/只，靜脈注射給cea+腫瘤荷瘤動(dòng)物模型。建立cea+腫瘤荷瘤動(dòng)物模型：將1х106的ls174t細(xì)胞，于皮下接種于4周齡的裸鼠；共接種50只裸鼠，三天后按照隨機(jī)原則分為4組，接受細(xì)胞治療：①未治療組；②未免疫小鼠來源細(xì)胞治療組；③adlacz免疫小鼠來源細(xì)胞治療組；或adlacz-dc免疫小鼠來源細(xì)胞治療組；④adcea576-669hsp70l1免疫小鼠來源細(xì)胞治療組；或adcea576-669hsp70-dc免疫小鼠來源細(xì)胞治療組。治療方案：接種腫瘤后3天開始接受細(xì)胞治療；隔7天后重復(fù)一次。待出現(xiàn)可測(cè)腫瘤后，每隔一天進(jìn)行腫瘤大小的測(cè)量和生存期的觀察，共觀察3個(gè)月。結(jié)果顯示，與未治療組、未免疫小鼠來源細(xì)胞治療組、和adlacz或adlacz-dc免疫小鼠來源細(xì)胞治療組比較，adcea576-669hsp70l1免疫小鼠來源細(xì)胞治療組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫小鼠來源細(xì)胞治療組的動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制(圖6a)；生存期明顯延長(zhǎng)(圖6b)。實(shí)施例7.應(yīng)用padeno-x體系構(gòu)建重組腺病毒adcea576-669hsp70l1如實(shí)施例1，以重組pqe30cea576-669hsp70l1為模板，擴(kuò)增cea576-669hsp70l1片段(反應(yīng)參數(shù)：95℃、15秒，57℃、30秒，72℃、90秒，29循環(huán)后72℃延伸10分鐘)，所用引物序列如下為上游：上游引物：5’-ttcctctagaatggtgagtgcaaaccgcagtgac-3’(seqidno:17)；下游引物：5’-aagtggtaccagatgctatctcaatagagat-3’(seqidno:18)擴(kuò)增的cea576-669hsp70l1片斷經(jīng)kpni和xbai酶切后插入到穿梭質(zhì)粒pshuttle2，引入cmv啟動(dòng)子和polya尾，構(gòu)建成重組pshuttlecea576-669hsp70l1；經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，經(jīng)過pi-scei和i-ceui雙酶切，得到含有cmv啟動(dòng)子、目的片段和polya尾的完整表達(dá)盒的線性片段，然后與padeno-x的線性骨架在體外用連接酶連接；轉(zhuǎn)化大腸桿菌(常規(guī)cacl2、熱休克方法)；經(jīng)氨芐抗性篩選可獲得1-2個(gè)抗性株，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行經(jīng)xhoi的限制性酶切分析(圖7a)和xbai/kpni雙限制性酶切(圖7b)發(fā)現(xiàn)抗性株中的質(zhì)粒沒有出現(xiàn)應(yīng)有的限制性酶切片段分布和目的片段。上述結(jié)果表明：線性pad骨架與含有該重組腺病毒的完整表達(dá)盒的線性片段在體外連接效率非常低，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后獲得同源重組的重組腺病毒的幾率非常低。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。參考文獻(xiàn)1.srivastavapk.interactionofheatshockproteinswithpeptidesandantigenpresentingcells:chaperoningoftheinnateandadaptiveimmuneresponses.annurevimmunol2002；20:395–425.2.todryksm,goughmj,pockleyag.facetsofheatshockprotein70showimmunotherapeuticpotential.immunology.2003；110:1-9.3.manjilimh,wangxy,macdonaldij,arnoukh,yanggy,pritchardmt,subjeckjr.cancerimmunotherapyandheat-shockproteins:promisesandchallenges.expertopinbiolther.2004；4(3):363-734.blacherene,udonoh,janetzkis,liz,heikem,srivastavapk.heatshockproteinvaccinesagainstcancer.jimmunotheremphasistumorimmunol.1993；14:352-356.5.liz,srivastavapk.acriticalcontemplationontheroleofheatshockproteinsintransferofantigenicpeptidesduringantigenpresentation.behringinstmitt.1994；94:37-47.6.moroiy,mayhewm,trckaj,etal.inductionofcellularimmunitybyimmunizationwithnovelhybridpeptidescomplexedtoheatshockprotein70.procnatlacadsciusa2000；97:3485–907.arnold-schildd,hanaud,spehnerd,schmidc,rammenseehg,delasalleh,schildh.cuttingedge:receptor-mediatedendocytosisofheatshockproteinsbyprofessionalantigen-presentingcells.jimmunol.1999；162(7):3757-60.8.castellinof,boucherpe,eichelbergk,mayhewm,rothmanje,houghtonan,germainrn。receptor-mediateduptakeofantigen/heatshockproteincomplexesresultsinmajorhistocompatibilitycomplexclassiantigenpresentationviatwodistinctprocessingpathways..jexpmed.2000；191(11):1957-64.9.svenssonpa,aseaa,englundmc,bauseroma,m,wiklundo,ohlssonbg,carlssonlm,carlssonb.majorroleofhsp70asaparacrineinducerofcytokineproductioninhumanoxidizedldltreatedmacrophages.atherosclerosis.2006mar；185(1):32-8.epub2005jul1.10.caudillmm,liz.hsppc-96:apersonalisedcancervaccine.expertopinbiolther.2001may；1(3):539-47.11.cohenl,demoorc,parkerpa,amatorj.qualityoflifeinpatientswithmetastaticrenalcellcarcinomaparticipatinginaphaseitrialofanautologoustumor-derivedvaccine.uroloncol.2002；7(3):119-24.12.cohenl,parkerpa,sternerj,demoorc.qualityoflifeinpatientswithmalignantmelanomaparticipatinginaphaseitrialofanautologoustumour-derivedvaccine.melanomares.200212(5):505-11.13.bellif,testoria,rivoltinil,maiom,andreolag,sertolimr,gallinog,pirisa,cattelana,lazzarii,carrabbam,scitag,santantonioc,pillal,tragnig,lombardoc,arientif,marchianòa,queirolop,bertolinif,covaa,lamaje,ascanil,camerinir,corsim,cascinellin,lewisjj,srivastavap,parmianig.vaccinationofmetastaticmelanomapatientswithautologoustumor-derivedheatshockproteingp96-peptidecomplexes:clinicalandimmunologicfindings.jclinoncol.2002；20(20):4169-80.14.maciagpc,patersony.technologyevaluation:hspe7(stressgen).curropinmolther.2005；7(3):256-63.15.hunts.technologyevaluation:hspe7,stressgenbiotechnologiescorp.curropinmolther.2001；3(4):413-7.16.want,zhoux,cheng,anh,chent,zhangw,lius,jiangy,yangf,wuy,caox.novelheatshockproteinhsp70l1activatesdendriticcellsandactsasath1polarizingadjuvant.blood.2004；103(5):1747-54.17.wuy,want,zhoux,wangb,yangf,lin,cheng,dais,lius,zhangm,caox.hsp70-likeprotein1fusionproteinenhancesinductionofcarcinoembryonicantigen-specificcd8+ctlresponsebydendriticcellvaccine.cancerres.2005；65(11):4947-4954.序列表<110>中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)<120>攜帶融合蛋白基因的重組腺病毒及其制備方法和應(yīng)用<130>095767<160>18<170>patentinversion3.3<210>1<211>1812<212>dna<213>人工序列<220><221>cds<222>(1)..(1812)<400>1gtgagtgcaaaccgcagtgacccagtcaccctggatgtcctctatggg48valseralaasnargseraspprovalthrleuaspvalleutyrgly151015ccggacacccccatcatttcccccccagactcgtcttacctttcggga96proaspthrproileileserproproaspsersertyrleusergly202530gcgaacctcaacctctcctgccactcggcctctaacccatccccgcag144alaasnleuasnleusercyshisseralaserasnproserprogln354045tattcttggcgtatcaatgggataccgcagcaacacacacaagttctc192tyrsertrpargileasnglyileproglnglnhisthrglnvalleu505560tttatcgccaaaatcacgccaaataataacgggacctatgcctgtttt240pheilealalysilethrproasnasnasnglythrtyralacysphe65707580gtctctaacttggctactggccgcaataattccatagtcgtcgacgcg288valserasnleualathrglyargasnasnserilevalvalaspala859095gccatcggagttcacctgggctgcacctcagcatgtgaggccgtctat336alaileglyvalhisleuglycysthrseralacysglualavaltyr100105110aaggatggccgggctggtgtggttgcaaatgatgccggtgaccgagtt384lysaspglyargalaglyvalvalalaasnaspalaglyaspargval115120125actccagctgttgttgcttactcagaaaatgaagagattgttggattg432thrproalavalvalalatyrsergluasnglugluilevalglyleu130135140gcagcaaaacaaagtagaataagaaatatttcaaatacagtaatgaaa480alaalalysglnserargileargasnileserasnthrvalmetlys145150155160gtaaagcagatcctgggcagaagctccagtgatccacaagctcagaaa528vallysglnileleuglyargserserseraspproglnalaglnlys165170175tacatcgcggaaagtaaatgtttagtcattgaaaaaaatgggaaatta576tyrilealagluserlyscysleuvalileglulysasnglylysleu180185190cgatatgaaatagatactggagaagaaacaaaatttgttaacccagaa624argtyrgluileaspthrglyglugluthrlysphevalasnproglu195200205gatgttgccagactgatatttagtaaaatgaaagaaacggcacattct672aspvalalaargleuilepheserlysmetlysgluthralahisser210215220gtattgggctcagatgcaaatgatgtagttattactgtcccgtttgat720valleuglyseraspalaasnaspvalvalilethrvalpropheasp225230235240tttggagaaaagcaaaaaaatgctcttggagaagcagctagagctgct768pheglyglulysglnlysasnalaleuglyglualaalaargalaala245250255ggatttaatgttttgcgattaattcacgaaccgtctgcagctcttctt816glypheasnvalleuargleuilehisgluproseralaalaleuleu260265270gcttatggaattggacaagactcccctactggaaaaagcaatattttg864alatyrglyileglyglnaspserprothrglylysserasnileleu275280285gtgtttaagcttggaggaacatccttatctctcagcgtcatggaagtt912valphelysleuglyglythrserleuserleuservalmetgluval290295300aacagtggaatatatcgggttctttcaacaaacactgatgataacatc960asnserglyiletyrargvalleuserthrasnthraspaspasnile305310315320ggtggtgcacatttcacagaaaccttagcacagtatctagcttctgag1008glyglyalahisphethrgluthrleualaglntyrleualaserglu325330335ttccaaagatccttcaaacatgatgtgagaggaaatgcgcgagccatg1056pheglnargserphelyshisaspvalargglyasnalaargalamet340345350atgaaattaacgaacagtgctgaagtagcgaaacattctttgtcaacc1104metlysleuthrasnseralagluvalalalyshisserleuserthr355360365ttgggaagtgccaactgttttcttgactcattatatgaaggtcaagat1152leuglyseralaasncyspheleuaspserleutyrgluglyglnasp370375380tttgattgcaatgtgtccagagcaagatttgaacttctttgttctcca1200pheaspcysasnvalserargalaargphegluleuleucysserpro385390395400ctttttaataagtgtatagaagcaatcagaggactcttagatcaaaat1248leupheasnlyscysileglualaileargglyleuleuaspglnasn405410415ggatttacagcagatgatatcaacaaggttgtcctttgtggagggtct1296glyphethralaaspaspileasnlysvalvalleucysglyglyser420425430tctcgaatcccaaagctacagcaactgattaaagatcttttcccagct1344serargileprolysleuglnglnleuilelysaspleupheproala435440445gttgagcttctcaattctatccctcctgatgaagtgatccctattggt1392valgluleuleuasnserileproproaspgluvalileproilegly450455460gcagctatagaagcaggaattcttattgggaaagaaaacctgttggtg1440alaalaileglualaglyileleuileglylysgluasnleuleuval465470475480gaagactctcttatgatagagtgttcagccagagatattttagttaag1488gluaspserleumetileglucysseralaargaspileleuvallys485490495ggtgtggacgaatcaggagccagtagattcacagtgctgtttccatca1536glyvalaspgluserglyalaserargphethrvalleupheproser500505510gggactcctttgccagctcgaagacaacacacattgcaagcccctgga1584glythrproleuproalaargargglnhisthrleuglnalaprogly515520525agcatatcttcagtgtgccttgaactctatgagtctgatgggaagaac1632serileserservalcysleugluleutyrgluseraspglylysasn530535540tctgccaaagaggaaaccaagtttgcacaggttgtactccaggattta1680seralalysglugluthrlysphealaglnvalvalleuglnaspleu545550555560gataaaaaagaaaatggattacgtgatatattagctgttcttactatg1728asplyslysgluasnglyleuargaspileleualavalleuthrmet565570575aaaagggatggatctttacatgtgacatgcacagatcaagaaactgga1776lysargaspglyserleuhisvalthrcysthraspglngluthrgly580585590aaatgtgaagcaatctctattgagatagcatcttaa1812lyscysglualaileserilegluilealaser595600<210>2<211>603<212>prt<213>人工序列<400>2valseralaasnargseraspprovalthrleuaspvalleutyrgly151015proaspthrproileileserproproaspsersertyrleusergly202530alaasnleuasnleusercyshisseralaserasnproserprogln354045tyrsertrpargileasnglyileproglnglnhisthrglnvalleu505560pheilealalysilethrproasnasnasnglythrtyralacysphe65707580valserasnleualathrglyargasnasnserilevalvalaspala859095alaileglyvalhisleuglycysthrseralacysglualavaltyr100105110lysaspglyargalaglyvalvalalaasnaspalaglyaspargval115120125thrproalavalvalalatyrsergluasnglugluilevalglyleu130135140alaalalysglnserargileargasnileserasnthrvalmetlys145150155160vallysglnileleuglyargserserseraspproglnalaglnlys165170175tyrilealagluserlyscysleuvalileglulysasnglylysleu180185190argtyrgluileaspthrglyglugluthrlysphevalasnproglu195200205aspvalalaargleuilepheserlysmetlysgluthralahisser210215220valleuglyseraspalaasnaspvalvalilethrvalpropheasp225230235240pheglyglulysglnlysasnalaleuglyglualaalaargalaala245250255glypheasnvalleuargleuilehisgluproseralaalaleuleu260265270alatyrglyileglyglnaspserprothrglylysserasnileleu275280285valphelysleuglyglythrserleuserleuservalmetgluval290295300asnserglyiletyrargvalleuserthrasnthraspaspasnile305310315320glyglyalahisphethrgluthrleualaglntyrleualaserglu325330335pheglnargserphelyshisaspvalargglyasnalaargalamet340345350metlysleuthrasnseralagluvalalalyshisserleuserthr355360365leuglyseralaasncyspheleuaspserleutyrgluglyglnasp370375380pheaspcysasnvalserargalaargphegluleuleucysserpro385390395400leupheasnlyscysileglualaileargglyleuleuaspglnasn405410415glyphethralaaspaspileasnlysvalvalleucysglyglyser420425430serargileprolysleuglnglnleuilelysaspleupheproala435440445valgluleuleuasnserileproproaspgluvalileproilegly450455460alaalaileglualaglyileleuileglylysgluasnleuleuval465470475480gluaspserleumetileglucysseralaargaspileleuvallys485490495glyvalaspgluserglyalaserargphethrvalleupheproser500505510glythrproleuproalaargargglnhisthrleuglnalaprogly515520525serileserservalcysleugluleutyrgluseraspglylysasn530535540seralalysglugluthrlysphealaglnvalvalleuglnaspleu545550555560asplyslysgluasnglyleuargaspileleualavalleuthrmet565570575lysargaspglyserleuhisvalthrcysthraspglngluthrgly580585590lyscysglualaileserilegluilealaser595600<210>3<211>30<212>dna<213>人工序列<400>3ctcgtcgacgcggccatcggagttcacctg30<210>4<211>33<212>dna<213>人工序列<400>4ggggtaccagatgctatctcaatagagattgct33<210>5<211>31<212>dna<213>人工序列<400>5attgagctcgtgagtgcaaaccgcagtgacc31<210>6<211>30<212>dna<213>人工序列<400>6tatgtcgacgactatggaattattgcggcc30<210>7<211>33<212>dna<213>人工序列<400>7ccggtaccatggtgagtgcaaaccgcagtgacc33<210>8<211>35<212>dna<213>人工序列<400>8ccctcgagttaagatgctatctcaatagagattgc35<210>9<211>29<212>dna<213>人工序列<400>9ggaaatgcggccgcatggtgagtgcaaac29<210>10<211>30<212>dna<213>人工序列<400>10aatcggctcgagttaagatgctatctcaat30<210>11<211>31<212>dna<213>人工序列<400>11attgagctcgtgagtgcaaaccgcagtgacc31<210>12<211>30<212>dna<213>人工序列<400>12tatgtcgacgactatggaattattgcggcc30<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列<400>13cagcatgtgaggccgtcta19<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列<400>14tgctgccaatccaacaat18<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列<400>15aaatcacgccaaataataacgg22<210>16<211>19<212>dna<213>人工序列<400>16tgcagcccaggtgaactcc19<210>17<211>34<212>dna<213>人工序列<400>17ttcctctagaatggtgagtgcaaaccgcagtgac34<210>18<211>31<212>dna<213>人工序列<400>18aagtggtaccagatgctatctcaatagagat31當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12