本發(fā)明涉及分子生物學
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于檢測人brca易感基因snp的探針、引物及試劑盒。
背景技術(shù)：
：女性乳腺是由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成的，乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。乳腺癌中99%發(fā)生在女性，男性僅占1%。乳腺并不是維持人體生命活動的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌細胞喪失了正常細胞的特性，細胞之間連接松散，容易脫落。癌細胞一旦脫落，游離的癌細胞可以隨血液或淋巴液播散全身，形成轉(zhuǎn)移，危及生命。目前乳腺癌已成為威脅女性身心健康的常見腫瘤。全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀70年代末開始一直呈上升趨勢。美國8名婦女一生中就會有1人患乳腺癌。中國不是乳腺癌的高發(fā)國家，但不宜樂觀，近年我國乳腺癌發(fā)病率的增長速度卻高出高發(fā)國家1～2個百分點。據(jù)國家癌癥中心和衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局2012年公布的2009年乳腺癌發(fā)病數(shù)據(jù)顯示：全國腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第1位，女性乳腺癌發(fā)病率（粗率）全國合計為42.55/10萬，城市為51.91/10萬，農(nóng)村為23.12/10萬。乳腺癌已成為當前社會的重大公共衛(wèi)生問題。自20世紀90年代全球乳腺癌死亡率呈現(xiàn)出下降趨勢；究其原因，一是乳腺癌篩查工作的開展，使早期病例的比例增加；二是乳腺癌綜合治療的開展，提高了療效。乳腺癌已成為療效最佳的實體腫瘤之一。乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷，是提高療效的關(guān)鍵。應(yīng)結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)及病史、體格檢查、影像學檢查、組織病理學和細胞病理學檢查（在有條件的醫(yī)院），進行乳腺癌的診斷與鑒別診斷。2009年6月30號，衛(wèi)生部、全國婦聯(lián)關(guān)于印發(fā)《農(nóng)村婦女“兩癌”檢查項目管理方案》的通知。1990年，研究者發(fā)現(xiàn)了一種直接與遺傳性乳腺癌有關(guān)的基因，命名為乳腺癌1號基因，英文簡稱brca1。1994年，又發(fā)現(xiàn)另外一種與乳腺癌有關(guān)的基因，稱為brca2。1990年，抑制基因，它位于人體細胞核的第17號染色體上。1994年，研究者們在第13號染色體上又發(fā)現(xiàn)另外一種與乳腺癌有關(guān)的基因，稱為brca2。在此之后,很多情況下人們把兩種基因統(tǒng)稱brca1/2一起討論。實際上，brca1/2是兩種具有抑制惡性腫瘤發(fā)生的優(yōu)良基因（稱為“抑癌基因”），損傷修復(fù)、細胞的正常生長方面有重要作用。如果brca1/2基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生了某些改變（稱為“突變”），那么它所具有的抑制腫瘤發(fā)生的功能就會受影響。已發(fā)現(xiàn)的brca1/2的突變有數(shù)百種之多，除了與遺傳性乳腺癌和卵巢癌有關(guān)。有人總結(jié)了brca1和brca2基因突變相關(guān)的癌癥的終身風險，顯示有brca1基因突變者，患乳腺癌和卵巢癌的風險分別是50%-85%和15%-45%，有brca2基因突變者，患乳腺癌和卵巢癌的風險分別是50%-85%和10%-20%。與普通婦女相比，的確是很高的患癌幾率。兩種基因的突變屬于“常染色體顯性遺傳”（也就是說不是某一性別特有），但并不是所有突變攜帶者都會發(fā)展成癌癥，只是攜帶有這種突變的人有很高的癌癥易感性。美國的一份資料顯示，在3億多美國人中約250,000-500,000名攜帶有該突變，在德系猶太人,冰島人，法裔加拿大人中比例高，而亞裔中比例較低。這也是為什么北歐、美國等國家乳腺癌的發(fā)生率高于亞洲國家的原因。brca1基因定位于17q21，約81kb,內(nèi)含高達41.5%的alu重復(fù)序列和4.8%的其它重復(fù)序列。含有23個外顯子。brca1編碼蛋白的n末端序列含有一環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(ringdomain)，能夠與brca1相關(guān)環(huán)狀蛋白(brca12associatedringdomainprotein,bard1)組成環(huán)2環(huán)異二聚體。如果brca1/2基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生了某些改變，那么它所具有的抑制腫瘤發(fā)生的功能就會受影響。2013年已發(fā)現(xiàn)的brca1/2的突變有數(shù)百種之多。有人總結(jié)了brca1和brca2基因突變相關(guān)的癌癥的終身風險，顯示有brca1基因突變者，患乳腺癌和卵巢癌的風險分別是50%～85%和15%～45%，有brca2基因突變者，患乳腺癌和卵巢癌的風險分別是50%～85%和10%～20%。研究表明，brca的始祖突變(185delag、5382insc、6174delt)即rs386833395位點、rs397507246位點、rs80359550位點，會導(dǎo)致乳腺癌患病風險大幅提高。目前檢測brca突變的方法還是dna直接測序法，然而直接測序法靈敏度低，只有20-30%，檢測步驟繁瑣，效率低下，至少需要2-3天時間才能出結(jié)果；并且如果樣本基因組dna含量稀少時，直接測序法會導(dǎo)致大量的漏檢和假陰性。所以特別要一種高靈敏度和高特異性的檢測方法來實現(xiàn)基因突變的檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供用于檢測人brca易感基因snp的探針。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供用于檢測人brca易感基因snp的引物。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供用于檢測人brca易感基因snp的試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：在本發(fā)明的一方面，提供一種用于檢測人brca易感基因snp的探針，該探針是針對brca1基因的rs386833395位點設(shè)計的，其序列為：rs386833395w:fam+agaaaatcttagagtgtcccatct+mgb，如seqidno.3所示或其互補鏈；和rs386833395del:vic+aaatcttagtgtcccatctggt+mgb,如seqidno.4所示或其互補鏈；提供一種用于檢測人brca易感基因snp的探針，該探針是針對brca1基因的rs397507246位點設(shè)計的，其序列為：rs397507246w:fam+aagagaatcccaggacagaa+mgb，如seqidno.7所示或其互補鏈；和rs397507246ins:vic+agagaatccccaggacaga+mgb,如seqidno.8所示或其互補鏈；提供一種用于檢測人brca易感基因snp的探針，該探針是針對brca2基因的rs80359550位點設(shè)計的，其序列為：rs80359550w:fam+agcacagcaagtggaaaatc+mgb，如seqidno.11所示或其互補鏈；和rs80359550del:vic+acagcaagggaaaatctgt+mgb,如seqidno.12所示或其互補鏈；在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測人brca易感基因snp的引物，該引物是針對brca1基因的rs386833395位點設(shè)計的，其序列為：rs386833395f:ttctaatgtgttaaagttcattggaac，如seqidno.1所示；rs386833395r:gataatcataggaatcccaaattaatac，如seqidno.2所示；提供一種用于檢測人brca易感基因snp的引物，該引物是針對brca1基因的rs397507246位點設(shè)計的，其序列為：rs397507246f:ggttgtgtttggtttctttcagc，如seqidno.5所示；rs397507246r:gtggggtgagatttttgtcaact，如seqidno.6所示；提供一種用于檢測人brca易感基因snp的引物，該引物是針對brca2基因的rs80359550位點設(shè)計的，其序列為：rs80359550f:tagtttggaaacttcagatatatgtaaatg，如seqidno.9所示；rs80359550r:tctatttcagaaaacacttgtcttgc，如seqidno.10所示；本發(fā)明用于檢測人brca易感基因snp的pcr引物和探針設(shè)計方法，具體為：在基因高度同源和保守的區(qū)域設(shè)計正反向pcr通用引物，在突變位置設(shè)計相應(yīng)的熒光探針。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測人brca易感基因snp的pcr擴增試劑盒，其包括dntp、mg2+、taqdna聚合酶、tris-hcl體系、特異性引物、野生型探針、突變型探針，所述特異性引物為如上所述的rs386833395f、rs386833395r引物對，所述野生型探針、突變型探針為如上所述的rs386833395w、rs386833395del探針。此外，本發(fā)明提供另一種用于檢測人brca易感基因snp的pcr擴增試劑盒，其包括dntp、mg2+、taqdna聚合酶、tris-hcl體系、特異性引物、野生型探針、突變型探針，所述特異性引物為如上所述的rs397507246f、rs397507246r引物對，所述野生型探針、突變型探針為如上所述的rs397507246w、rs397507246ins探針。此外，本發(fā)明提供另一種用于檢測人brca易感基因snp的pcr擴增試劑盒，其包括dntp、mg2+、taqdna聚合酶、tris-hcl體系、特異性引物、野生型探針、突變型探針，所述特異性引物為如上所述的rs80359550f、rs80359550r引物對，所述野生型探針、突變型探針為如上所述的rs80359550w、rs80359550del探針。本發(fā)明采用taqman-mgb檢測的原理參見圖1，在基因高度同源和保守區(qū)設(shè)計正反向pcr通用引物，在突變位置設(shè)計相應(yīng)的探針，野生型探針在野生型模板時，可以完全雜交（即圖1中的左邊的擴增），可以檢測到熒光信號，而在突變型模板時，無法雜交充分(即圖1中的右邊的不雜交)，檢測不到熒光信號。在本發(fā)明的另一方面，提供上述探針在篩選乳腺癌易感人群的試劑盒中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一方面，提供上述引物在篩選乳腺癌易感人群的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明可與現(xiàn)行用于科研、臨床檢測的其它技術(shù)聯(lián)合使用，這些技術(shù)包括：第一代測序、第二代測序、第三代測序、基因芯片、pcr-elisa、pcr-反向分子雜交、pcr-基因芯片分析；本發(fā)明適用于人類相關(guān)癌基因的檢測，癌基因包括但不限于brca1基因185delag、5382insc密碼子突變,brca2基因6174delt密碼子的突變。、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：（1）本發(fā)明建立了實時熒光pcr體系，可同時檢測brca基因3種突變形式；（2）檢測靈敏度高，100-500拷貝的突變可以檢出；（3）可直接采用從拭子、新鮮和冷凍的全血、血漿和體液等來源的人基因組dna，操作簡單，檢測廉價，臨床應(yīng)用范圍廣；（4）檢測速度快，檢測過程只需要80分鐘即可完成，與直接測序法相比，本發(fā)明可以在80分鐘內(nèi)完成檢測，實驗結(jié)果一致率100%，但實驗時間至少節(jié)省了2-3天；（5）檢測特異性強，經(jīng)實驗驗證，用本發(fā)明的引物和探針獲得的brca突變位點與直接測序法獲得的突變位點一致，檢測特異性強。在今后乳腺癌易感基因篩查、預(yù)防中有廣泛的應(yīng)用前景。附圖說明圖1是本發(fā)明中taqman的技術(shù)原理示意圖。圖2是本發(fā)明實施例1中擴增曲線示意圖。圖3是本發(fā)明實施例2中擴增曲線示意圖。圖4是本發(fā)明實施例3中擴增曲線示意圖。圖5是本發(fā)明實施例4中擴增曲線示意圖（50-400拷貝）。圖6是本發(fā)明實施例5中擴增曲線示意圖具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例11、以基因工程重組質(zhì)粒檢測本發(fā)明，以185delag突變型為檢測對象。經(jīng)基因工程構(gòu)建的帶有brca突變基因的質(zhì)粒作為檢測對象，質(zhì)粒pbrcam為帶有185delag、5382insc和6174delt三個突變的質(zhì)粒；質(zhì)粒pbrcaw為帶有野生型brca1和brca2基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒溶解在te緩沖液（10mmtris-hcl，1mmedta，ph=8.0）中，經(jīng)紫外分光光度計測定質(zhì)量和濃度，計算質(zhì)?？截悢?shù)，用te緩沖液梯度稀釋獲得10000、1000、100、10拷貝/ul的pbrcam和pbrcaw質(zhì)粒溶液，然后作為pcr反應(yīng)模板。2、brca特異性引物和探針的合成：根據(jù)人brca1基因外顯子2突變位點(rs386833395)，設(shè)計2條探針，5’端標記fam(綠色熒光)或vic(黃色熒光),3’端標記mgb淬滅基團，由上海閃晶分子生物科技有限公司合成和標記。探針序列及標記如下：rs386833395w:fam+agaaaatcttagagtgtcccatct+mgb，如seqidno.3所示；和rs386833395del:vic+aaatcttagtgtcccatctggt+mgb,如seqidno.4所示；pcr引物用primer5程序設(shè)計，rs386833395位點序列引物如下：rs386833395f:ttctaatgtgttaaagttcattggaac，如seqidno.1所示；rs386833395r:gataatcataggaatcccaaattaatac，如seqidno.2所示；上述引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。3、熒光pcr反應(yīng)：以基因工程重組質(zhì)粒檢測本發(fā)明，以185delag突變型為檢測對象。經(jīng)基因工程構(gòu)建的帶有brca突變基因的質(zhì)粒作為檢測對象，質(zhì)粒pbrcam為帶有185delag、5382insc和6174delt三個突變的質(zhì)粒；質(zhì)粒pbrcaw為帶有野生型brca1和brca2基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒溶解在te緩沖液（10mmtris-hcl，1mmedta，ph=8.0）中，經(jīng)紫外分光光度計測定質(zhì)量和濃度，計算質(zhì)?？截悢?shù)，用te緩沖液梯度稀釋獲得10000、1000、100、10拷貝/ul的pbrcam和pbrcaw質(zhì)粒溶液，然后作為pcr模板進行擴增反應(yīng)，使用2×goldernstartaqmastermix(購自康為世紀，含0.05u/μltaq酶、0.5mmdntp、pcr緩沖液（含mg2+及10%甘油)及上述引物、探針配制20μlpcr反應(yīng)體系，每個模板共計2個反應(yīng)，注意各個反應(yīng)所取dna模板量必須一樣，反應(yīng)體系具體如下：pbrcam模板第一個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs386833395f(25pmol/ul)10.5umrs386833395r(25pmol/ul)10.5umrs386833395w(25pmol/ul)0.50.25umpbrcam(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-pbrcam模板第二個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs386833395f(25pmol/ul)10.5umrs386833395r(25pmol/ul)10.5umrs386833395del(25pmol/ul)0.50.25umpbrcam(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-pbrcaw模板第一個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs386833395f(25pmol/ul)10.5umrs386833395r(25pmol/ul)10.5umrs386833395w(25pmol/ul)0.50.25umpbrcaw(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-pbrcaw模板第二個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs386833395f(25pmol/ul)10.5umrs386833395r(25pmol/ul)10.5umrs386833395del(25pmol/ul)0.50.25umpbrcaw(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-使用abi7500系列熒光定量pcr儀進行反應(yīng)，具體的反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃,5min;(94℃,20s;55℃,30s;72℃,1min)x40;在72度設(shè)置fam/vic熒光信號檢測。檢測結(jié)果分析：確認未選擇校正熒光參照，對擴增曲線進行分析。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值、end值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，start值可以在3～15、end值可設(shè)在5～20），threshold值（rn）選擇為擴增曲線升起的拐點處（即剛進入對數(shù)增長期），點擊analyze進行分析，然后到plate窗口下記錄每個反應(yīng)的ct值，根據(jù)判斷標準進行結(jié)果判定。每個模板有2個反應(yīng)，即有2個ct值，ct值<35的為陽性，35<ct<40為臨界值（灰區(qū)），無ct值的為陰性。如果ct值落在灰區(qū)，需要重新再做一次實驗，以便再次確認。本次實驗中，pbrcam模板第一個反應(yīng),用rs386833395w探針時，ct=0;pbrcam模板第二個反應(yīng)用rs386833395del探針時，ct=32，檢測結(jié)果說明這個模板為rs386833395突變型陽性，這與我們的實際模板pbrcam模板相符；pbrcaw模板第一個反應(yīng),用rs386833395w探針時，ct=32.2;pbrcaw模板第二個反應(yīng)用rs386833395del探針時，ct=0，檢測結(jié)果說明這個模板為rs386833395野生型陽性，這與我們的實際模板pbrcaw模板相符；結(jié)果如下，如圖2所示：用pbrcam模板時：　ct值rs386833395w0rs386833395del32用pbrcaw模板時：　ct值rs386833395w32.2rs386833395del0實施例21、以基因工程重組質(zhì)粒檢測本發(fā)明，以5382insc突變型為檢測對象。經(jīng)基因工程構(gòu)建的帶有brca突變基因的質(zhì)粒作為檢測對象，質(zhì)粒pbrcam為帶有185delag、5382insc和6174delt三個突變的質(zhì)粒；質(zhì)粒pbrcaw為帶有野生型brca1和brca2基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒溶解在te緩沖液（10mmtris-hcl，1mmedta，ph=8.0）中，經(jīng)紫外分光光度計測定質(zhì)量和濃度，計算質(zhì)?？截悢?shù)，用te緩沖液梯度稀釋獲得10000、1000、100、10拷貝/ul的pbrcam和pbrcaw質(zhì)粒溶液，然后作為pcr反應(yīng)模板。2、brca特異性引物和探針的合成：根據(jù)人brca1基因外顯子20突變位點(rs397507246)，設(shè)計2條探針，5’端標記fam(綠色熒光)或vic(黃色熒光),3’端標記mgb淬滅基團，由上海閃晶分子生物科技有限公司合成和標記。探針序列及標記如下：rs397507246w:fam+aagagaatcccaggacagaa+mgb，如seqidno.7所示；和rs397507246ins:vic+agagaatccccaggacaga+mgb,如seqidno.8所示；pcr引物用primer5程序設(shè)計，rs397507246位點序列引物如下：rs397507246位點序列引物如下：rs397507246f:ggttgtgtttggtttctttcagc，如seqidno.5所示；rs397507246r:gtggggtgagatttttgtcaact，如seqidno.6所示；上述引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。3、熒光pcr反應(yīng)：以基因工程重組質(zhì)粒檢測本發(fā)明，以5382insc突變型為檢測對象。經(jīng)基因工程構(gòu)建的帶有brca突變基因的質(zhì)粒作為檢測對象，質(zhì)粒pbrcam為帶有185delag、5382insc和6174delt三個突變的質(zhì)粒；質(zhì)粒pbrcaw為帶有野生型brca1和brca2基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒溶解在te緩沖液（10mmtris-hcl，1mmedta，ph=8.0）中，經(jīng)紫外分光光度計測定質(zhì)量和濃度，計算質(zhì)粒拷貝數(shù)，用te緩沖液梯度稀釋獲得10000、1000、100、10拷貝/ul的pbrcam和pbrcaw質(zhì)粒溶液，然后作為pcr模板進行擴增反應(yīng)，使用2×goldernstartaqmastermix(購自康為世紀，含0.05u/μltaq酶、0.5mmdntp、pcr緩沖液（含mg2+及10%甘油)及上述引物、探針配制20μlpcr反應(yīng)體系，每個模板共計2個反應(yīng)，注意各個反應(yīng)所取dna模板量必須一樣，反應(yīng)體系具體如下：pbrcam模板第一個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs397507246f(25pmol/ul)10.5umrs397507246r(25pmol/ul)10.5umrs397507246w(25pmol/ul)0.50.25umpbrcam(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-pbrcam模板第二個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs397507246f(25pmol/ul)10.5umrs397507246r(25pmol/ul)10.5umrs397507246ins(25pmol/ul)0.50.25umpbrcam(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-pbrcaw模板第一個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs397507246f(25pmol/ul)10.5umrs397507246r(25pmol/ul)10.5umrs397507246w(25pmol/ul)0.50.25umpbrcaw(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-pbrcaw模板第二個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs397507246f(25pmol/ul)10.5umrs397507246r(25pmol/ul)10.5umrs397507246ins(25pmol/ul)0.50.25umpbrcaw(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-使用abi7500系列熒光定量pcr儀進行反應(yīng)，具體的反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃,5min;(94℃,20s;55℃,30s;72℃,1min)x40;在72度設(shè)置fam/vic熒光信號檢測。檢測結(jié)果分析：確認未選擇校正熒光參照，對擴增曲線進行分析。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值、end值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，start值可以在3～15、end值可設(shè)在5～20），threshold值（rn）選擇為擴增曲線升起的拐點處（即剛進入對數(shù)增長期），點擊analyze進行分析，然后到plate窗口下記錄每個反應(yīng)的ct值，根據(jù)判斷標準進行結(jié)果判定。每個模板有2個反應(yīng)，即有2個ct值，ct值<35的為陽性，35<ct<40為臨界值（灰區(qū)），無ct值的為陰性。如果ct值落在灰區(qū)，需要重新再做一次實驗，以便再次確認。本次實驗中，pbrcam模板第一個反應(yīng),用rs397507246w探針時，ct=0;pbrcam模板第二個反應(yīng)用rs397507246ins探針時，ct=31.23，檢測結(jié)果說明這個模板為rs397507246突變型陽性，這與我們的實際模板pbrcam模板相符；pbrcaw模板第一個反應(yīng),用rs397507246w探針時，ct=32.14;pbrcaw模板第二個反應(yīng)用rs397507246ins探針時，ct=0，檢測結(jié)果說明這個模板為rs397507246野生型陽性，這與我們的實際模板pbrcaw模板相符；結(jié)果如下，如圖3所示：用pbrcam模板時：　ct值rs397507246w0rs397507246ins31.23用pbrcaw模板時：　ct值rs397507246w32.14rs397507246ins0實施例31、以基因工程重組質(zhì)粒檢測本發(fā)明，以6174delt突變型為檢測對象。經(jīng)基因工程構(gòu)建的帶有brca突變基因的質(zhì)粒作為檢測對象，質(zhì)粒pbrcam為帶有185delag、5382insc和6174delt三個突變的質(zhì)粒；質(zhì)粒pbrcaw為帶有野生型brca1和brca2基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒溶解在te緩沖液（10mmtris-hcl，1mmedta，ph=8.0）中，經(jīng)紫外分光光度計測定質(zhì)量和濃度，計算質(zhì)?？截悢?shù)，用te緩沖液梯度稀釋獲得10000、1000、100、10拷貝/ul的pbrcam和pbrcaw質(zhì)粒溶液，然后作為pcr反應(yīng)模板。2、brca特異性引物和探針的合成：根據(jù)人brca2基因外顯子11突變位點(rs80359550)，設(shè)計2條探針，5’端標記fam(綠色熒光)或vic(黃色熒光),3’端標記mgb淬滅基團，由上海閃晶分子生物科技有限公司合成和標記。探針序列及標記如下：rs80359550w:fam+agcacagcaagtggaaaatc+mgb，如seqidno.11所示；和rs80359550del:vic+acagcaagggaaaatctgt+mgb,如seqidno.12所示；pcr引物用primer5程序設(shè)計，rs80359550位點序列引物如下：rs80359550位點序列引物如下：rs80359550f:tagtttggaaacttcagatatatgtaaatg，如seqidno.9所示；rs80359550r:tctatttcagaaaacacttgtcttgc，如seqidno.10所示；上述引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。3、熒光pcr反應(yīng)：以基因工程重組質(zhì)粒檢測本發(fā)明，以6174delt突變型為檢測對象。經(jīng)基因工程構(gòu)建的帶有brca突變基因的質(zhì)粒作為檢測對象，質(zhì)粒pbrcam為帶有185delag、5382insc和6174delt三個突變的質(zhì)粒；質(zhì)粒pbrcaw為帶有野生型brca1和brca2基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒溶解在te緩沖液（10mmtris-hcl，1mmedta，ph=8.0）中，經(jīng)紫外分光光度計測定質(zhì)量和濃度，計算質(zhì)?？截悢?shù)，用te緩沖液梯度稀釋獲得10000、1000、100、10拷貝/ul的pbrcam和pbrcaw質(zhì)粒溶液，然后作為pcr模板進行擴增反應(yīng)，使用2×goldernstartaqmastermix(購自康為世紀，含0.05u/μltaq酶、0.5mmdntp、pcr緩沖液（含mg2+及10%甘油)及上述引物、探針配制20μlpcr反應(yīng)體系，每個模板共計2個反應(yīng)，注意各個反應(yīng)所取dna模板量必須一樣，反應(yīng)體系具體如下：pbrcam模板第一個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs397507246f(25pmol/ul)10.5umrs397507246r(25pmol/ul)10.5umrs80359550w(25pmol/ul)0.50.25umpbrcam(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-pbrcam模板第二個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs397507246f(25pmol/ul)10.5umrs397507246r(25pmol/ul)10.5umrs80359550del(25pmol/ul)0.50.25umpbrcam(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-pbrcaw模板第一個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs397507246f(25pmol/ul)10.5umrs397507246r(25pmol/ul)10.5umrs80359550w(25pmol/ul)0.50.25umpbrcaw(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-pbrcaw模板第二個反應(yīng)的反應(yīng)體系：組份體積(ul)最終濃度2×goldernstartaqmastermix251xrs397507246f(25pmol/ul)10.5umrs397507246r(25pmol/ul)10.5umrs80359550del(25pmol/ul)0.50.25umpbrcaw(100copies/ul)24copies/ulddh2o(ul)20.5-totalvolume(ul)50-使用abi7500系列熒光定量pcr儀進行反應(yīng)，具體的反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃,5min;(94℃,20s;55℃,30s;72℃,1min)x40;在72度設(shè)置fam/vic熒光信號檢測。檢測結(jié)果分析：確認未選擇校正熒光參照，對擴增曲線進行分析。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值、end值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，start值可以在3～15、end值可設(shè)在5～20），threshold值（rn）選擇為擴增曲線升起的拐點處（即剛進入對數(shù)增長期），點擊analyze進行分析，然后到plate窗口下記錄每個反應(yīng)的ct值，根據(jù)判斷標準進行結(jié)果判定。每個模板有2個反應(yīng)，即有2個ct值，ct值<35的為陽性，35<ct<40為臨界值（灰區(qū)），無ct值的為陰性。如果ct值落在灰區(qū)，需要重新再做一次實驗，以便再次確認。本次實驗中，pbrcam模板第一個反應(yīng),用rs80359550w探針時，ct=0;pbrcam模板第二個反應(yīng)用rs80359550del探針時，ct=32.34，檢測結(jié)果說明這個模板為rs80359550突變型陽性，這與我們的實際模板pbrcam模板相符；pbrcaw模板第一個反應(yīng),用rs80359550w探針時，ct=32.17;pbrcaw模板第二個反應(yīng)用rs80359550del探針時，ct=0，檢測結(jié)果說明這個模板為rs80359550野生型陽性，這與我們的實際模板pbrcaw模板相符；結(jié)果如下，如圖4所示：用pbrcam模板時：　ct值rs80359550w0rs80359550del32.34用pbrcaw模板時：　ct值rs80359550w32.17rs80359550del0實施例4：1、以基因工程重組質(zhì)粒檢測本發(fā)明的靈敏度，經(jīng)基因工程構(gòu)建的帶有brca突變基因的質(zhì)粒作為檢測對象，質(zhì)粒pbrcam為帶有185delag、5382insc和6174delt三個突變的質(zhì)粒；質(zhì)粒pbrcaw為帶有野生型brca1和brca2基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒溶解在te緩沖液（10mmtris-hcl，1mmedta，ph=8.0）中，經(jīng)紫外分光光度計測定質(zhì)量和濃度，計算質(zhì)粒拷貝數(shù)，用te緩沖液稀釋獲得100拷貝/ul的pbrcam和pbrcaw質(zhì)粒溶液，然后作為pcr反應(yīng)模板。2、brca特異性引物和探針的合成：根據(jù)人brca1基因外顯子2和外顯子20突變位點，設(shè)計4條探針，5’端標記fam(綠色熒光)或vic(黃色熒光),3’端標記mgb淬滅基團；根據(jù)人brca2基因外顯子11，設(shè)計2條探針，5’端標記fam(綠色熒光)或vic(黃色熒光),3’端標記mgb淬滅基團；根據(jù)由上海閃晶分子生物科技有限公司合成和標記。探針序列及標記如下：rs386833395w:fam+agaaaatcttagagtgtcccatct+mgb，如seqidno.3所示；和rs386833395del:vic+aaatcttagtgtcccatctggt+mgb,如seqidno.4所示；rs397507246w:fam+aagagaatcccaggacagaa+mgb，如seqidno.7所示；和rs397507246ins:vic+agagaatccccaggacaga+mgb,如seqidno.8所示；rs80359550w:fam+agcacagcaagtggaaaatc+mgb，如seqidno.11所示；和rs80359550del:vic+acagcaagggaaaatctgt+mgb,如seqidno.12所示；pcr引物用primer5程序設(shè)計，引物如下：rs386833395f:ttctaatgtgttaaagttcattggaac，如seqidno.1所示；rs386833395r:gataatcataggaatcccaaattaatac，如seqidno.2所示；rs397507246f:ggttgtgtttggtttctttcagc，如seqidno.5所示；rs397507246r:gtggggtgagatttttgtcaact，如seqidno.6所示；rs80359550f:tagtttggaaacttcagatatatgtaaatg，如seqidno.9所示；rs80359550r:tctatttcagaaaacacttgtcttgc，如seqidno.10所示；上述引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。3、熒光pcr反應(yīng)：以上述稀釋好的100拷貝/ul的pbrcam和pbrcaw質(zhì)粒為模板，分別取0.5ul,1ul,2ul,4ul做反應(yīng)，以檢測本試劑盒的靈敏度。反應(yīng)體系如上述實施例1、例2、例3，只是加入的模板和ddh2o不同。使用abi7500系列熒光定量pcr儀進行反應(yīng)，具體的反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃,5min;(94℃,20s;55℃,30s;72℃,1min)x40;在72度設(shè)置fam/vic熒光信號檢測檢測結(jié)果分析：確認未選擇校正熒光參照，對擴增曲線進行分析。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值、end值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，start值可以在3～15、end值可設(shè)在5～20），threshold值（rn）選擇為擴增曲線升起的拐點處（即剛進入對數(shù)增長期），點擊analyze進行分析，然后到plate窗口下記錄每個反應(yīng)的ct值，根據(jù)判斷標準進行結(jié)果判定。每個模板有2個反應(yīng)，即有2個ct值，ct值<35的為陽性，35<ct<40為臨界值（灰區(qū)），無ct值的為陰性。如果ct值落在灰區(qū)，需要重新再做一次實驗，以便再次確認。加入0.5ul模板的ct=0,大于0.5ul的，都有ct值，表明該試劑盒的檢測靈敏度在100-500copy間；結(jié)果如下，如圖5所示：rs386833395w探針，pbrcaw模板：　　ct值0.5ul50copy01ul100copy33.682ul200copy32.464ul400copy31.03rs386833395del探針,pbrcam模板：　　ct值0.5ul50copy01ul100copy33.722ul200copy32.354ul400copy31.24rs397507246w探針，pbrcaw模板：　　ct值0.5ul50copy01ul100copy33.292ul200copy32.154ul400copy31.43rs397507246ins探針,pbrcam模板：　　ct值0.5ul50copy01ul100copy33.332ul200copy32.284ul400copy31.54rs80359550w探針，pbrcaw模板：　　ct值0.5ul50copy01ul100copy33.682ul200copy32.394ul400copy31.67rs80359550del探針,pbrcam模板：　　ct值0.5ul50copy01ul100copy33.772ul200copy32.534ul400copy31.74實施例51、以基因工程重組質(zhì)粒檢測本發(fā)明的穩(wěn)定性，經(jīng)基因工程構(gòu)建的帶有brca突變基因的質(zhì)粒作為檢測對象，質(zhì)粒pbrcam為帶有185delag、5382insc和6174delt三個突變的質(zhì)粒；質(zhì)粒pbrcaw為帶有野生型brca1和brca2基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒溶解在te緩沖液（10mmtris-hcl，1mmedta，ph=8.0）中，經(jīng)紫外分光光度計測定質(zhì)量和濃度，計算質(zhì)粒拷貝數(shù)，用te緩沖液稀釋獲得1000拷貝/ul的pbrcam和pbrcaw質(zhì)粒溶液，然后作為pcr反應(yīng)模板。2、brca特異性引物和探針的合成：根據(jù)人brca1基因外顯子2和外顯子20突變位點，設(shè)計4條探針，5’端標記fam(綠色熒光)或vic(黃色熒光),3’端標記mgb淬滅基團；根據(jù)人brca2基因外顯子11，設(shè)計2條探針，5’端標記fam(綠色熒光)或vic(黃色熒光),3’端標記mgb淬滅基團；由上海閃晶分子生物科技有限公司合成和標記。探針序列及標記如實施例4。3、熒光pcr反應(yīng)：以上述稀釋好的1000拷貝/ul的pbrcam和pbrcaw質(zhì)粒為模板，分別取5ul做反應(yīng)，每個反應(yīng)做10個復(fù)孔，以檢測本試劑盒的重復(fù)性。反應(yīng)體系如上述實施例1、例2、例3，只是加入的模板和ddh2o不同。使用abi7500系列熒光定量pcr儀進行反應(yīng)，具體的反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃,5min;(94℃,20s;55℃,30s;72℃,1min)x40;在72度設(shè)置fam/vic熒光信號檢測檢測結(jié)果分析：確認未選擇校正熒光參照，對擴增曲線進行分析。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值、end值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，start值可以在3～15、end值可設(shè)在5～20），threshold值（rn）選擇為擴增曲線升起的拐點處（即剛進入對數(shù)增長期），點擊analyze進行分析，然后到plate窗口下記錄每個反應(yīng)的ct值，根據(jù)判斷標準進行結(jié)果判定。每個模板有2個反應(yīng)，即有2個ct值，ct值<35的為陽性，35<ct<40為臨界值（灰區(qū)），無ct值的為陰性。如果ct值落在灰區(qū)，需要重新再做一次實驗，以便再次確認。最終ct值基本一致，相差不到0.5循環(huán)，該結(jié)果表明試劑盒穩(wěn)定、重復(fù)性很好。結(jié)果如下，如圖6所示：rs386833395w探針，pbrcaw模板：5ul,5000copyct值平行128.36平行228.58平行328.41平行428.46平行528.36平行628.72平行728.32平行828.73平行928.57平行1028.42rs386833395del探針,pbrcam模板：5ul,5000copyct值平行128.37平行228.32平行328.59平行428.76平行528.78平行628.41平行728.48平行828.51平行928.35平行1028.63rs397507246w探針，pbrcaw模板：5ul,5000copyct值平行128.7平行228.58平行328.47平行428.32平行528.55平行628.59平行728.74平行828.39平行928.29平行1028.66rs397507246ins探針,pbrcam模板：5ul,5000copyct值平行128.55平行228.72平行328.31平行428.23平行528.61平行628.63平行728.43平行828.57平行928.48平行1028.23rs80359550w探針，pbrcaw模板：5ul,5000copyct值平行128.58平行228.32平行328.46平行428.69平行528.47平行628.6平行728.62平行828.47平行928.78平行1028.44rs80359550del探針,pbrcam模板：5ul,5000copyct值平行128.7平行228.35平行328.8平行428.45平行528.33平行628.51平行728.63平行828.48平行928.76平行1028.78實施例6：1、提取10例經(jīng)直接測序法診斷為乳腺癌易感基因的人樣本（從拭子、新鮮和冷凍的全血和體液等來源），經(jīng)直接測序法檢測brca基因突變情況如下：　rs386833395位點rs397507246位點rs80359550位點臨床樣品1突變型野生型野生型臨床樣品2突變型野生型野生型臨床樣品3野生型突變型突變型臨床樣品4野生型突變型野生型臨床樣品5野生型突變型突變型臨床樣品6突變型突變型野生型臨床樣品7野生型突變型野生型臨床樣品8突變型野生型突變型臨床樣品9野生型突變型突變型臨床樣品10突變型野生型野生型2、利用本發(fā)明的特異性引物和熒光探針檢測臨床樣本步驟如下：（1）基因組dna的獲得：按照qiagen血液基因組提取試劑盒使用說明提取，獲得的dna質(zhì)量經(jīng)紫外分光光度計檢測合格，然后將各樣本基因組dna濃度稀釋到30ng/ul，作為后續(xù)pcr模板。（2）實時熒光pcr反應(yīng)：參照實施例1、2、3使用abi7500系列熒光定量pcr儀進行反應(yīng)，具體的反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃,5min;(94℃,20s;55℃,30s;72℃,1min)x40;在72度設(shè)置fam/vic熒光信號檢測。檢測結(jié)果分析：確認未選擇校正熒光參照，對擴增曲線進行分析。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值、end值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，start值可以在3～15、end值可設(shè)在5～20），threshold值（rn）選擇為擴增曲線升起的拐點處（即剛進入對數(shù)增長期），點擊analyze進行分析，然后到plate窗口下記錄每個反應(yīng)的ct值，根據(jù)判斷標準進行結(jié)果判定。每個模板有2個反應(yīng)，即有2個ct值，ct值<35的為陽性，35<ct<40為臨界值（灰區(qū)），無ct值的為陰性。如果ct值落在灰區(qū)，需要重新再做一次實驗，以便再次確認。結(jié)果如下：　rs386833395wrs386833395delrs397507246wrs397507246insrs80359550wrs80359550del臨床樣品1025.3225.74026.850臨床樣品2027.4226.52025.740臨床樣品327.410023.52023.85臨床樣品425.240024.3526.750臨床樣品526.450025.74026.85臨床樣品6024.85026.5825.740臨床樣品726.350026.3425.740臨床樣品8025.3925.420024.75臨床樣品925.410027.42026.38臨床樣品10025.3925.41026.840檢測結(jié)果表明：用本發(fā)明的引物和探針獲得的brca突變位點與直接測序法獲得的突變位點一致。與直接測序法相比，本發(fā)明可以在80分鐘內(nèi)完成檢測，實驗結(jié)果一致率100%，但實驗時間至少節(jié)省了2-3天。引物探針序列列表：seqidno.1rs386833395fttctaatgtgttaaagttcattggaacseqidno.2rs386833395rgataatcataggaatcccaaattaatacseqidno.3rs386833395wfam+agaaaatcttagagtgtcccatct+mgbseqidno.4rs386833395delvic+aaatcttagtgtcccatctggt+mgbseqidno.5rs397507246fggttgtgtttggtttctttcagcseqidno.6rs397507246rgtggggtgagatttttgtcaactseqidno.7rs397507246wfam+aagagaatcccaggacagaa+mgbseqidno.8rs397507246insvic+agagaatccccaggacaga+mgbseqidno.9rs80359550ftagtttggaaacttcagatatatgtaaatgseqidno.10rs80359550rtctatttcagaaaacacttgtcttgcseqidno.11rs80359550wfam+agcacagcaagtggaaaatc+mgbseqidno.12rs80359550delvic+acagcaagggaaaatctgt+mgb當前第1頁12