本發(fā)明為合成生物學(xué)領(lǐng)域，涉及利用co2生物轉(zhuǎn)化法對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行修飾的方法。通過將羥基苯甲酸及衍生物脫羧酶基因和羧基還原酶基因構(gòu)建于同一株菌，利用得到的含有兩種功能酶的基因工程菌經(jīng)一步發(fā)酵轉(zhuǎn)化將co2加到酚類物質(zhì)的芳環(huán)上得相應(yīng)羧化產(chǎn)物，并進(jìn)一步將羧化產(chǎn)物還原得到相應(yīng)醛或醇。

背景技術(shù)：

各種酚類及衍生物在香精、食品、藥品、化工等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，香精中許多是低分子量的酚類物質(zhì)，如香蘭素、乙基香蘭素等。由于安全原因，生物轉(zhuǎn)化法得到的這類物質(zhì)更為消費(fèi)者所接受，目前有許多關(guān)于生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香精（如香草醛）的報(bào)道。目前這些方法多是利用酚環(huán)上含有的多碳原子碳鏈進(jìn)行生物氧化斷鏈在酚環(huán)上引入羧基，再通過生物還原手段將酚環(huán)上羧基還原為醛基。如：文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的以阿魏酸，松柏醇，芳香族氨基酸，丁香酚或異丁香酚等天然化合物為底物，通過微生物轉(zhuǎn)化法生成香草醛。但這些方法都是將原料（底物）中酚的長(zhǎng)鏈側(cè)鏈氧化斷鏈后使酚環(huán)上帶有羧基，并進(jìn)一步通過微生物還原手段將羧基還原為醛基。到目前為止，尚沒有用一株菌發(fā)酵利用co2對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行加羧后還原制備酚類物質(zhì)衍生物的報(bào)道。

利用co2合成有機(jī)物及化工和醫(yī)藥中間體或香料，不僅可以充分減少碳的排放，而且從技術(shù)上避免引入其它固體或液體原料帶來的雜質(zhì)，可以縮短合成步驟，減輕分離負(fù)擔(dān)，因此從經(jīng)濟(jì)上更加合算。但采用生物轉(zhuǎn)化法對(duì)酚類物質(zhì)加羧，需要酶的催化才能完成，根據(jù)底物酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，可采用不同選擇性的羧化酶（因部分反應(yīng)可逆，有的羧化酶也叫脫羧酶），目前有水楊酸脫羧酶，4-羥基苯甲酸脫羧酶，3,4-二羥基苯甲酸脫羧酶，2,6-二羥基苯甲酸脫羧酶等，以針對(duì)不同酚類底物進(jìn)行催化加羧，可將co2加到酚環(huán)的不同位置，制得特定位置帶羧基的不同羥基苯甲酸衍生物。

但許多產(chǎn)品需要對(duì)上述酚羧化產(chǎn)物的羧基進(jìn)行還原得到相應(yīng)醇或醛，如香草醛的生產(chǎn)。這可采用微生物發(fā)酵或還原酶對(duì)羧基進(jìn)行還原，如采用來自諾卡氏菌的還原酶（car）對(duì)羧基進(jìn)行還原從而得到。但到目前為止，尚沒有利用同一株工程菌完成在酚環(huán)上加羧和將羧基還原為相應(yīng)醇或醛的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一種利用co2生物轉(zhuǎn)化法對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行修飾的方法，其特征在于：它是采用一株基因工程菌對(duì)苯酚及其衍生物進(jìn)行羧化，同時(shí)對(duì)羧化產(chǎn)物的羧基進(jìn)行還原生成相應(yīng)的醛或醇；

其中r1,r2,r3,r4分別選自h，oh，och3，oc2h5基團(tuán)中的一種；

所述的基因工程菌指的是：羧化酶和羧基還原酶基因；

羧化酶包括：序列1對(duì)羥基苯甲酸脫羧酶基因yclbcd，序列2水楊酸脫羧酶基因sdc；

羧基還原酶包括：序列3諾卡氏菌中的羧基還原酶基因car；序列4土曲霉中的羧基還原酶基因ateg03630；磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶基因；其中磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶基因指的是：序列3枯草芽孢桿菌中的磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶的基因sfp，序列5構(gòu)巢曲霉中的磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶的基因npga。

本發(fā)明所述的seqidno序列1為來自枯草芽孢桿菌168的對(duì)酚類物質(zhì)起羧化作用的酶的基因yclbcd；seqidno序列2為來自酵母的水楊酸脫羧酶基因sdc；seqidno序列3來自諾卡氏菌和枯草芽孢桿菌的對(duì)羥基苯甲酸及其衍生物還原酶的基因和磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶的基因car-sfp；seqidno序列4來自土曲霉的羧基還原酶基因ateg03630；seqidno序列5為來自構(gòu)巢曲霉中的磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶的基因npga。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了利用co2生物轉(zhuǎn)化法對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行修飾的方法制備的典型化合物：

4-羥基苯甲醛；2-羥基苯甲醛；

2-羥基苯甲醇；4-羥基苯甲醇；

3-甲氧基-4-羥基苯甲醛；4-羥基-3-甲氧基芐醇；

3,4-二羥基苯甲醛；3,4-二羥基苯甲醇；

3-乙氧基-4-羥基苯甲醛；3-乙氧基-4-羥基苯甲醇；

6-乙氧基-3,4-二羥基-2-甲氧基苯甲醛；6-乙氧基-3,4-二羥基-2-甲氧基苯甲醇。

本發(fā)明更進(jìn)一步公開了基因工程菌的構(gòu)建方法：

（1）通過pcr技術(shù)克隆羧化酶基因?qū)αu基苯甲酸脫羧酶基因yclbcd或水楊酸脫羧酶基因sdc中的一種和還原酶基因car，npga中的一種的主功能區(qū)并與大腸桿菌bl21(de3)胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒petduet-1連接構(gòu)建相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒；

（2）將（1）中重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌bl21(de3)中得到重組基因工程菌。

其中對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行修飾的基因工程菌，基因的載體為重組質(zhì)粒為petduet–sdc-car–sfp，petduet–yclbcd-car–sfp，petduet–yclbcd-ateg03630–npga或petduet–sdc-ateg03630–npga中的一種。

本發(fā)明更進(jìn)一步公開了利用co2生物轉(zhuǎn)化法對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行修飾方法在制備酚環(huán)上加羧和將羧基還原為相應(yīng)醇或醛方面的應(yīng)用。

本發(fā)明所涉及的生物合成反應(yīng)通式如下：

其中r1,r2,r3,r4可以分別選自h，oh，och3，oc2h5基團(tuán)。

本發(fā)明公開的利用co2生物轉(zhuǎn)化法對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行修飾的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所及有的積極效果在于：

（1）本發(fā)明通過生物轉(zhuǎn)化方法利用改造好的工程株菌將co2結(jié)合到酚的芳環(huán)上得到羥基苯甲酸及衍生物，并進(jìn)一步將生成的羧基還原得到相應(yīng)醛或醇。相對(duì)于化學(xué)制備方法，生物轉(zhuǎn)化方法更為消費(fèi)者接受。

（2）本發(fā)明提供的利用co2合成有機(jī)物及化工和醫(yī)藥中間體或香料，不僅可以充分減少碳的排放，而且從技術(shù)上避免引入其它固體或液體碳源帶來的雜質(zhì)，可以縮短合成步驟，減輕分離負(fù)擔(dān)，因此從經(jīng)濟(jì)上更加合算。

附圖說明

圖1為羧化酶基因yclbcd的pcr擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2為水楊酸脫羧酶基因sdc的pcr擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3為羧酸還原酶基因car-sfp的pcr擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖1，圖2，圖3中，泳道：m表示marker；1表示pcr擴(kuò)增目的的片段；

圖4為構(gòu)建的重組表達(dá)載體petduet–yclbcd-car–sfp的過程示意圖；

圖5為重組大腸桿菌bl21(de3)的表達(dá)的酶的sds-page電泳圖；

圖6為hplc分析圖；其中a為對(duì)羥基苯甲酸標(biāo)品色譜圖；b為對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)品色譜圖；c為苯酚標(biāo)品色譜圖；

圖7為含重組質(zhì)粒的petduet-1的工程菌的發(fā)酵液色譜圖；

圖8a為含重組質(zhì)粒的petduet-yclbcd的工程菌的不含底物苯酚的發(fā)酵液色譜圖；b為含重組質(zhì)粒的petduet–yclbcd的工程菌的發(fā)酵液色譜圖；

圖9為含重組質(zhì)粒的petduet–yclbcd-car–sfp的工程菌的發(fā)酵液色譜圖；

圖10為hplc分析圖；其中d為香草酸標(biāo)品色譜圖；e為香草醛標(biāo)品色譜圖；

圖11為含重組質(zhì)粒的petduet-1的工程菌的發(fā)酵液色譜圖；

圖12為含重組質(zhì)粒的petduet–yclbcd的工程菌的發(fā)酵液色譜圖；

圖13為含重組質(zhì)粒的petduet–yclbcd-car–sfp的工程菌的發(fā)酵液色譜圖；

圖14為hplc分析圖；其中f為水楊酸標(biāo)品色譜圖；g為水楊醛標(biāo)品色譜圖；

圖15為含重組質(zhì)粒的petduet–sdc的工程菌的發(fā)酵液色譜圖；

圖16為含重組質(zhì)粒的petduet–sdc-car–sfp的工程菌的發(fā)酵液色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明所用原料及試劑均有市售，其中感受態(tài)大腸桿菌bl21(de3)、lb培養(yǎng)來源自制、質(zhì)粒petduet-1來源市售。

本發(fā)明涉及的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的反應(yīng)通式如下：

其中r1,r2,r3,r4可以分別選自h，oh，och3，oc2h5基團(tuán)；

實(shí)施例1

來自枯草芽孢桿菌的羧化酶基因yclbcd（基因序列1）,酵母菌的水楊酸脫羧酶基因sdc（基因序列2）和諾卡氏菌中羧酸還原酶基因car（基因序列3）的克隆

（1）在genbank中查閱羧酸還原酶car和磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶sfp的基因序列,car來源于諾卡氏菌nrrl5646和sfp來源于枯草芽孢桿菌，序列名稱分別為:ay495697.1和wp_015715234.1。通過生物公司合成該羧酸還原酶和磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶基因，命名為car–sfp，car–sfp基因大小為4343bp的片段（基因序列為3）。

（2）查閱yclbcd在genbank中的基因序列為:2632649,2632650,2632651三段基因，該基因來源于枯草芽孢桿菌168（b.subtilissubsp.subtilis168），通過pcr從枯草芽孢桿菌168基因組中獲得。采用pcr反應(yīng)克隆枯草芽孢桿菌168基因組中yclbcd片段，引物和反應(yīng)條件如下：

引物(f)：cccatatgcaggagtatgattgaaatgaaagc

引物(r)：ggggtaccgatcaagcctttcgttcc

反應(yīng)條件為：94℃變性2min；然后94℃變性30s，57℃復(fù)性45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后，72℃保溫10min。pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1所示，yclbcd基因大小為2764bp的片段（基因序列1）。

（3）查閱sdc在genbank中的基因序列為:dm040453.1，該基因來源于酵母，通過pcr從酵母基因組中獲得。采用pcr反應(yīng)克隆酵母基因組中sdc片段，引物和反應(yīng)條件如下：

引物(f)：cccatatgatgcgcggaaaggtttctctcg

引物(r)：ggggtaccctaagcctccgagtcgtagaa

反應(yīng)條件為：94℃變性2min；然后94℃變性30s，57℃復(fù)性45s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)后，72℃保溫10min。pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖電泳結(jié)果如圖2所示，sdc基因大小為1054bp的片段（見序列2）。

實(shí)施例2

重組表達(dá)羧化酶和羧酸還原酶基因的大腸桿菌bl21(de3)工程菌的構(gòu)建

（1）表達(dá)載體的構(gòu)建

將克隆得到的羧化酶基因yclbcd片段和sdc片段，用限制性內(nèi)切酶kpni和ndei分別對(duì)羧化酶基因yclbcd片段和sdc片段進(jìn)行雙酶切，100μl酶切體系如下：

pcr羧化酶基因產(chǎn)物40μl、10×hbuffer10μl、10×bsa10μl、kpni15μl、ndei15μl、ddh2o10μl。37℃酶切4h后，瓊脂糖凝膠電泳回收。

將表達(dá)載體petduet-1用限制性內(nèi)切酶kpni和ndei進(jìn)行雙酶切，100μl酶切體系如下：表達(dá)載體petduet-140μl、10×hbuffer10μl、10×bsa10μl、kpni15μl、ndei15μl、ddh2o10μl。37℃酶切4h后，瓊脂糖凝膠電泳回收。

將經(jīng)kpni和ndei雙酶切的yclbcd片段和sdc片段分別與petduet-1相連接，構(gòu)建表達(dá)載體petduet–yclbcd和petduet–sdc，如圖4所示。連接體系如下：表達(dá)載體petduet-1與雙酶切的目的基因片段3μl、10×t4ligasebuffer1μl、t4ligase1μl。16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α，挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到lb液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，提質(zhì)粒，即為重組表達(dá)質(zhì)粒petduet–yclbcd和petduet–sdc，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜見圖4。

將表達(dá)載體petduet–yclbcd，petduet–sdc和合成基因car–sfp分別用限制性內(nèi)切酶bamhi和psti進(jìn)行雙酶切，100μl酶切體系如下：表達(dá)載體petduet–yclbcd或petduet–sdc40μl、10×hbuffer10μl、bamhi15μl、psti15μl、ddh2o20μl。37℃酶切4h后，瓊脂糖凝膠電泳回收。

將經(jīng)bamhi和psti雙酶切的car–sfp片段（圖3）分別與petduet–yclbcd和petduet–sdc相連接，構(gòu)建表達(dá)載體petduet–yclbcd-car–sfp和petduet–sdc-car–sfp，如圖4所示。連接體系如下：表達(dá)載體petduet–yclbcd或petduet–sdc與雙酶切的目的基因片段car–sfp3μl、10×t4ligasebuffer1μl、t4ligase1μl。16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α，挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到lb液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，提質(zhì)粒，即為重組表達(dá)質(zhì)粒petduet–yclbcd-car–sfp和petduet–sdc-car–sfp，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜見圖4。

（2）轉(zhuǎn)化與篩選

取重組表達(dá)質(zhì)粒petduet–yclbcd-car–sfp和petduet–sdc-car–sfp各2μl，通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，涂布到含amp的固體lb平板上。挑取在平板上生長(zhǎng)出的幾個(gè)菌落，然后通過菌落pcr驗(yàn)證是否轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒，通過pcr后在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)產(chǎn)生目的基因條帶的菌落即為大腸桿菌bl21(de3)工程菌株。

（3）發(fā)酵驗(yàn)證

取過夜培養(yǎng)的重組petduet–yclbcd-car–sfp基因工程菌接種到50mllb培養(yǎng)基中，在37℃，200r/min^-1下培養(yǎng)，當(dāng)菌液od600達(dá)到0.6-0.8時(shí)加入異丙基硫代半乳糖苷（iptg）,使終濃度為0.1mm，在37℃，200r/min^-1下培養(yǎng)4-4.5h。取培養(yǎng)物100ul于ep管，5000g×5min離心，棄上清，菌體加入40ul上樣緩沖液，100℃水浴3min，待冷卻后10000g×10min離心，小心吸取上清，轉(zhuǎn)入另一標(biāo)記好的ep管，分離膠濃度12%；濃縮膠5%；上樣量：15ul。將上清液進(jìn)行sds-page電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示。

實(shí)施例3

co2生物轉(zhuǎn)化法對(duì)苯酚進(jìn)行加羧后還原制備對(duì)羥基苯甲醇

（1）將取過夜培養(yǎng)的實(shí)施例2得到的重組petduet–yclbcd-car–sfp基因工程菌接種到50mllb培養(yǎng)基中，在37℃，200r/min^-1下培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度od600達(dá)到0.6-0.8時(shí)加入異丙基硫代半乳糖苷（iptg）,使終濃度為0.1mm，在37℃，200r/min^-1下培養(yǎng)4-4.5h。然后加入15mmol/l的苯酚和100mmol/l的碳酸氫鈉。培養(yǎng)12h后離心并過濾獲得發(fā)酵液。

反應(yīng)式如下：

（2）發(fā)酵產(chǎn)物的hplc分析

采用安捷倫液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：kromstarc18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱,流動(dòng)相甲醇(a)-0.1%醋酸水溶液(b),線性梯度洗脫0～25min,10%a-23%a,流速1.0ml·min^-1,檢測(cè)波長(zhǎng)254nm,柱溫35℃,進(jìn)樣量20μl。其hplc分析圖見圖6-9，對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯甲醇的保留時(shí)間分別為12.23min和20.10min。

實(shí)施例4

co2生物轉(zhuǎn)化方法利用愈創(chuàng)木酚制備香草素（香草醛）

（1）香草素生成過程反應(yīng)式如下：

（2）將取過夜培養(yǎng)的實(shí)施例2得到的重組petduet–yclbcd-car–sfp基因工程菌接種到50mllb培養(yǎng)基中，在37℃，200r/min^-1下培養(yǎng)，當(dāng)菌液od600達(dá)到0.6-0.8時(shí)加入異丙基硫代半乳糖苷（iptg）,使終濃度為0.1mm，在37℃，200r/min^-1下培養(yǎng)4-4.5h。然后加入15mmol/l的愈創(chuàng)木酚和100mmol/l的碳酸氫鈉。培養(yǎng)12h后離心獲得發(fā)酵液進(jìn)行hplc分析。

（3）產(chǎn)物hplc分析

采用安捷倫液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：kromstarc18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱,流動(dòng)相甲醇(a)-0.1%醋酸水溶液(b),線性梯度洗脫0～8min,23%a-25%a,8～23min,25%a-70%a,流速1.0ml·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)254nm,柱溫35℃,進(jìn)樣量20μl。其hplc分析圖見圖10-13，香草酸和香草醛的出峰時(shí)間分別為14.6min和16.9min。

實(shí)施例5

co2生物轉(zhuǎn)化法利用苯酚制備水楊醛

（1）通過pcr技術(shù)克隆羧化酶基因和還原酶基因的主功能區(qū)并與大腸桿bl21(de3)胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒petduet-sdc連接，將重組表達(dá)載體petduet–sdc-car–sfp轉(zhuǎn)至大腸桿菌bl21(de3)中得到重組基因工程菌，取過夜培養(yǎng)的重組petduet–sdc-car–sfp基因工程菌接種到50mllb培養(yǎng)基中，在37℃，200r/min^-1下培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度od600達(dá)到0.6-0.8時(shí)加入異丙基硫代半乳糖苷（iptg）,使終濃度為0.1mm，在37℃，200r/min^-1下培養(yǎng)4-4.5h。然后加入15mmol/l的苯酚和100mmol/l的碳酸氫鈉。培養(yǎng)12h后離心并過濾獲得發(fā)酵液。

反應(yīng)式如下：

（2）對(duì)產(chǎn)物hplc分析

采用安捷倫液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：kromstarc18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱,流動(dòng)相甲醇(a)-0.1%醋酸水溶液(b),線性梯度洗脫0～8min,23%a-25%a,8～23min,25%a-70%a,流速1.0ml·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)254nm,柱溫35℃,進(jìn)樣量20μl。其hplc分析圖見圖14-16，水楊酸和水楊醛的出峰時(shí)間分別為13.5min和24.2min。

本發(fā)明所述的基因序列為：

序列1為來自枯草芽孢桿菌168的對(duì)酚類物質(zhì)起羧化作用的酶的基因yclbcd：ttgaaccaaaatgaaagcagaattcaagcgtaaaggagggggcaaagtgaaactcgttgtcggaatgacaggggcaacaggggccattttcggggtcaggctgctgcagtggctgaaggccgccggagtggaaacccatctcgttgtgtctccttgggcaaacgtcacgatcaaacacgaaacaggctatacgttacaagaagtagaacaactggccacatacacttactcacataaggatcaggcggcagccatttcaagcgggtcgtttgataccgatggaatgattgttgcgccgtgcagcatgaaatctctcgcaagcattcgcacaggaatggcggataatctgctgacacgtgcggcggatgtcatgctcaaggagagaaaaaaactcgtcctcttaacgagagagacgcctttgaaccaaattcatctcgaaaatatgctagcgcttacgaaaatgggcaccatcattcttcctccgatgccggcattttataatcggccgagaagcttagaggaaatggttgaccatattgtttttagaacgttggaccaattcggcattcggcttcctgaagcgaagcgctggaatgggattgaaaaacaaaaaggaggagcttgatcatggcttatcaagatttcagagaatttctcgctgcccttgaaaaagaaggacagctgcttacagtgaatgaagaggtaaagccggaaccggatttaggggcctccgcacgggcagccagcaatcttggcgataaaagccctgcgctcttatttaacaacatttacggctatcataacgcgcgaattgcgatgaatgtcatcggctcttggccaaaccatgccatgatgctgggcatgccgaaagacacaccggtaaaagaacagttttttgaattcgcaaagcgttatgaccagtttccgatgccggtcaaacgtgaggaaacagcgccatttcatgaaaatgaaatcacagaagatatcaatttgttcgatatactgcctcttttcagaattaaccagggtgatggaggctactatttagacaaagcatgtgtcatttcccgtgatcttgaggaccctgacaacttcggcaaacaaaatgtcggcatttacagaatgcaagtcaaaggaaaagaccgccttggcattcagcctgtcccgcagcacgatattgcaatccatctgcgccaagctgaagaacgcggcatcaaccttccggtcactattgcgctcggctgtgagccggtcattacaacggcggcatcgactccgcttctctatgatcaatcagaatacgaaatggcaggtgcgattcaaggcgaaccatatcgcatcgtcaaatcaaagctgtctgatcttgatgttccgtggggcgctgaagtggtgcttgaaggtgagattattgccggagagcgcgaatatgaagggccgttcggtgaattcacaggccattattccggcggacgcagcatgccgattatcaaaattaaacgcgtctatcacagaaacaatccgatctttgaacatttatacttaggcatgccttggacagaatgcgattacatgatcggcattaacacatgcgtgccgctttatcagcagttaaaagaagcgtatccgaacgaaattgtggcagtgaacgccatgtacacacacggtttaatcgcgattgtttccacaaaaacccgctatggcggatttgcgaaagcggtcggcatgcgcgcactcacaacgccgcacggactcggctactgcaaaatggtcatagtcgttgatgaggatgtcgatccattcaaccttccgcaggtcatgtgggcgctttcgaccaaaatgcatccgaaacatgatgcggtcatcattccggacttatctgtcctgccgcttgatccgggatccaatccatcaggaatcactcacaaaatgattctcgacgccactacaccggttgcgccggaaacaagaggccattattcacagccgcttgattctccgctaacaacgaaagaatgggaacaaaaactaatggacttaatgaataaataaggaaaggatgttcgaaatgcatacatgtcctcgatgcgactcaaaaaagggagaagtcatgagcaaatcgcctgtagaaggcgcatgggaagtttatcagtgccaaacatgcttttttacatggagatcctgtgaaccggaaagcattacaaatcccgaaaaatacaatccagcgtttaaaattgatccaaaggaaacagaaacagcaattgaagttccggcggtgccggaaccgaaaggcttgatccgcgtgaactgtatgtcagaccgtctctttgagctgcttgacgggagctgcctgaatgagaagcagcatgaggccttcgttctgcaaacagtatcagaggatggctggccgcatgccgctatgatcagtgcaggtgaaatcatcgcgctgagccgaactgatatccgaatcgctctgtggaaaaacacaatgacttcggccaacatccttcgcacaggaaaagcacagttcacggcgtggtggaagggagcggcctattatgtaaagcttgaatgcgcgcctttaccgcctttgaaagatgccgaatatgaaagagaccgtttttcctgccgcatcgtttcagtgaaagaggacgttgcgaaatacgctgatttgacttcaggtgtccgtatacagcttcacagccctgaagaggtgctgagcagatggaaaaagaccctggaagatttaaaacggtaatatcgata

序列2為來自酵母的水楊酸脫羧酶基因sdc

atgcgcggaaaggtttctctcgaggaggcgttcgagcttcccaagttcgctgcccagaccaaggagaaggccgagctctacatcgcccccaacaaccgcgaccggtactttgaggagattctcaacccgtgcggcaaccgtctcgagctttcgaacaagcacggtatcggctacaccatctactctatctactcgcctggtccgcagggatggaccgagcgcgccgagtgtgaggagtacgcgcgcgagtgcaacgactacatctcgggcgagattgccaatcacaaggaccggatgggtgcctttgccgctctgtcgatgcacgaccccaagcaggcgtccgaggagcttacccgctgcgttaaagagctcggtttcctcggcgcgctcgtcaacgacgtgcagcacgccggacccgaaggcgagacccacatcttctacgaccagcccgagtgggacatcttctggcagacttgcgtcgatctcgacgttccattctacctccaccccgagcctcccttcggctcgtacctccgcaaccagtacgagggacgcaagtaccttattggtcctcccgtgtcttttgccaacggcgtctcgctccacgtcctcggcatgatcgtcaacggtgtctttgaccgcttccccaagctcaaggtcatcctcggccaccttggcgagcacattcccggagacttctggcgcatcgagcactggttcgagcactgctcccgccctctcgccaagtcgcgcggagacgtcttcgctgagaagcccctcctccactacttccgcaacaacatctggctcaccacctcgggcaacttctccaccgagactctcaagttctgcgtcgagcacgtcggcgccgagcgcatcctcttctccgtcgactcgccttacgagcacatcgacgtcggatgcggatggtacgacgacaacgccaaggctatcatggaggccgttggcggtgagaaggcctacaaggacattggccgtgacaacgccaagaagctcttcaagctcggcaagttctacgactcggaggcttag

序列3來自諾卡氏菌和枯草芽孢桿菌的對(duì)羥基苯甲酸及其衍生物還原酶的基因和磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶的基因car-sfp

agccaggatccgaattcgatggctgtggactcgccggatgaacgcctgcaacgccgtatcgcccaactgtttgccgaagatgaacaagtgaaagctgcccgcccgctggaagcagttagcgcggccgtctctgcaccgggtatgcgtctggctcagatcgcagctacggtgatggctggttatgcggatcgtccggcggcgggccagcgtgctttcgaactgaataccgatgacgcaaccggccgtaccagcctgcgtctgctgccgcgttttgaaaccattacgtaccgcgaactgtggcagcgtgtcggcgaagtggcagctgcgtggcatcacgacccggaaaacccgctgcgtgcgggtgattttgtggccctgctgggcttcaccagcattgattatgcaacgctggatctggctgacatccatctgggtgcggttaccgtgccgctgcaagcgagcgcggcggtgtcccaactgattgcaatcctgaccgaaacgagtccgcgcctgctggcgtccaccccggaacatctggatgctgcggtggaatgcctgctggcaggcaccacgccggaacgtctggtggttttcgattatcacccggaagatgacgatcagcgcgccgcatttgaaagtgcgcgtcgccgtctggcagatgcaggttccctggtgatcgttgaaaccctggacgcggtgcgtgcgcgtggccgtgatctgccggctgcgccgctgtttgtcccggataccgacgatgacccgctggcgctgctgatttatacgtcaggttcgaccggcacgccgaaaggtgccatgtacaccaatcgtctggccgcaacgatgtggcagggcaactcaatgctgcaaggcaacagccaacgcgttggcattaacctgaattatatgccgatgagtcatattgcgggtcgtatctccctgttcggcgtgctggcgcgtggcggcaccgcatactttgctgcgaaatcagacatgagcaccctgtttgaagatattggcctggttcgcccgaccgaaatctttttcgttccgcgtgtctgtgacatggtgtttcagcgctatcaaagcgaactggatcgccgttctgtcgctggtgcggatctggacaccctggaccgcgaagtgaaagcggatctgcgtcagaattacctgggcggtcgcttcctggttgcagtcgtgggctcggctccgctggccgcagaaatgaaaacgtttatggaaagcgtgctggacctgccgctgcatgatggttatggcagtaccgaagccggcgcatccgttctgctggataaccagatccaacgtccgccggtcctggactataaactggtcgatgtgccggaactgggttactttcgcacggatcgtccgcacccgcgtggcgaactgctgctgaaagcagaaaccacgattccgggttattacaaacgcccggaagttacggcggaaatctttgatgaagacggcttctataaaaccggcgatattgtggccgaactggaacatgaccgcctggtttacgtggatcgtcgtaacaatgttctgaaactgtcccagggcgaatttgtgaccgttgcgcacctggaagctgtgttcgcgagcagcccgctgatccgtcaaatttttatctatggtagttccgaacgcagttacctgctggccgtcattgtgccgaccgatgacgcactgcgtggccgcgataccgctacgctgaaaagcgctctggcggaatctattcagcgtatcgccaaagacgcaaatctgcaaccgtatgaaattccgcgcgattttctgatcgaaaccgaaccgttcacgattgccaatggcctgctgagcggtatcgcaaaactgctgcgcccgaacctgaaagaacgttatggtgcgcagctggaacaaatgtacaccgacctggctacgggccaggcagatgaactgctggccctgcgccgtgaagctgcggatctgccggtgctggaaaccgttagccgtgccgcaaaagcgatgctgggtgtggcaagcgcggatatgcgtccggacgcacattttaccgatctgggcggtgacagcctgtctgcactgagtttttccaacctgctgcacgaaatcttcggtgttgaagtcccggtgggtgttgtcgtgtctccggcaaacgaactgcgtgatctggcgaattatattgaagccgaacgcaacagtggcgcaaaacgtccgaccttcacgtcagtgcatggcggtggctcggaaattcgtgctgcggatctgaccctggacaaatttatcgatgcacgcacgctggccgcagctgattctattccgcacgccccggtgccggcacagaccgttctgctgacgggtgcgaatggctatctgggtcgtttcctgtgcctggaatggctggaacgcctggataaaaccggcggcaccctgatttgtgttgtccgtggtagcgacgcggcggcggcacgtaaacgtctggattcagcctttgatagcggcgatccgggcctgctggaacattatcagcaactggcagcacgtaccctggaagtgctggcaggcgatattggtgacccgaacctgggcctggatgacgcgacctggcagcgtctggcagaaacggtcgatctgattgtgcatccggcagctctggtgaatcacgttctgccgtacacccagctgtttggcccgaacgtggttggcaccgcggaaattgtgcgcctggctatcaccgcgcgtcgtaaaccagtgacctatctgtctacggttggcgtcgcagatcaggttgacccggctgaataccaagaagatagcgatgtgcgtgaaatgtctgcggtgcgtgtcgtgcgcgaaagctatgccaacggttacggcaattctaaatgggctggtgaagtgctgctgcgcgaagcgcatgatctgtgcggtctgccggtggcagtttttcgttcagatatgattctggcacactcgcgctatgctggtcagctgaatgtccaagatgtgttcacccgtctgattctgtcactggttgctacgggcatcgcgccgtattcgttttaccgcaccgatgcagacggtaaccgtcagcgcgcccattacgatggtctgccggcagatttcaccgcggcggcgattacggcgctgggtatccaggccaccgaaggctttcgcacgtatgatgtgctgaatccgtatgatgacggtattagtctggacgaatttgttgattggctggtcgaatccggccatccgattcagcgtatcacggattattcagactggtttcaccgcttcgaaaccgccatccgtgcactgccggaaaaacagcgtcaagccagcgtgctgccgctgctggatgcataccgtaacccgtgtccggccgttcgcggtgcaattctgccggctaaagaatttcaggctgcggtccaaaccgcgaaaattggcccggaacaggatattccgcacctgagtgccccgctgattgataaatacgtgtctgacctggaactgctgcaactgctgggtagtggctctggactggtgggtgccctgatgcacgtgatgcagaagcgcagccgcgccatccactcctccgacgaaggggaggaccaggctggcgatgaagatgaagattgagagctctaataaaaggagatataccatgaaaatctatggcatttacatggatcgtccgctgagtcaggaagaaaagaacgctttatgaccttcatcagcccggaaaaacgtgaaaaatgccgtcgcttttatcataaagaagatgcacaccgcacgctgctgggcgatgtgctggttcgtagcgtgatctctcgccagtatcagctggataaatctgatattcgtttcagtacccaggaatacggtaaaccgtgtattccggatctgccggatgcacattttaatatcagccactctggccgctgggttattggtgcgttcgattctcagccgattggtatcgatattgaaaaaacgaaaccgatcagtctggaaattgccaaacgtttctttagcaaaaccgaatattctgatctgctggcaaaagataaagatgaacagacggattacttttaccatctgtggagtatgaaagaatcttttatcaaacaggaaggcaaaggtctgagcctgccgctggatagttttagcgtgcgcctgcatcaggatggccaggtttctatcgaactgccggattctcacagtccgtgctatattaaaacctacgaagttgatccgggctataaaatggccgtttgtgcggcccacccggatttcccggaagatattacgatggtgagctacgaagaactgctgtaa

序列4來自土曲霉的羧基還原酶基因ateg03630

atgtcgcccatcgccatcgatacagcgcctttccagagggccagggtcaacttgctgcatcccgaggacccgaaagcagtcaaaagtattgtccagcttcttcagttcaacgccgagcacaatccagaccatgtgttttgtctccagcttccttcgaaacaagacgacgccatcggcaatccaataaggatcacgcatctgcaattctatcgcgctgtctcctactgcacccagcggctgcaggaagaaatagacggtcttcacggtccaagagtcaacgaggacggaacagtgaccaaatgcagccccgtggtacttttcatggaaagcaacgtcggactcctgattcacctcttggccttgatgagtctaggcgtgcccgtggccgtcctctctgctcgcctcagtccaacggctgtccaacacctcatgtcgagtatcagggcacaatcggttattgcatcgccccggctgaaaggtacaattgaggaggcaatcgcatctgataacaacaccccggcaattggagtgaggatgtatacacaacgaccgttcgaagacgatctcgagaatagtcgaacactggaccttcctgctacgaacgaggaaagccatttcatcagcgagaatgatcgaaatgtattgatcctccactcttcgggaacaaccggactccccaaaccgatatatcaaccgcatagatatctcctcaactactccgagtgccatgagctggggccagacgacgcgctcggaactgtactctctgctctaccgttatttcacgtaggtccaggcgcaggaacaaacgcacgcaagacactgactgatgtaacagggattcgggttggtcgcaccatgtctcgccatgacagttgggaagccctttatgctgcctccctccaacaccatacccaccggctcgttgatcatcgaattgatccagtcttttcagcccacggcgctgatgacggttccccacattctcgaggaaatcaccacactaccccccgagcaaagtatcagtgctttgcagcccttggaatttgttctttgtggtggagggccactcaagatttctgtcgccgaggcattggccgccagcggtgtcaatctactcgctcattttggcacgaccgagaccggccctctaggcgtcgtttttgttccgaccccagactacgactggcactactggaagcttcgtcaagacatcaactaccggctcgatgaggtggacgccaactccgccgatggaaatcagtacaaactcactgttcatccatttggctgggactcagctttcgagatccaggacatcctcctcagtcgcggtgcagagtataagcatcatcttcgcgccgtgggacgcaaagatgatttgattgtgctcgcgaacggagagaagcttgttccgcgggttctggagactctccttatgcaagacgagcgggtcaagtccgccgtagcattcggagaaggcaagttcgaaattggtgtaatcgtcgaacctacacacaaagttagcgatgaggaggattttaaagcagctttgtgggccatcgtcttggaagctggagcgcagatggattctcatgcgcaggtatccagcccgtccagcattatacttgcgacacccgaaaagcctgttcccaggtccgataagggctcgattctcaggagagagacataccgtgtctatgacgaggagatatcaagggtctacgaagtactagacagagcttctgaagagacgaccgcattgaatctccagtctgatagccttgaggaggacttgaaggatctcatccagcgcgagataggctggaagatttccccttcagaatggcttcaagatagcgacctgtttgaactcggtatgaattctctgcaggcaatccgcctgcatcgacttctactttcttccttacctgtggattcgagagagcgggttggggccgatttcgtctatagaagtccatctgtgtccaagcttggggcgtctctacggcatctggctgcaaacgagaacggacataggaatgaccccgagactgagattgatgagctgatttgtctaaactcctttattgcccgacaggatgccacagttctcttgactggtagcacaggcaatctcgggtcgaatctgttggctcatctcaccaccttacccagagtcaagaaggttatctgcctcaatcgacgaggctctgacacctcgacggcgcataccgacctcgttgaacgacaactagccatcgccaaaagcaaaggagttgtgattgacccggaatcagcttcgaaaattgaagtcatcccatgcgatcccagcgccgacttcttcgggcttcctgccgaggtatacacgcacctaacagcacaaacaacacacattcttcacaatgcgtggccaatggattttaaacgcaacgtggcctccttccaatctcaatttcaataccttaacaatctcctccgtgtcgcccatgacacccgtctctgtcgaccgtccatcaagccacgattcttgtttgtctcttcgatcgcggttgtgggacagtatccacgtacccatgggacccggctcattcctgaagtcccctctgataaatccagcatcattgaagactttggatacgggaaggccaagtatgtatgcgaagagattatgcgcgccgcagcagacaggtatccggagatgcagttgggaattgtacgcgtgggacagatgtcgggatcgtccaggacgggttactggaaccccaaggaacattttccaaccctgatcaagtttgcaagcatggttggtcaactgccagctattaaacaggtacgtatttatttttcaattactgagccgagaaaaggttaacgatatagactctctcctggatcgctgttgacaatgcggctactgtgctgagcgatattctgtttgcgccatcgctaagcggcatatatcacctggaaaacccaatccgccaggcatggcaggatgtccttgatatatttgcttcctccctttatataaacacggtgaacgtgccatttgaccagtggctgcgcaatgtacaggcggcagtgcaggagctaggaaccgaggatgagcggatggaatacgacttgttggccgagttcctcgagaaggacttccagcggatggcgactggtaaagtcatcctggatacgagtagatcgagagccgtatccgaaaccctgagggaagtgggtgagatatcggaagaggtggtgtggaagtacgtgagagaatggaggagagccggaacactgagggcaccactagaatga

序列5為來自構(gòu)巢曲霉中的磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶的基因npga

atggtgcaagacacatcaagcgcaagcacttcgccaattttaacaagatggtacatcgacacccgccctctaaccgcctcaacagcagcccttcctctccttgaaaccctccagcccgctgatcaaatctccgtccaaaaatactaccatctgaaggataaacacatgtctctcgcctctaatctgctcaaatacctcttcgtccaccgaaactgtcgcatcccctggtcttcaatcgtgatctctcgaaccccagatccgcacagacgaccatgctatattccaccctcaggctcacaggaagacagcttcaaagacggatataccggcatcaacgttgagttcaacgtcagccaccaagcctcaatggtcgcgatcgcgggaacagcttttactcccaatagtggtggggacagcaaactcaaacccgaagtcggaattgatattacgtgcgtaaacgagcggcagggacggaacggggaagagcggagcctggaatcgctacgtcaatatattgatatattctcggaagtgttttccactgcagagatggccaatataaggaggttagatggagtctcatcatcctcactgtctgctgatcgtcttgtggactacgggtacagactcttctacacttactgggcgctcaaagaggcgtatataaaaatgactggggaggccctcttagcaccgtggttacgggaactggaattcagtaatgtcgtcgccccggccgctgttgcggagagtggggattcggctggggatttcggggagccgtatacgggtgtcaggacgactttatataaaaatctcgttgaggatgtgaggattgaagttgctgctctgggcggtgattacctatttgcaacggctgcgaggggtggtgggattggagctagttctagaccaggaggtggtccagacggaagtggcatccgaagccaggatccctggaggcctttcaagaagttagatatagagcgagatatccagccctgtgcgactggggtgtgtaattgcctatcctaa。

sequencelisting

<110>天津科技大學(xué)

<120>利用二氧化碳生物轉(zhuǎn)化方法對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行修飾的方法及應(yīng)用

<130>1

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2763

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttgaaccaaaatgaaagcagaattcaagcgtaaaggagggggcaaagtgaaactcgttgt60

cggaatgacaggggcaacaggggccattttcggggtcaggctgctgcagtggctgaaggc120

cgccggagtggaaacccatctcgttgtgtctccttgggcaaacgtcacgatcaaacacga180

aacaggctatacgttacaagaagtagaacaactggccacatacacttactcacataagga240

tcaggcggcagccatttcaagcgggtcgtttgataccgatggaatgattgttgcgccgtg300

cagcatgaaatctctcgcaagcattcgcacaggaatggcggataatctgctgacacgtgc360

ggcggatgtcatgctcaaggagagaaaaaaactcgtcctcttaacgagagagacgccttt420

gaaccaaattcatctcgaaaatatgctagcgcttacgaaaatgggcaccatcattcttcc480

tccgatgccggcattttataatcggccgagaagcttagaggaaatggttgaccatattgt540

ttttagaacgttggaccaattcggcattcggcttcctgaagcgaagcgctggaatgggat600

tgaaaaacaaaaaggaggagcttgatcatggcttatcaagatttcagagaatttctcgct660

gcccttgaaaaagaaggacagctgcttacagtgaatgaagaggtaaagccggaaccggat720

ttaggggcctccgcacgggcagccagcaatcttggcgataaaagccctgcgctcttattt780

aacaacatttacggctatcataacgcgcgaattgcgatgaatgtcatcggctcttggcca840

aaccatgccatgatgctgggcatgccgaaagacacaccggtaaaagaacagttttttgaa900

ttcgcaaagcgttatgaccagtttccgatgccggtcaaacgtgaggaaacagcgccattt960

catgaaaatgaaatcacagaagatatcaatttgttcgatatactgcctcttttcagaatt1020

aaccagggtgatggaggctactatttagacaaagcatgtgtcatttcccgtgatcttgag1080

gaccctgacaacttcggcaaacaaaatgtcggcatttacagaatgcaagtcaaaggaaaa1140

gaccgccttggcattcagcctgtcccgcagcacgatattgcaatccatctgcgccaagct1200

gaagaacgcggcatcaaccttccggtcactattgcgctcggctgtgagccggtcattaca1260

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caaggcgaaccatatcgcatcgtcaaatcaaagctgtctgatcttgatgttccgtggggc1380

gctgaagtggtgcttgaaggtgagattattgccggagagcgcgaatatgaagggccgttc1440

ggtgaattcacaggccattattccggcggacgcagcatgccgattatcaaaattaaacgc1500

gtctatcacagaaacaatccgatctttgaacatttatacttaggcatgccttggacagaa1560

tgcgattacatgatcggcattaacacatgcgtgccgctttatcagcagttaaaagaagcg1620

tatccgaacgaaattgtggcagtgaacgccatgtacacacacggtttaatcgcgattgtt1680

tccacaaaaacccgctatggcggatttgcgaaagcggtcggcatgcgcgcactcacaacg1740

ccgcacggactcggctactgcaaaatggtcatagtcgttgatgaggatgtcgatccattc1800

aaccttccgcaggtcatgtgggcgctttcgaccaaaatgcatccgaaacatgatgcggtc1860

atcattccggacttatctgtcctgccgcttgatccgggatccaatccatcaggaatcact1920

cacaaaatgattctcgacgccactacaccggttgcgccggaaacaagaggccattattca1980

cagccgcttgattctccgctaacaacgaaagaatgggaacaaaaactaatggacttaatg2040

aataaataaggaaaggatgttcgaaatgcatacatgtcctcgatgcgactcaaaaaaggg2100

agaagtcatgagcaaatcgcctgtagaaggcgcatgggaagtttatcagtgccaaacatg2160

cttttttacatggagatcctgtgaaccggaaagcattacaaatcccgaaaaatacaatcc2220

agcgtttaaaattgatccaaaggaaacagaaacagcaattgaagttccggcggtgccgga2280

accgaaaggcttgatccgcgtgaactgtatgtcagaccgtctctttgagctgcttgacgg2340

gagctgcctgaatgagaagcagcatgaggccttcgttctgcaaacagtatcagaggatgg2400

ctggccgcatgccgctatgatcagtgcaggtgaaatcatcgcgctgagccgaactgatat2460

ccgaatcgctctgtggaaaaacacaatgacttcggccaacatccttcgcacaggaaaagc2520

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accgcctttgaaagatgccgaatatgaaagagaccgtttttcctgccgcatcgtttcagt2640

gaaagaggacgttgcgaaatacgctgatttgacttcaggtgtccgtatacagcttcacag2700

ccctgaagaggtgctgagcagatggaaaaagaccctggaagatttaaaacggtaatatcg2760

ata2763

<210>2

<211>1053

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atgcgcggaaaggtttctctcgaggaggcgttcgagcttcccaagttcgctgcccagacc60

aaggagaaggccgagctctacatcgcccccaacaaccgcgaccggtactttgaggagatt120

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gcgcgcgagtgcaacgactacatctcgggcgagattgccaatcacaaggaccggatgggt300

gcctttgccgctctgtcgatgcacgaccccaagcaggcgtccgaggagcttacccgctgc360

gttaaagagctcggtttcctcggcgcgctcgtcaacgacgtgcagcacgccggacccgaa420

ggcgagacccacatcttctacgaccagcccgagtgggacatcttctggcagacttgcgtc480

gatctcgacgttccattctacctccaccccgagcctcccttcggctcgtacctccgcaac540

cagtacgagggacgcaagtaccttattggtcctcccgtgtcttttgccaacggcgtctcg600

ctccacgtcctcggcatgatcgtcaacggtgtctttgaccgcttccccaagctcaaggtc660

atcctcggccaccttggcgagcacattcccggagacttctggcgcatcgagcactggttc720

gagcactgctcccgccctctcgccaagtcgcgcggagacgtcttcgctgagaagcccctc780

ctccactacttccgcaacaacatctggctcaccacctcgggcaacttctccaccgagact840

ctcaagttctgcgtcgagcacgtcggcgccgagcgcatcctcttctccgtcgactcgcct900

tacgagcacatcgacgtcggatgcggatggtacgacgacaacgccaaggctatcatggag960

gccgttggcggtgagaaggcctacaaggacattggccgtgacaacgccaagaagctcttc1020

aagctcggcaagttctacgactcggaggcttag1053

<210>3

<211>4353

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

agccaggatccgaattcgatggctgtggactcgccggatgaacgcctgcaacgccgtatc60

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